紅毛藻血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的篩選及其穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

吳靖娜，洪喬茜，廖榕榕，蔡水淋，陳曉婷，蘇海燕，蘇 筱，許 莉，潘 南，卓詩(shī)晴

（1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院 海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院 廈門(mén)市海洋藥用天然產(chǎn)物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361023；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013）

高血壓是我國(guó)乃至全世界最為常見(jiàn)的一種慢性疾病，全世界近10億 人患有高血壓，預(yù)計(jì)到2025年，全世界將有15.6億 人患有高血壓[1]。目前，藥物仍是治療高血壓的主要手段，其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）抑制劑是最常用的抗高血壓藥物之一，ACE是一種鋅金屬肽酶，是高血壓發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白靶標(biāo)[2]，ACE可催化無(wú)升壓活性的血管緊張素（angiotensin，ANG）I脫去C末端的兩個(gè)氨基酸后轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)升壓活性的血管緊張素II（ANG II），還能水解激肽-激肽釋放酶系統(tǒng)中具有舒張血管功能的緩激肽（bradykinin，BK）C末端的Phe-Arg，使其失去活性，導(dǎo)致血壓升高[3]。而ACE抑制劑通過(guò)抑制ACE活性來(lái)阻斷ANG II的生成，減弱BK的降解，從而達(dá)到降低血壓的目的[4]。目前已有多種合成的ACE抑制劑如卡托普利和依那普利等作為抗高血壓藥物被開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用，然而，單一使用ACE抑制劑藥物不能有效地降低血壓，還可能引發(fā)干咳、瘙癢、皮疹和腎功能衰竭等副作用[5]，因此，安全營(yíng)養(yǎng)的ACE抑制劑亟待研究。食源性生物活性肽作為天然的功能因子，除了具有ACE抑制活性外，還具有抑制膽堿酯酶[6]、β-分泌酶[7]等多種生理活性，因此，食源性ACE抑制肽作為多功能的抗高血壓物質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。

海洋占地球表面積的71%，是未來(lái)的食品基地，海洋產(chǎn)品更是人類攝取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。海洋源降壓肽首次在發(fā)酵魚(yú)“bekasam”中被發(fā)現(xiàn)[8]，此后，在魚(yú)類、甲殼類、貝類和藻類中相繼被發(fā)現(xiàn)。如Sun Siqi等[9]從滸苔蛋白酶解液中獲得降血壓活性肽Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg和Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為219.35 μmol/L和236.85 μmol/L；Deng Zhenzhen等[10]從龍須菜中分離得到ACE抑制肽FQIN[M(O)]CILR和TGAPCR，其IC50分別為9.64 μmol/L和23.94 μmol/L，這兩個(gè)肽均表現(xiàn)出pH值、溫度、模擬胃腸道消化和ACE水解穩(wěn)定性；Wang Kai等[11]從鈍頂節(jié)螺藻蛋白水解物中篩選出ACE抑制肽PTGNPLSP（IC50＝1.54 mg/mL），其在熱處理（25～100 ℃）和不同pH值條件（pH 3～11）下均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

ACE抑制肽的制備方法主要有水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法等[12]。水解法主要有酸水解法、堿水解法和酶解法，其中酶解法是制備ACE抑制肽常用的方法[13]。然而，從酶解產(chǎn)物中分離到的活性肽組分極其復(fù)雜，同時(shí)在反復(fù)分離純化過(guò)程中損失嚴(yán)重，更重要的是，最終分離純化出的肽有可能錯(cuò)過(guò)了活性最高的肽序列[14]。近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)與肽組學(xué)技術(shù)的不斷改善，多種基于不同算法的de novo從頭測(cè)序軟件（如PEAKS Studio、Novor等）問(wèn)世[15]，與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定方法不同的是，de novo測(cè)序的肽段鑒定方法是根據(jù)質(zhì)譜圖中離子峰的質(zhì)量分布反映出肽及其片段的質(zhì)量分布，通過(guò)算法算出相鄰離子峰的質(zhì)量差從而推斷出對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，然后使用模型推斷出譜圖中相對(duì)應(yīng)的肽段序列[16]，能夠有效鑒定沒(méi)有包含于數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的肽序列，克服了數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的局限性。目前，ACE抑制肽活性評(píng)價(jià)主要是采用體外活性測(cè)定和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩種方法，在前期活性肽的初篩一般是通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)反應(yīng)體系中加入ACE抑制肽前后馬尿酸生成量的變化實(shí)現(xiàn)[17]，活性初篩過(guò)程耗資較大、耗時(shí)較長(zhǎng)。近年來(lái)，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)活性肽的研究越來(lái)越多，運(yùn)用靶標(biāo)篩選的研究方法已逐漸成為活性肽研究的重要手段，已利用靶標(biāo)篩選的方法成功地從大黃魚(yú)[18]、雞蛋蛋白[19]等食物蛋白中鑒定出新的ACE抑制肽。

