蓮子心總生物堿及總生物堿高氯酸鹽對MG63細胞遷移和遷移體生成的影響

林立男，熊 梅，曾建偉，周 芬，蔡 雯，許仲坤，黃美雅，蔡良知，黃云梅，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)《福建中醫(yī)藥》雜志社，福建 福州 350122；6.福建省婦幼保健院，福建 福州 350001）

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）成熟種子中的干燥幼葉及胚根?，F(xiàn)代研究表明蓮子心中提取的總生物堿（total alkaloids of Lianzixin，TAL）活性成分對多種腫瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用［1-3］。但TAL 溶解度小，穩(wěn)定性差，將TAL 制成蓮子心總生物堿高氯酸鹽（total alkaloids of Lianzixin perchlorate，TALP）后可大大提高其溶解度和穩(wěn)定性，但其藥效是否發(fā)生變化需要實驗探討。骨肉瘤（osteosarcoma，OS）作為原發(fā)于骨組織中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移率高，治療上存在有效治療藥物少、缺少特異性靶點等問題［4］。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細胞在遷移過程中尾部會產(chǎn)生一種特殊的結(jié)構(gòu)——遷移體［5］，腫瘤細胞遷移體可通過影響巨噬細胞分化誘導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃逸［6］，抗腫瘤納米藥物可通過與遷移體結(jié)合抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［7］，提示遷移體可能成為腫瘤治療的潛在靶點。但骨肉瘤細胞中是否存在遷移體，TAL 和TALP 是否抑制其遷移和遷移體產(chǎn)生未見報道。本研究擬應(yīng)用TAL 和TALP 干預(yù)骨肉瘤MG63細胞，檢測MG63 細胞增殖和遷移情況，了解其遷移過程中是否產(chǎn)生遷移體及藥物對遷移體產(chǎn)生的影響，并探討TAL 和TALP 治療骨肉瘤的相關(guān)作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞與藥物 MG63 細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。蓮子心藥材購自福建文鑫蓮業(yè)有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓教授鑒定為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）干燥幼葉及胚根。TAL 由1 kg 蓮子心粉碎，過60 目篩，分別加70%乙醇3 L 回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏85 g，上硅膠柱，收集氯仿-三乙胺（9∶1）的洗脫液，濃縮，干燥，得TAL 粉末。取TAL 適量，加70%～72%高氯酸溶液反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷萃取，濃縮，得TALP 粉末。

1.2 實驗試劑 α-MEM 培養(yǎng)基（批號：G4554）、丙酮酸鈉溶液（批號：G4212）、電鏡固定液（批號：G1102）均購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號：10270-106）和0.25%胰蛋白酶（批號：25200-056）均購自美國Gibco 公司；4%臺盼藍染色液（批號：BL627L）和細胞增殖-毒性檢測試劑盒（批號：521942）均購自安徽白鯊生物科技有限公司；細胞三抗（上海漢恒生物科技有限公司，批號：HB-PPS-100）；無菌PBS（武漢博士德生物工程有限公司，批號：PYG0021）；無血清細胞凍存液（蘇州新賽美生物科技有限公司，批號：C40100）；纖連蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號：F8180）；小麥胚芽凝集素（WGA，美國Life Techologies 公司，批號：W11262）。

1.3 實驗儀器 自動細胞計數(shù)儀（中國睿鈺生物科技有限公司，型號：Countstar tigel 53）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司，型號：DMI8）；多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：Multi-skan FC）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號：GL-21M）；激光掃描共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司，型號：Zeiss710）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，型號：H7650）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) MG63 細胞用α-MEM 完全培養(yǎng)基（α-MEM＋10%新鮮胎牛血清＋1%丙酮酸鈉溶液＋1%細胞三抗），在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d 傳代1 次。

