3種炮制方法對雷公藤肝腎毒性的減毒作用

肖麗涓，毛澤玲，黃 枚，陳亞萍，張玉琴，南麗紅*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.浙江省桐廬縣中醫(yī)院，浙江 桐廬 311500）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，有大毒，具有活血化瘀、祛風濕等功效，臨床常用于治療慢性腎炎、類風濕關節(jié)炎等疾?。?］，目前被認為是治療自身免疫性疾病的首選中藥［2-4］。但雷公藤及其制劑的毒副作用較大，易引起肝腎損傷，大大限制了其臨床應用，故研究其減毒的方法尤為重要［5-8］。炮制是一種應用廣泛的中藥減毒方法，中藥經(jīng)過炮制后，可降低或減少其毒副作用。有文獻報道雷公藤經(jīng)過蒸制后可以減毒［9］，除此之外，還可以利用甘草與萊菔子對雷公藤進行炮制。甘草具有緩急止痛、清熱解毒、補脾益氣等功效，藥物經(jīng)甘草汁炮制后能降低毒性，緩和藥性；萊菔子性平、味辛，無毒，可下氣消食，現(xiàn)代藥理研究表明萊菔子還具有解毒作用［10-11］。故本研究采用萊菔子炮制、甘草炮制和蒸制分別對雷公藤進行炮制，觀察其對肝腎毒性的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物 50只SPF 級ICR 小鼠，體質量為（20±2）g，雌雄各半，購自于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）20120002，于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗室喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：環(huán)境安靜，自由攝食飲水，光照/暗循環(huán)12 h，溫度為20～25 ℃，適應性喂養(yǎng)7 d 后進行實驗。

1.2 實驗藥物 雷公藤產(chǎn)地為福建省三明市泰寧縣，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院楊成梓教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）。

1.3 主要試劑及儀器 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉氨酶（AST）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）及肌酐（SCR）ELISA 檢測試劑盒均購自美國R＆D Systems 公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽還原酶（GR）ELISA 檢測試劑盒均購自上海西塘生物科技有限公司；酶標儀（美國Bio-Rad 公司，型號：Model 680）；切片機（德國Leica 公司，型號：RM2125）。

2 方 法

2.1 雷公藤炮制方法 ① 萊菔子炮制品：加200 mL水浸沒10 g 萊菔子后，煎煮2 次，每次1 h，合并2 次煎液，并濃縮至100 mL，再加入切片后的雷公藤100 g，文火煮至萊菔子煎液被吸收完全，取出，干燥。② 甘草炮制品：加200 mL 水浸沒10 g 甘草后，煎煮2次，每次1 h，合并2次煎液，并濃縮至100 mL，再加入切片后的雷公藤100 g，文火煮至甘草煎液被吸收完全，取出，干燥。③ 蒸制品：將切片后的雷公藤置于蒸制容器內，蒸制4 h 后，取出，干燥。

2.2 分組及給藥 將50 只ICR 小鼠按體質量隨機分為正常組、生品組、萊菔子組、甘草組與蒸制組，每組各10 只。生品組、萊菔子組、甘草組與蒸制組均按20 mL/（kg·d）體質量分別灌胃2.4 g/mL 雷公藤生品、雷公藤萊菔子炮制品、雷公藤甘草炮制品及雷公藤蒸制品水煎液，正常組灌胃等劑量生理鹽水。1 次/d，連續(xù)14 d。

2.3 標本采集 末次給藥后，稱取小鼠體質量，按體質量10 mL/kg 腹腔注射3%烏拉坦麻醉，并摘眼球取血；脫頸椎處死后剖取肝臟及雙側腎臟，生理鹽水洗去血液與黏液，濾紙吸干多余水份后于分析天平上稱重，記錄肝臟、腎臟濕質量，并計算肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)；取左側1/2 腎和5 mm×5 mm×5 mm大小的肝大葉組織置于固定液中固定24 h，進行石蠟包埋后備用；余下肝組織和腎組織放入凍存管中，并迅速投入液氮中，后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 小鼠肝腎功能指標檢測 將全血室溫靜置1 h，在冷凍離心機中以4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，嚴格按照ELISA 檢測試劑盒說明書測定小鼠血清ALT、AST、GLB、ALB、BUN、SCR 含量。

2.4.2 小鼠肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)檢測 根據(jù)“2.3”項下記錄的小鼠體質量及肝腎組織濕質量，計算肝臟系數(shù)與腎臟系數(shù)，計算公式：