因此，本研究以紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）為原料，采用酶解法及超濾法制備ACE抑制活性肽，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)篩選獲得ACE抑制肽，并對(duì)其活性及穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為海洋來(lái)源的降血壓肽的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅毛藻 福建省莆田市匯龍海產(chǎn)有限公司提供。

中性蛋白酶（200 U/m g、食品級(jí)）、牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硼砂（均為分析純），胃蛋白酶、胰蛋白酶（均為食品級(jí)）西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈（色譜級(jí)）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL）（色譜級(jí)）、ACE（1U）、馬尿酸 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Me204E分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科技儀器有限公司；5910R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；RE212-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Yamato公司；Alpha 1-2冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；FlexStation 3鈣流檢測(cè)工作站 美國(guó)Molecular Device公司；FlowMen-0021-HP三聯(lián)高壓平板膜設(shè)備 廈門(mén)世達(dá)膜科技有限公司；E2695高效液相色譜儀 美國(guó)沃特世科技有限公司；Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅毛藻肽的制備

紅毛藻粉碎處理后，配成質(zhì)量濃度為2.5 g/100 mL的溶液，經(jīng)2%中性蛋白酶酶解后（56 ℃，4 h），8 000 r/min離心10 min去除殘?jiān)?，再?jīng)超濾設(shè)備分離酶解產(chǎn)物，最終收集＜800、800～2 000、2 000～10 000 Da和＞10 000 Da 4 個(gè)超濾組分，冷凍干燥后分別命名為F1、F2、F3、F4，篩選ACE抑制活性高的組分進(jìn)行下一步分析。

1.3.2 ACE抑制活性的測(cè)定

將紅毛藻肽F1、F2、F3、F4分別配成100 μg/mL溶液，按表1的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)（其中樣品組加紅毛藻肽溶液，空白對(duì)照組加硼酸鹽緩沖液），反應(yīng)結(jié)束后過(guò)0.22 μm微孔濾膜，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)馬尿酸的含量。

表1 ACE抑制活性檢測(cè)反應(yīng)體系Table 1 Reaction systems for ACE inhibition assay

HPLC的檢測(cè)條件：Sunfire C18分析用色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈-水（32∶68，V/V，含0.1%三氟乙酸）作為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，在228 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)馬尿酸的含量。

ACE抑制率按下式計(jì)算：

式中：A為對(duì)照組馬尿酸色譜峰面積；B為樣品組馬尿酸色譜峰面積。

1.3.3 ACE抑制肽的氨基酸序列分析

1.3.3.1 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

將篩選得到的ACE抑制活性最強(qiáng)的組分用2%乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的多肽溶液，利用Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行序列組成鑒定，質(zhì)譜條件：色譜柱為PepMap RPLC C18（75 μm×150 mm，3 μm，100 ?），陽(yáng)離子模式，掃描范圍為m/z300～1 500，發(fā)射極噴霧電壓2 kV，并記錄對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖。