2.2 CCK8 法檢測細胞增殖率 分別取1 mg TAL和TALP 粉末溶于10 μL DMSO，然后加入10 mL α-MEM 完全培養(yǎng)基，混勻，0.22 μm 過濾器過濾，得到100 μg/mL 含藥培養(yǎng)基，再用α-MEM 完全培養(yǎng)基分別稀釋成10、20、40、60、80 μg/mL TAL 和TALP培養(yǎng)液。取96 孔板4 個，按照4×103個/孔接種細胞，分為空白組、TAL 組和TALP 組，過夜細胞貼壁后，空白組加入不含藥物的α-MEM 完全培養(yǎng)基，TAL 組和TALP 組以含10、20、40、60、80、100 μg/mL分別加入TAL 和TALP 培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔；24、48 h 后棄去舊培養(yǎng)基，每個孔加入90 μL新α-MEM 完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8 溶液，于培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光度（OD 值），計算不同濃度TAL 和TALP 培養(yǎng)液對細胞增殖率的影響。增殖率＝（實驗組OD 值/空白組OD 值）×100%。運用GraphPad prism 8 軟件，以增殖率為縱坐標、劑量的對數(shù)為橫坐標，繪制二者的量-效關(guān)系曲線，并求出增殖率為50%時所對應(yīng)的劑量，即為細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 劃痕實驗 取12 孔板，每個孔接種2×105個細胞培養(yǎng)過夜，使其貼滿每個孔底部。用200 μL的槍頭垂直于孔板劃線，然后棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2 遍。空白組加入對照培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基＋1%胎牛血清），TAL 組和TALP 組在對照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上為避免藥物對細胞活力的影響，根據(jù)CCK8實驗結(jié)果，取24 h IC50的50%劑量約為50.0 μg/mL稀釋成不同濃度的含藥培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞，即TAL組和TALP 組以50.0、25.0、12.5、6.25 μg/mL 濃度分別加入TAL 和TALP 培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)0 、24 h 后分別拍照記錄。用ImageJ 軟件測量細胞間0 h 和24 h劃痕面積并計算遷移率和遷移抑制率：遷移率＝（0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%；遷移抑制率＝（1－藥物組遷移率/對照組遷移率）×100%。運用GraphPad prism 8 軟件，以遷移抑制率為縱坐標，藥物濃度的對數(shù)（logC）為橫坐標，繪制二者的量-效關(guān)系曲線，求出遷移抑制率為50%時所對應(yīng)的劑量，用于遷移體計數(shù)實驗。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察遷移體生成和生長情況

2.4.1 靜態(tài)觀察遷移體顯微形態(tài) 在35 mm 玻底培養(yǎng)皿中加入5 μg/mL 纖連蛋白溶液1 mL，室溫孵育1 h后吸棄；每皿種3×104個細胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～20 h，用-20 ℃ 甲醇在室溫固定10 min；再用PBS 輕輕蕩洗3 次，每次3 min，用5.0 μg/mL WGA 染液室溫孵育15 min 來標記細胞［8］，用PBS 輕輕蕩洗3 次，每次3 min。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察MG63 細胞遷移體的顯微形態(tài)。

2.4.2 動態(tài)觀察遷移體生長過程 按照“2.4.1”項下方法進行纖連蛋白鋪皿并接種細胞后，加入含5.0 μg/mL WGA 的完全培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～20 h，在激光掃描共聚焦顯微鏡下實時觀察細胞遷移體的生長過程，每隔20 min拍照1次。

2.5 遷移體的提取及其超微結(jié)構(gòu)觀察 取40 個150 mm 的細胞培養(yǎng)皿各加入5 μg/mL 纖連蛋白溶液10 mL，室溫孵育1 h 后吸棄；每皿接種8×105個細胞，混勻，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～20 h；將細胞消化后收集在50 mL 離心管中，以1 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液；以4 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液；以18 000 r/min、4 ℃離心30 min，去上清。收集到的遷移體通過電鏡固定液固定、樹脂包埋、超薄切片和鉛-鈾染色后，于透射電子顯微鏡下觀察遷移體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

