基于HIF-1α/VEGF通路探討續(xù)苓健骨方對(duì)去卵巢大鼠骨代謝和局部血管生成的影響

謝冰穎，李生強(qiáng)，林若慧，黃小彬，黃景文，謝麗華，葛繼榮*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

隨著我國(guó)人口老齡化日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥已成為我國(guó)面臨的重要公共健康問題，其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（post menopausal osteoporosis，PMOP）占大部分。PMOP 是一種高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，其骨吸收大于骨形成，屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松的范疇。大多數(shù)女性在絕經(jīng)后5～10 年骨量進(jìn)入快速丟失期［1］，往往伴隨著疼痛、脊柱變形等嚴(yán)重并發(fā)癥，危害中老年人的社會(huì)健康、心理健康和生活質(zhì)量，并給社會(huì)、家庭經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，因此，PMOP 的臨床防治是亟待解決的問題［2］。

《Nature》報(bào)道了成骨與成血管之間的耦聯(lián)作用［3-4］，提示了血管生成對(duì)于新骨形成及防治骨質(zhì)疏松癥的重要意義。目前研究認(rèn)為血管形成的減少促進(jìn)了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，而局部血管形成的增加則能延緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)程［5］。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是耦聯(lián)成血管成骨的重要通路之一。續(xù)苓健骨方是福建省中醫(yī)藥科學(xué)院葛繼榮研究員長(zhǎng)期從事骨質(zhì)疏松癥臨床研究并結(jié)合臨床實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血化瘀的功效，對(duì)PMOP 患者疼痛等臨床癥狀和中醫(yī)證候改善療效頗佳［6］。本研究通過建立去卵巢大鼠模型，觀察續(xù)苓健骨方對(duì)卵巢摘除（OVX）大鼠骨密度及骨微結(jié)構(gòu)、股骨遠(yuǎn)端血管生成和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的影響，以探討本方防治PMOP的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只3 月齡SPF 級(jí)的Sprague-Dawley 雌性大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量為（210±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2007-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為2007000530078。大鼠飼養(yǎng)在福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（閩）2016-0005，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：FJATCM-IAEC 2018034）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 續(xù)苓健骨方（專利號(hào)：ZL20151078 4227.4）主要是由川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、茯苓、白術(shù)、紅花等組成，方中中藥飲片購(gòu)自廈門燕來福制藥有限公司，共122 g。煎煮方法：首煎加冷水沒過中藥，浸泡30 min，武火煮沸后文火繼續(xù)煮20 min；次煎再加冷水沒過中藥，武火煮沸后再文火煮20 min。分別將兩次藥液過濾后混合，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥濃度1.5 g/mL 藥液，密封置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。補(bǔ)佳樂戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：640A）加適量生理鹽水，配制成0.0125 mg/mL 雌二醇藥液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 HIF-1α 一抗（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)：340462）；VEGFA 一抗［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：ab231260］；分化決定簇抗原31（CD31）一抗［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號(hào)ab124432］；CD31 二抗（美國(guó)Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，貨號(hào)：115-035-003）；大鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒Ⅰ型前膠原氨基端原肽（P1NP，貨號(hào)：ml038224）、Ⅰ型膠原交聯(lián)C 末端肽（S-CTX，貨號(hào)：ml915040）、雌二醇（E2，貨號(hào)：ml915040）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 分組與造模 24 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組、續(xù)苓組和雌二醇組，每組6 只。使用4%戊巴比妥鈉溶液對(duì)4 組大鼠進(jìn)行注射麻醉，假手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢附近與卵巢體積大小相近的脂肪組織，按文獻(xiàn)［7］所述方法對(duì)其余3 組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。每只大鼠術(shù)后注射青霉素鈉溶液8 萬U，連續(xù)3 d。

2.2 給藥方法 術(shù)后1 周后開始藥物灌胃干預(yù)以進(jìn)行預(yù)防性治療。根據(jù)人與大鼠臨床等效劑量系數(shù)折算法換算，續(xù)苓組按體質(zhì)量1 mL/（100 g·d）灌胃含生藥濃度1.5 g/mL 續(xù)苓健骨方藥液，雌二醇組按體質(zhì)量1 mL/（100 g·d）灌胃0.0125 mg/mL 雌二醇藥液，其余2 組給予等體積生理鹽水灌胃。4 組大鼠灌胃次數(shù)均為每天1 次，連續(xù)灌胃12 周。