1.3.3.2de novo測(cè)序

將1.3.3.1節(jié)測(cè)定的原始數(shù)據(jù)raw文件導(dǎo)入到PEAKS Studio軟件中，采用de novo手動(dòng)測(cè)序方法進(jìn)行從頭測(cè)序分析，獲得肽序列，并對(duì)序列結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行打分評(píng)估，選取殘差局部置信度（residue local confidence，ALC）＞80%的肽序列。

1.3.4 基于分子對(duì)接的ACE抑制肽的虛擬篩選

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（www.rcsb.org）下載ACE的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1O86），利用殷賦科技平臺(tái)（www.yinfotek.com）中【處理PDB結(jié)構(gòu)】板塊對(duì)該蛋白進(jìn)行以下處理：剔除水分子、溶劑分子和雜原子基團(tuán)，添加氫原子和電勢(shì)，保留Zn2＋和Cl－。

將1.3.3節(jié)所獲得肽序列文件轉(zhuǎn)化為pdb格式文件，上傳至殷賦科技平臺(tái)中【準(zhǔn)備多肽結(jié)構(gòu)】板塊，生成配體的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，保存為MDL SDfile（sdf）格式。

通過(guò)殷賦科技平臺(tái)中【小分子虛擬篩選】程序?qū)?yōu)化后的配體和受體進(jìn)行半柔性對(duì)接，對(duì)接口袋中心大小為40.372、33.820、48.088 ?，對(duì)接盒子大小為35.025、40.810、37.633 ?，生成多個(gè)不同的構(gòu)象取向。通過(guò)聚類分析（均方根誤差（root mean square deviation，RMSD）閾值為2.0 ?），得到對(duì)接打分和相互作用，分析結(jié)合模式。

1.3.5 虛擬篩選結(jié)果驗(yàn)證

選取1.3.4節(jié)虛擬篩選對(duì)接打分最低的前6 個(gè)肽委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行固相化學(xué)合成，分別命名為L(zhǎng)1、L2、L3、L4、L5和L6，然后分別配成100 μg/mL的溶液，按照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行ACE抑制率的比較。并將ACE抑制活性前3的肽配制成不同質(zhì)量濃度，以肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)，進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算IC50。

1.3.6 不同加熱溫度下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

將1.3.5節(jié)獲得的抑制活性最強(qiáng)的ACE抑制肽配制成100 μg/mL的溶液，分別吸取500 μL置于20、40、60、80 ℃和100 ℃的水浴中加熱2 h，冷卻至室溫后，按照1.3.2節(jié)的方法測(cè)定ACE抑制率，以未處理的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.7 不同pH值下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，在不同pH值溶液中等體積加入2 mg/mL肽溶液，反應(yīng)2 h，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋到100 μg/mL，測(cè)定ACE抑制率，以未處理的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.8 抗消化性能分析

1.3.8.1 人工胃腸液的配制

人工胃液的配制：取濃度為1 mol/L稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1 000 mL，置于4 ℃冰箱備用。

人工腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL水，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水適量使其溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL。

1.3.8.2 人工胃液?jiǎn)为?dú)作用下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

參照鄭志強(qiáng)等[20]的方法略作修改。用人工胃液將肽配制成1 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋為100 μg/mL，測(cè)定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.8.3 人工腸液?jiǎn)为?dú)作用下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

參照鄭志強(qiáng)等[20]的方法略作修改。用人工腸液將肽配制成1 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋為100 μg/mL，測(cè)定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.8.4 模擬人體胃腸消化下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

用人工胃液將肽配制成2 mg/mL的溶液，37 ℃、200 r/min水浴2 h后調(diào)pH值至6.8，添加同體積的人工腸液，37 ℃、200 r/min水浴2 h。100 ℃恒溫水浴10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心20 min，將處理后的肽溶液用硼酸鹽緩沖液稀釋至100 μg/mL，測(cè)定ACE抑制率。以未處理的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.9 不同金屬離子作用下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

參照朱薪等[21]的方法略作修改。將肽配制成200 μg/mL的溶液，分別加入等體積的NaCl、KCl和MgCl2溶液使不同金屬離子溶液的終濃度分別為10、15 g/100 mL和30 g/100 mL，2 h后測(cè)定ACE抑制率，以不加金屬離子的100 μg/mL肽溶液作對(duì)照組。

