基于Nrf2/HO-1通路探討健骨顆粒含藥血清對氧化應(yīng)激狀態(tài)成骨細(xì)胞骨形成的調(diào)控機(jī)制

周 芬，孫 攀，黃云梅，王志強(qiáng)，林燕萍*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350122；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨極”等范疇，是絕經(jīng)后婦女以低骨量和骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎?dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加、易于骨折的全身代謝性疾病。由于PMOP 導(dǎo)致的病理性骨折及其并發(fā)癥有較高致殘率和致死率［1-2］，嚴(yán)重威脅著中老年女性的身心健康，且給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)［3］。該病由于具體發(fā)病機(jī)制不甚明確，臨床療效也不佳，已成為世界性健康難題。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，影響本病的發(fā)生與發(fā)展［4-6］。氧化應(yīng)激是指由機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的活性氧（ROS），其包含超氧化物陰離子、過氧化物和羥基自由基等過度累積，超過機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，從而引起組織和細(xì)胞損傷的病理現(xiàn)象［7］。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS 激活Nrf2 使其磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動血紅素氧合酶（HO-1）的轉(zhuǎn)錄，而HO-1 能有效阻止機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，故Nrf2/HO-1 通路是機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要途徑，是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分［8］。氧化應(yīng)激可調(diào)節(jié)成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）的表達(dá)，降低成骨細(xì)胞活性［9］。由此可知，氧化應(yīng)激與骨形成存在著密切聯(lián)系，氧化應(yīng)激對骨形成的抑制作用是PMOP 發(fā)生的一個重要因素。本課題組前期研究結(jié)果顯示健骨顆粒對成骨細(xì)胞骨形成有較好的促進(jìn)作用，證實健骨顆粒能夠有效防治PMOP［10-11］。由于氧化應(yīng)激是PMOP 的主要原因之一，然而健骨顆粒的治療作用與抗氧化應(yīng)激是否相關(guān)尚不明確，因此設(shè)計本實驗探討健骨顆粒能否通過Nrf2/HO-1 信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)骨形成。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物 12 周齡SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級實驗室，實驗動物使用許可證：SYXK（閩）2019-0007。本研究實驗方法和實驗動物處理方法已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核（審批號：〔2018〕福中醫(yī)倫理審字第（038）號），符合動物實驗倫理要求。

1.2 實驗細(xì)胞 UMR-106 成骨樣細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（目錄號：TCR11）。

1.3 實驗藥材 健骨顆粒由煅狗骨、山茱萸、黨參、山藥等藥物組成，均購自福建同春藥業(yè)股份有限公司，由福建省中醫(yī)藥科學(xué)院中試車間依照課題組制劑工藝標(biāo)準(zhǔn)煎煮濃縮，制備成健骨顆粒浸膏，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 實驗試劑 胎牛血清（美國Sigma 公司，貨號：F8687）；青鏈霉素（貨號：SV30010）、高糖DMEM培養(yǎng)基（貨號：SH30022.01B）、PBS 緩沖液（貨號：SH30256.01B）均購自新西蘭Hyclone 公司；Nrf2（貨號：16396-1-AP）、HO-1（貨號：10701-1-AP）、β-actin 抗體（貨號：66009-1-Ig）、兔二抗（貨號：SA00001-2）、鼠二抗（貨號：SA00001-1）均購自美國Proteintech 公司；Western 封閉液（貨號：P0023B）、Western 一抗稀釋液（貨號：P0023A）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）、超氧化物陰離子熒光探針（DHE，貨號：S0063）、DAPI 染色液（貨號：C1006）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘氨酸（貨號：1275GR500）、茜素紅染色液（貨號：RASMX-90021）均購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；30%過氧化氫（貨號：3004003-01-03）、甲醇（貨號：1030038-01-01）均購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.5 實驗器材 CO2培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱均購自美國Thermo Fisher 公司；低溫高速離心機(jī)、移液器均購自德國Eppendorf公司；恒溫水浴鍋、DHG-9070A 烘箱均購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；小型垂直電泳、小型Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽均購自美國Bio-Rad 公司；DFC295 倒置顯微鏡、DFC425 熒光顯微鏡均購自德國Leica 公司。

2 實驗方法

2.1 健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清制備 6 周齡SPF 級雄性SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為健骨顆粒組和生理鹽水組，每組20 只。健骨顆粒組給藥劑量根據(jù)人與動物間體表面積折算的等效劑量系數(shù)換算，健骨顆粒組每天灌服含生藥量7.8 g/kg 健骨顆粒浸膏稀釋液2 mL，生理鹽水組每天灌服生理鹽水2 mL，2 組每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d。第7 天在灌胃1 h 后腹主動脈取血，靜置4 h后以3 000 r/min 離心15 min，分離上清，56 ℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體，過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存。健骨顆粒組提取的血清即為健骨顆粒含藥血清，生理鹽水組提取的血清即為生理鹽水血清。