2.3 取材及樣本采集 末次給藥后第2 天，4%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠取材。在大鼠腹主動(dòng)脈取全血后，離心分離血清置于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA 檢測(cè)；取左脛骨于-20 ℃保存，用于骨密度檢測(cè)；取左股骨于4%多聚甲醛固定液中固定，用于制備骨組織切片。

2.4 4 組骨密度檢測(cè)、Masson 染色及骨形態(tài)學(xué)分析 使用雙能X 線骨密度儀（美國(guó)Hologic 公司，型號(hào)：W 型）掃描測(cè)定左脛骨近端骨密度；大鼠左股骨固定48 h 后，采用10%EDTA 脫鈣液進(jìn)行常規(guī)脫鈣4 周。脫鈣結(jié)束后，切取股骨遠(yuǎn)端骨組織，常規(guī)脫水包埋切片。將65 ℃烤片后的骨組織切片先進(jìn)行二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，然后放入麗春紅染液浸染，取出沖洗后放入1%磷鉬酸溶液脫色，接著取出沖洗后放入5%固綠染液浸染，沖洗干燥后封片。使用倒置顯微鏡圖像系統(tǒng)采集圖像后選擇股骨干骺線下中央部位測(cè)量感興趣區(qū)域（AOI），并使用Image Pro Plus （IPP） 6.0 軟件自動(dòng)分析Masson 染色切片的骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）、骨小梁寬度（Tb.Wi）、骨小梁間距（Tb.Sp）。

2.5 4 組血清E2、P1NP、S-CTX 水平檢測(cè) 按照ELISA 試劑盒說明書上的實(shí)驗(yàn)步驟分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品加樣、酶標(biāo)試劑、洗滌、顯色。反應(yīng)結(jié)束后用吸收光酶標(biāo)儀檢測(cè)，記錄450 nm 處波長(zhǎng)，計(jì)算血清E2、P1NP、S-CTX 水平。

2.6 4 組CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平 采用免疫組織化學(xué)Envision TM Systems 法染色目的蛋白，通過IPP 軟件選取棕黃色或棕褐色作為蛋白陽性標(biāo)識(shí)，自動(dòng)分析統(tǒng)計(jì)免疫組化染色切片的累計(jì)光密度值、陽性表達(dá)面積，并計(jì)算出4 個(gè)視野下的平均光密度值（累計(jì)光密度值/陽性表達(dá)面積）。平均光密度值越大，免疫組化（IHC）的陽性表達(dá)越強(qiáng)，表明蛋白表達(dá)水平就越高。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組左脛骨近端骨密度比較 見表1。

表1 4 組左脛骨近端骨密度比較（±s） g/cm2

表1 4 組左脛骨近端骨密度比較（±s） g/cm2

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

骨密度0.394±0.008 0.307±0.0151）0.354±0.0131）2）0.349±0.0201）2）組別假手術(shù)組模 型 組續(xù) 苓 組雌二醇組n6 6 6 6

3.2 4組骨形態(tài)及Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp比較 Masson 染色后比較4 組骨形態(tài)：與對(duì)照組比較，模型組骨小梁較為稀疏，間距較大；與模型組比較，續(xù)苓組、雌二醇組骨小梁較緊密，間距較小。見圖1。骨形態(tài)學(xué)參數(shù)比較見表2。

圖1 4 組股骨遠(yuǎn)端矢狀面Masson 染色圖

表2 4 組Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp 比較（±s）

表2 4 組Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp 比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

Tb.Sp/μm 83.134±21.726 171.276±84.1521）69.497±33.0192）62.771±26.7752）組別假手術(shù)組模 型 組續(xù) 苓 組雌二醇組n6 6 6 6 Tb.Ar %37.460±6.816 16.525±5.1671）33.227±7.7432）28.763±5.1131）2）Tb.Wi/μm 50.612±24.282 30.692±8.913 31.001±11.121 29.114±12.592

3.3 4 組大鼠血清E2、P1NP、S-CTX 水平比較 見表3。

表3 4 組血清E2、P1NP、S-CTX 水平比較（±s）

表3 4 組血清E2、P1NP、S-CTX 水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

S-CTX/（nmol/L）8.246±0.385 9.302±0.3071）8.536±0.2512）8.767±0.971組別假手術(shù)組模 型 組續(xù) 苓 組雌二醇組n6 6 6 6 E2 /（ng/L）148.344±2.478 139.183±4.8151）146.965±4.9842）154.139±6.7632）P1NP/（pg/mL）73.437±6.189 65.295±5.8251）81.279±4.5061）2）87.590±2.0941）2）