2.6 藥物干預(yù)和遷移體計數(shù) 按照“2.4.1”項下方法進行纖連蛋白鋪皿并接種細胞，分為空白組、TAL 組和TALP 組，空白組不加藥物，TAL 組和TALP 組根據(jù)劃痕實驗結(jié)果，取細胞遷移抑制率約為50%時的藥物濃度，即15 μg/mL TAL 培養(yǎng)液、20 μg/mL TALP 培養(yǎng)液進行干預(yù)15～20 h 后，按照“2.5”項下方法進行WGA 染色，激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照，每組取12 個細胞計數(shù)，計算每個細胞遷移體的平均數(shù)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組細胞增殖情況 與空白組比較，40、60、80、100 μg/mL TAL 干預(yù)24 h 后細胞增殖率明顯下降（P＜0.05），且TAL 濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖1。20、40、60、80、100 μg/mL TAL 干預(yù)48 h 后細胞增殖率顯著下降（P＜0.05），且TAL 濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖2。

圖1 TAL 干預(yù)24 h 對MG63 細胞增殖率的影響

圖2 TAL 干預(yù)48 h 對MG63 細胞增殖率的影響

與空白組比較，40、60、80、100 μg/mL TALP 干預(yù)24 h 和48 h 后細胞增殖率均顯著下降，且TALP濃度越大細胞增殖率下降越明顯，見圖3 和圖4。

圖3 TALP 干預(yù)24 h 對MG63 細胞增殖率的影響

圖4 TALP 干預(yù)48 h 對MG63 細胞增殖率的影響

3.2 各組細胞遷移情況 與空白組比較，TAL 和TALP 干預(yù)濃度＞12.5 μg/mL 時可顯著抑制細胞遷移，見圖5和圖6。細胞遷移抑制率為50%時TAL和TALP藥物濃度分別為15.05 μg/mL和20.16 μg/mL，見圖7。

圖6 TAL 和TALP 干預(yù)后MG63 細胞遷移率變化

圖7 藥物濃度的對數(shù)與遷移抑制率量效曲線

3.3 遷移體顯微形態(tài) WGA 染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察可見細胞尾部有長長的細絲狀結(jié)構(gòu)，即為收縮絲；在收縮絲的尖端或交叉點上可見膨大的囊泡狀結(jié)構(gòu)，即為遷移體。見圖8。

圖8 MG63 細胞遷移體顯微形態(tài)

3.4 遷移體生長的動態(tài)過程 通過連續(xù)觀察拍攝MG63 細胞遷移，可見收縮絲末端或交叉處的囊泡從無到有、從小到大的生長過程。見圖9。

圖9 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察遷移體生長的動態(tài)過程

3.5 遷移體超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡下可見提取的遷移體為類圓形結(jié)構(gòu)，直徑在0.5～3.0 μm，表面為雙層膜包繞，內(nèi)部可見數(shù)量不等的小囊泡，整個遷移體酷似石榴狀。見圖10。

圖10 透射電子顯微鏡下觀察遷移體超微結(jié)構(gòu)

3.6 遷移體數(shù)量變化 空白組細胞形態(tài)舒展，收縮絲多而長，尾部或分叉處可見較多遷移體。與空白組比較，TAL 組和TALP 組細胞都出現(xiàn)不同程度收縮，收縮絲比空白組短而細，遷移體較稀疏，見圖11。結(jié)果顯示：與空白組比較，TAL 15 μg/mL 組和TALP 20 μg/mL 組細胞平均遷移體數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。見圖12。

圖11 TAL 和TALP 干預(yù)后細胞遷移體變化

圖12 TAL 和TALP 干預(yù)后細胞遷移體數(shù)量變化

4 討 論

既往的研究表明蓮心堿及其衍生物對多種腫瘤細胞有抑制作用。曾建偉等［3］研究發(fā)現(xiàn)TAL 對人肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞SGC-7901、乳腺癌細胞株MCF-7和結(jié)腸癌細胞RKO有明顯抑制作用。張錫宇［9］研究發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿可通過激活p38 MAPK 信號通路，磷酸化p-p21Ser130 而延長p21 蛋白半衰期，導(dǎo)致p21 蛋白在細胞內(nèi)累積進而引起細胞周期G1 期停滯，抑制成骨肉瘤細胞生長。本研究發(fā)現(xiàn)TAL 對人骨肉瘤細胞MG63 的增殖有顯著抑制作用，TALP 對細胞的半數(shù)抑制濃度略高于TAL，但仍能顯著抑制MG63 細胞增殖，抗腫瘤藥效未發(fā)生本質(zhì)變化。鑒于TALP 具有較高的穩(wěn)定性，在實際應(yīng)用中可能更有利于推廣。