2.4.3 病理形態(tài)學觀察 將肝腎組織石蠟塊切片，并行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肝腎組織病理學變化。

2.4.4 小鼠肝腎組織脂質過氧化指標檢測 取“2.3”項下的肝腎組織標本，加生理鹽水制成10%組織勻漿，在冷凍離心機中以4 ℃，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用ELISA 法檢測肝腎組織GR、SOD、MDA 含量。

2.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進行分析。計量資料屬正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t 檢驗，方差不齊者采用Games-Howell 檢測。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 5 組小鼠肝腎功能指標比較 與正常組比較，生品組與甘草組AST 含量均顯著增多，且生品組ALT、GLB 含量均顯著增多（P＜0.05），生品組與蒸制組ALB 含量均顯著減少（P＜0.05）；與生品組比較，蒸制組、甘草組及萊菔子組AST、ALT、GLB 含量均顯著減少（P＜0.05），甘草組及萊菔子組ALB 含量顯著增多（P＜0.05）；萊菔子組、甘草組與蒸制組ALT、AST、GLB、ALB 含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 5 組小鼠肝功能指標比較（±s）

表1 5 組小鼠肝功能指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與生品組比較，2） P＜0.05。

ALB/（μg/mL）507.63±65.15 388.01±46.571）437.74±67.381）459.58±68.032）478.09±78.232）組別正 常 組生 品 組蒸 制 組甘 草 組萊菔子組n 10 10 10 10 10 ALT/（ng/mL）10.38±1.13 12.85±1.391）11.35±1.182）11.19±1.332）11.07±1.152）AST/（ng/mL）11.33±1.25 14.05±1.251）12.42±1.112）12.59±1.281）2）12.00±1.372）GLB/（μg/mL）152.02±21.08 199.60±27.621）163.19±23.172）168.85±23.812）160.26±21.212）

與正常組比較，生品組、蒸制組、甘草組以及萊菔子組SCR、BUN 含量均顯著增多（P＜0.05）；與生品組比較，蒸制組、甘草組、萊菔子組SCR、BUN含量顯著減少（P＜0.05）；萊菔子組、甘草組與蒸制組SCR、BUN 含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 5 組小鼠腎功能指標比較（±s）

表2 5 組小鼠腎功能指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與生品組比較，2） P＜0.05。

BUN/（mmol/L）3.394±0.538 5.200±1.1081）3.974±0.3431）2）3.916±0.3861）2）3.894±0.3391）2）組別正 常 組生 品 組蒸 制 組甘 草 組萊菔子組n 10 10 10 10 10 SCR/（μmol/L）16.534±2.103 22.167±3.5781）19.869±1.6581）2）20.220±1.3641）2）18.344±2.0721）2）

3.2 5 組小鼠肝臟系數(shù)與腎臟系數(shù)比較 與正常組比較，生品組肝臟系數(shù)明顯增大（P＜0.05）；與生品組比較，蒸制組、甘草組、萊菔子組肝臟系數(shù)明顯減小（P＜0.05）；與正常組比較，生品組、蒸制組、甘草組、萊菔子組的腎臟系數(shù)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；萊菔子組、甘草組與蒸制組肝臟系數(shù)與腎臟系數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 5 組小鼠肝臟系數(shù)與腎臟系數(shù)比較（±s）

表3 5 組小鼠肝臟系數(shù)與腎臟系數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與生品組比較，2） P＜0.05。

腎臟系數(shù)0.142±0.016 0.146±0.015 0.154±0.022 0.146±0.018 0.135±0.013組別正 常 組生 品 組蒸 制 組甘 草 組萊菔子組n 10 10 10 10 10肝臟系數(shù)0.402±0.062 0.480±0.0611）0.416±0.0482）0.428±0.0462）0.419±0.0362）

3.3 5 組小鼠肝腎組織病理形態(tài)變化比較 HE 染色結果顯示：生品組肝細胞出現(xiàn)明顯腫脹，甚至出現(xiàn)空泡，少量的脂肪變性；腎小管上皮細胞可見水腫，腎間質內可見大量炎癥細胞浸潤。蒸制組、甘草組與萊菔子組肝細胞及腎小管的病變均有不同程度的減輕；萊菔子組肝細胞結構較完整，無明顯空泡，腎小管內紅染物質和炎癥細胞明顯減少，管腔結構清晰，減輕作用最為明顯。見圖1 和圖2。