3.4 4 組骨微結(jié)構(gòu)及CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組的股骨遠(yuǎn)端切片視野中棕黃色染色物分散、稀疏，伴有大量脂肪細(xì)胞；與模型組比較，續(xù)苓組、雌二醇組棕黃色染色物增粗，面積增大，連續(xù)性較好，伴隨脂肪細(xì)胞及空泡的減少，見圖2。4 組大鼠左股骨遠(yuǎn)端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平，見表4。

圖2 4 組CD31、HIF-1α、VEGF 免疫組化染色圖（×200）

表4 4 組左股骨遠(yuǎn)端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 4 組左股骨遠(yuǎn)端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

VEGF 0.307±0.043 0.256±0.0351）0.353±0.0421）2）0.324±0.0142）組別假手術(shù)組模 型 組續(xù) 苓 組雌二醇組n6 6 6 6 CD31 0.383±0.032 0.365±0.049 0.520±0.0751）2）0.529±0.0281）2）HIF-1α 0.290±0.034 0.204±0.0271）0.256±0.0422）0.264±0.0342）

4 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PMOP 屬于“骨痿”“骨枯”范疇，其發(fā)病病機(jī)是以腎虛為主，并與脾、肝相關(guān)［8］。絕經(jīng)后婦女腎精不足，無以滋養(yǎng)骨骼，最終引發(fā)骨痿。卵巢切除后大鼠雌激素水平降低，骨量顯著丟失，較好地模擬了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理狀況。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，續(xù)苓組骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）、骨小梁寬度（Tb.Wi）增加，骨小梁間距（Tb.Sp）縮小，表明續(xù)苓健骨方改善了OVX大鼠骨小梁形態(tài)和骨微結(jié)構(gòu)。

成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡是維持體內(nèi)骨量的重要因素。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥重要的發(fā)病機(jī)制之一［9］。雌激素水平降低會(huì)減弱對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，破骨細(xì)胞的數(shù)量增加、凋亡減少、壽命延長(zhǎng)，導(dǎo)致骨吸收功能增強(qiáng)，從而使骨形成與骨吸收的耦聯(lián)失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。P1NP 是體內(nèi)成骨細(xì)胞的活性和新骨形成的特異性敏感指標(biāo)，S-CTX 是骨吸收活性特異指標(biāo)［10］。本研究結(jié)果顯示：續(xù)苓組大鼠的血清中E2、P1NP 升高，S-CTX 顯著降低，可見續(xù)苓健骨方緩解了模型組大鼠雌激素下降的狀態(tài)，抑制骨吸收能力，同時(shí)增加骨形成能力，從而提高骨密度。

現(xiàn)代研究表明：血瘀的生物學(xué)基礎(chǔ)涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、微循環(huán)障礙等血管因素的失調(diào)［11］。CD31 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物之一，常用于檢測(cè)血管新生。伴隨雌激素水平的下降，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨內(nèi)血管數(shù)量也相應(yīng)減少［12］。HIF-1α/VEGF 是偶聯(lián)骨血管形成及骨形成的重要通路之一［13］。HIF-1α 是具有轉(zhuǎn)錄活性的重要因子，是受損傷組織中最為重要的成血管誘導(dǎo)因子［14-15］。VEGF是HIF-1α 下游主要的血管相關(guān)性靶基因，可通過誘導(dǎo)新血管生成并使其侵入?yún)⑴c骨重建的過程［16-17］。本研究結(jié)果顯示：模型組股骨遠(yuǎn)端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)降低，而續(xù)苓健骨方干預(yù)后上述指標(biāo)顯著升高，說明續(xù)苓健骨方促進(jìn)血管生成，改善微循環(huán)障礙，這可能與其對(duì)HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，續(xù)苓健骨方能上調(diào)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)OVX 大鼠股骨遠(yuǎn)端血管生成，增加骨形成；同時(shí)升高血清E2，抑制骨吸收，從而改善骨微結(jié)構(gòu)，緩解骨代謝失衡狀態(tài)，達(dá)到骨保護(hù)的目的。