惡性腫瘤除了增殖快，其難以治愈的重要原因之一是腫瘤細胞極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這與腫瘤細胞高度的遷移性能有關(guān)。為了進一步研究蓮子心總生物堿是否有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，我們應(yīng)用劃痕實驗觀察其對細胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)與空白組比較，TAL 和TALP 干預(yù)均可顯著抑制MG63 細胞的遷移，提示TAL 和TALP 可能對骨肉瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用。

細胞遷移是細胞接收到遷移的信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度變化后產(chǎn)生的移動，由細胞前端偽足的延伸、前端偽足與細胞外基質(zhì)形成新的黏附、胞體向前移動、后方黏附的釋放和細胞胞體收縮組成的一系列循環(huán)過程［10］。2015 年俞立教授團隊發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞在遷移過程中，細胞的尾部會出現(xiàn)細長的收縮絲，且在尖端或分叉處可形成直徑為0.5～3.0 μm 的囊泡，透射電子顯微鏡下可見這些囊泡的內(nèi)部還包含數(shù)量不等的小囊泡，整個結(jié)構(gòu)類似于石榴，故將其命名為“石榴樣結(jié)構(gòu)”。鑒于石榴樣結(jié)構(gòu)的形成取決于細胞遷移過程，故正式命名為“遷移體”［5］。在后續(xù)的研究中，該團隊發(fā)現(xiàn)遷移體還廣泛存在于多種體細胞和腫瘤細胞中。本研究中我們發(fā)現(xiàn)MG63 細胞遷移過程中細胞尾部亦產(chǎn)生收縮絲和膨大的囊泡結(jié)構(gòu)，并觀察到該囊泡在收縮絲上從無到有、從小到大的生長過程。為了進一步確認該結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，我們通過梯度離心提取囊泡，在透射電子顯微鏡下觀察到遷移體的石榴樣結(jié)構(gòu)，表明人骨肉瘤細胞MG63 確實在遷移過程中產(chǎn)生遷移體。

遷移體在細胞遷移過程中產(chǎn)生，并在細胞離開后可留在原處一段時間，從而保留了細胞遷移過程的時間和空間信息。同時遷移體內(nèi)部包含豐富的蛋白和基因等內(nèi)容物，這些內(nèi)容物最終將在遷移體裂解后釋放到細胞外，或隨著遷移體直接被周圍的細胞攝取，從而傳遞相應(yīng)的信息。遷移體包含的時空信息以及蛋白和基因等都可能影響后續(xù)相關(guān)細胞的遷移或其他功能活動［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)TAL和TALP 干預(yù)MG63 細胞后，遷移體產(chǎn)生的數(shù)量顯著減少，提示TAL 和TALP 可能通過抑制細胞遷移體的生成，影響后續(xù)腫瘤細胞的功能活動，從而改善骨肉瘤的預(yù)后。本研究僅對藥物干預(yù)后MG63細胞遷移與遷移體形成的變化進行了初步探討，遷移體生成的變化如何影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的具體機制有待進一步深入研究。

綜上所述，TAL 和TALP 對骨肉瘤MG63 細胞的增殖和遷移有抑制作用；在MG63 細胞遷移時可產(chǎn)生遷移體，而TAL 和TALP 的干預(yù)則能夠顯著減少遷移體數(shù)量：因此TAL 和TALP 抑制MG63 骨肉瘤細胞的機制可能與其影響遷移體的產(chǎn)生有關(guān)。