2.2 UMR-106 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 從-80 ℃冰箱中取出凍存的UMR-106 細(xì)胞，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中，融化后加入1 mL 完全培養(yǎng)液，輕輕吹打，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中；再加入5 mL 完全培養(yǎng)基，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清，加入1 mL 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打使細(xì)胞懸起，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；再加入4 mL 完全培養(yǎng)基，“8”字法搖勻后置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為80%時進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，加入2 mL PBS，清洗2 次；然后向瓶中加入1 mL 含EDTA 胰蛋白酶，37 ℃消化1 min，向瓶中加入1 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清；加入1 mL 完全培養(yǎng)液，輕輕吹打制成均勻的細(xì)胞懸液，向2 個培養(yǎng)瓶中各加入500 μL 細(xì)胞懸液，并加入4.5 mL完全培養(yǎng)基，混勻后置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.3 實驗分組與干預(yù) 將課題組前期構(gòu)建的Nrf2敲減穩(wěn)定的UMR-106 細(xì)胞株和Nrf2 陰性對照細(xì)胞［12］，分別分為Nrf2-KD＋JG 組、Nrf2-KD＋NS 組和NC＋JG 組、NC＋NS 組。種皿后待細(xì)胞匯合至皿底80%面積，使用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h 后，Nrf2-KD＋JG 組和NC＋JG 組分別采用10%健骨顆粒含藥血清［10］加高糖DMEM 培養(yǎng)12 h，Nrf2-KD＋NS 組和NC＋NS 組分別采用10%生理鹽水血清加高糖DMEM 培養(yǎng)12 h，再用10 μmol/L 過氧化氫干預(yù)12 h［12］。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 DHE 檢測4 組超氧化物陰離子水平 將處于對數(shù)生長期的UMR-106 細(xì)胞消化重懸，按照1×105個/mL 接種于20 mm2共聚焦培養(yǎng)皿，按照“2.3”項下方法分組并干預(yù)4 組細(xì)胞。干預(yù)后棄上清，PBS洗凈皿內(nèi)殘余培養(yǎng)液，每皿加500 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS將DHE稀釋為2 μmol/L；每皿加入1 mL DHE，37 ℃孵育30 min，孵育完畢棄去皿內(nèi)液體，PBS 洗皿5 min×3 次；再向皿內(nèi)加入500 μL DAPI 染色液，37 ℃孵育5 min，PBS 洗皿5 min×3 次；雙轉(zhuǎn)盤激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，561 nm 波長下觀察DHE 紅色熒光，即細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子，488 nm 波長觀察DAPI 藍(lán)色熒光，即細(xì)胞核，ImageJ 軟件分析紅色熒光面積占藍(lán)色熒光面積的百分比，即相對熒光強(qiáng)度。

2.4.2 茜素紅染色觀察4 組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量 將4 組細(xì)胞按照“2.3”項下方法干預(yù)后再更換完全培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2 周。期間觀察細(xì)胞生長情況，隔天換液1 次，2 周后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍后每孔加1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；再PBS 洗2 遍后每孔加入1 mL 茜素紅染色液，染5 min 后棄去茜素紅染色液；再用PBS 沖洗3 次，于顯微鏡汞燈藍(lán)光下觀察礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