圖1 5 組小鼠肝組織HE 染色圖（×200）

圖2 5 組小鼠腎組織HE 染色圖（×200）

3.4 5 組小鼠肝、腎組織脂質過氧化指標比較 與正常組比較，生品組及蒸制組肝、腎組織中GR、SOD 含量均明顯降低，MDA 含量明顯增多（P＜0.05），甘草組肝組織中SOD 含量降低、MDA 含量增多，腎組織中GR 含量降低（P＜0.05）；與生品組比較，萊菔子組肝、腎組織中GR、SOD 含量均明顯增高，MDA 含量明顯減少（P＜0.05），甘草組與蒸制組肝組織中GR 含量降低（P＜0.05）。萊菔子組、甘草組與蒸制組組間比較，肝組織GR、SOD 以及腎組織GR、SOD、MDA 含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），僅萊菔子組肝組織MDA 含量較蒸制組明顯減少（P＜0.05）。見表4 和表5。

表4 5 組小鼠肝組織中脂質過氧化指標比較（±s）

表4 5 組小鼠肝組織中脂質過氧化指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與生品組比較，2） P＜0.05；與蒸制組比較，3） P＜0.05。

組別正 常 組生 品 組蒸 制 組甘 草 組萊菔子組MDA/（μmol/g）28.85±3.32 38.67±5.321）36.12±5.571）35.92±3.111）32.16±3.742）3）n 10 10 10 10 10 GR/（μmol/g）5.30±0.96 2.68±0.661）3.99±1.031）2）4.46±1.202）4.82±1.352）SOD/（ng/g）45.27±6.45 36.77±4.561）38.68±4.531）39.73±4.681）40.87±5.772）

表5 5 組小鼠腎組織中脂質過氧化指標比較（±s）

表5 5 組小鼠腎組織中脂質過氧化指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與生品組比較，2） P＜0.05。

組別正 常 組生 品 組蒸 制 組甘 草 組萊菔子組MDA/（μmol/g）48.11±4.47 57.33±6.821）55.54±6.861）52.31±6.32 51.45±6.882）n 10 10 10 10 10 GR/（μmol/g）43.37±7.61 32.05±5.161）35.90±5.041）36.68±5.031）39.35±6.532）SOD/（ng/g）393.71±43.50 345.29±25.421）359.03±29.381）364.15±39.88 378.32±35.142）

4 討 論

肝、腎損傷是雷公藤毒性中發(fā)生率較高的不良反應。本實驗結果顯示：雷公藤生品可使正常小鼠血清中的肝腎功能指標異常升高，肝臟系數(shù)增大，且病理學檢查顯示肝細胞出現(xiàn)空泡，腎小管上皮細胞出現(xiàn)輕、中度水腫，腎間質內有大量炎癥細胞浸潤，提示雷公藤生品具有明顯的肝腎毒性。炮制后的雷公藤較生品均可不同程度影響改善小鼠肝腎功能指標、肝臟系數(shù)，減輕肝細胞和腎小管的病變，其中萊菔子組小鼠肝腎功能指標含量及肝臟系數(shù)降低更多，減輕肝細胞和腎小管病變更為明顯；萊菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 種炮制品比較，肝腎功能指標、肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義，以上結果提示萊菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 種炮制方法均可降低雷公藤的肝腎毒性。

本實驗結果顯示：生品組小鼠肝腎組織中抗氧化酶GR、SOD 含量明顯低于正常組，而脂質過氧化的終產(chǎn)物MDA 含量顯著高于正常組，提示生品可產(chǎn)生肝腎組織脂質過氧化損傷。雷公藤經(jīng)萊菔子炮制、甘草炮制及蒸制后較生品可明顯提高肝腎組織中GR、SOD 含量，減少MDA 的產(chǎn)生，3 種炮制品比較，肝腎組織中抗氧化酶活性無明顯變化，萊菔子炮制品與蒸制品比較，小鼠肝組織MDA 含量明顯減少，提示萊菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 種炮制方法可減輕雷公藤對肝腎組織脂質過氧化損傷，其中萊菔子炮制方法降低肝組織脂質過氧化損傷作用較為明顯。這一作用可能與炮制后改變或破壞了有毒成分的化學結構，降低毒性成分的含量或產(chǎn)生新的活性物質有關。雷公藤炮制后化學成分的具體變化將是我們下一步深入研究的重要內容。