2.4.3 Western blot 法檢測4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1及RUNX2 蛋白相對表達(dá)量 4 組細(xì)胞按照“2.3”項下方法干預(yù)后棄液，PBS 洗凈。① 細(xì)胞總蛋白提?。好棵蠹尤?00 μL 蛋白裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑＝100∶1∶1），冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刀將裂解好的細(xì)胞輕輕刮下，轉(zhuǎn)移至EP 管中，移至離心機(jī)中以12 000 r/min、4 ℃離心20 min，分離上清即為細(xì)胞總蛋白；② 細(xì)胞核蛋白提?。喊凑照f明書配置Hypotonic Buffer（1 mL 加入5 μL 磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF）和Lysis Buffer（1 mL加入5 μL磷酸酶抑制劑和10 μL PMSF）備用。PBS 洗凈皿內(nèi)殘余培養(yǎng)液，向皿內(nèi)加入450 μL 配置好的Hypotonic Buffer，冰上裂解10 min；用細(xì)胞刮刀將裂解好的細(xì)胞輕輕刮下移至EP 管，震蕩管壁使沉淀懸起，冰浴10 min，震蕩10 s，混勻，以3 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清；再加400 μL Hypotonic Buffer，震蕩洗滌沉淀30 s，再以5 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清；沉淀中再加入100 μL 配置好的Lysis Buffer，震蕩懸起沉淀，冰浴20 min，以15 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離上清即為細(xì)胞核蛋白。BCA 法將蛋白定量后95 ℃金屬浴5 min 使蛋白變性，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲煤肧DS-PAGE 膠后依序上樣，先用20 V 電壓電泳10 min，再調(diào)整到80 V 電壓電泳30 min，最后使用120 V 電壓電泳直至目的蛋白清晰分離后停止電泳。電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)模，再用Western 封閉液封閉1 h，按比例加入一抗（Nrf2、HO-1 按1∶1 000 稀釋，RUNX2 按1∶2 000 稀釋）4 ℃過夜；次日取出并使用TBST 洗3 遍，加入相對應(yīng)的二抗（稀釋比例為1∶10 000）孵育1 h，TBST搖洗后PVDF 膜放置在顯影盒內(nèi)，均勻滴加顯影液，運(yùn)行Image Lab 6.0 分析實驗結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件處理。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組超氧化物陰離子含量比較 與NC＋JG 組比較，Nrf2-KD＋JG 組超氧化物陰離子含量明顯增多（P＜0.05）；與NC＋NS 組比較，NC＋JG 組的超氧化物陰離子含量顯著降低（P＜0.05），Nrf2-KD＋NS 組的明顯增多（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組超氧化物陰離子含量比較（×400）

3.2 4 組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量比較 茜素紅染色后顯微鏡下可見：Nrf2-KD＋JG 組較NC＋JG 組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少；與NC＋NS 組比較，Nrf2-KD＋NS 組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，而NC＋JG 組的卻明顯增多。見圖2。

圖2 4 組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量比較（×100）

3.3 4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達(dá)量比較 Nrf2-KD＋JG 組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達(dá)量較NC＋JG 組減少（P＜0.05）；與NC＋NS 組比較，Nrf2-KD＋NS 組上述指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量減少（P＜0.05），而NC＋JG組上述指標(biāo)蛋白相對表達(dá)量則明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4 組Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2 蛋白相對表達(dá)量比較

4 討 論

生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 與KEAP1 結(jié)合，只有少量游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量過高，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS 能夠激活MAPK、PI3K、PKC 信號通路使Nrf2 磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與啟動子抗氧化反應(yīng)元件ARE 結(jié)合，啟動HO-1 的轉(zhuǎn)錄，HO-1 在ROS 升高時大量表達(dá)，催化氧化性血紅素降解，生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子，在阻止機(jī)體氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用，可見Nrf2/HO-1 信號通路是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵橋梁［13-14］。已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲減成骨細(xì)胞中的Nrf2 基因后，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量明顯升高，同時成骨細(xì)胞分泌的RANKL 表達(dá)也明顯升高［15］；Nrf2 基因敲除小鼠明顯出現(xiàn)骨形成速率下降，骨丟失增加［16］；當(dāng)上調(diào)Nrf2 基因表達(dá)時，能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［17］，同時抑制成骨細(xì)胞的凋亡［9］：這提示Nrf2 對成骨細(xì)胞骨形成的作用至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示：在敲減Nrf2 基因后，健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清均不能有效激活細(xì)胞內(nèi)Nrf2/HO-1 信號通路，抗氧化酶HO-1 的表達(dá)也出現(xiàn)了明顯下降，不能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子含量，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，骨形成標(biāo)志蛋白RUNX2 的表達(dá)下降，細(xì)胞礦化能力下降，骨形成受到抑制。這提示在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)Nrf2 含量可調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞骨形成的功能。

本實驗結(jié)果顯示：氧化應(yīng)激狀態(tài)下NC＋JG 組細(xì)胞內(nèi)Nrf2 蛋白表達(dá)量較NC＋NS 組升高，其下游的HO-1 也隨之升高，超氧化物陰離子含量相應(yīng)減少，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多且RUNX2 蛋白含量增加。這說明Nrf2/HO-1 信號通路在健骨顆粒含藥血清促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成作用中起到關(guān)鍵作用。健骨顆粒含藥血清可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，提高成骨細(xì)胞抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平，升高骨形成標(biāo)志蛋白RUNX2 的表達(dá)，提升骨礦化能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成，使骨穩(wěn)態(tài)恢復(fù)平衡，達(dá)到防治PMOP 的目的。