1.3.10 不同光照類型作用下ACE抑制肽穩(wěn)定性分析

參照相歡等[22]的方法略作修改。將肽配制成100 μg/mL的質(zhì)量濃度，室溫條件下，分別置于日光燈、紫外燈和黑暗環(huán)境中30 min后，測(cè)定ACE抑制率。以未處理肽溶液作對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紅毛藻肽的超濾分級(jí)及ACE抑制活性比較

如表2所示，F(xiàn)2（800～2000 Da）和F4（＞10 000 Da）組分的得率相對(duì)較高，分別為25.86%和27.83%，然而F2組分的ACE抑制率明顯高于F4，為（75.44±0.81）%。因此選擇F2組分進(jìn)行下一步研究。

表2 超濾分級(jí)得率及ACE抑制活性比較Table 2 Comparison of yields and ACE inhibitory activities of fractions obtained by ultrafiltration

2.2 紅毛藻肽序列預(yù)測(cè)及虛擬篩選

根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行的從頭測(cè)序是蛋白質(zhì)組學(xué)中進(jìn)行蛋白質(zhì)特性分析的關(guān)鍵技術(shù)[23]，從頭測(cè)序的任務(wù)是基于給定質(zhì)譜譜圖和肽段質(zhì)量分布的情況下，通過(guò)算法從譜圖離子峰推斷出肽的氨基酸序列，并對(duì)序列結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行打分評(píng)估。作為de novo結(jié)果的置信度，當(dāng)ALC＞80%表示結(jié)果較為可信。本研究通過(guò)de novo測(cè)序，獲得ALC＞80%的紅毛藻肽39 條。

以所預(yù)測(cè)的39 條肽作為配體，優(yōu)化后的ACE晶體結(jié)構(gòu)（PDB code：1O86）為受體，采用殷賦科技云計(jì)算平臺(tái)的半柔性對(duì)接進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接打分和相互作用，對(duì)接打分的數(shù)值越?。ń^對(duì)值越大）說(shuō)明肽與ACE的結(jié)合能力越強(qiáng)，ACE的抑制活性也可能越強(qiáng)。對(duì)接結(jié)束后，選取對(duì)接打分排名前6的紅毛藻肽（表3），進(jìn)行后續(xù)ACE抑制活性的驗(yàn)證。

表3 對(duì)接打分結(jié)果Table 3 Molecular docking results

2.3 紅毛藻ACE抑制肽活性驗(yàn)證

將L1、L2、L3、L4、L5、L6共6 條ACE抑制肽分別配成100 μg/mL的溶液，檢測(cè)各成分的ACE抑制活性，結(jié)果如表4所示，L1的抑制率最佳，L5和L3次之，L2對(duì)ACE的抑制效果最弱，各組間抑制率差異顯著（P＜0.05）。

表4 紅毛藻ACE抑制肽活性驗(yàn)證Table 4 Amino acid sequence and activity of ACE inhibitory peptides from Bangia fusco-purpurea

挑選抑制活性前3的紅毛藻ACE抑制肽，將L1配制成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，L3配制成62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 7 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，L5配制成62.5、125、250、500、1 000 μg/mL 5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度后，測(cè)定其ACE抑制活性并計(jì)算IC50，結(jié)果顯示L1、L3和L5的ACE抑制率的IC50分別為14.22、183.4 和152.8 μg/mL。因此選擇L1進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.4 紅毛藻ACE抑制肽L1與ACE的結(jié)合位點(diǎn)分析

采用分子對(duì)接的方法對(duì)L1（LVLLFLFGE）與ACE對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行分析。ACE中有3 種主要的活性位點(diǎn)殘基，分別是S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520）和S’1（Glu162）[24]。由圖1可知，L1與ACE之間共有6 個(gè)氫鍵相互作用，與L1產(chǎn)生氫鍵作用的氨基酸殘基包括Glu123、Tyr135、Trp220、Met223、Ala356、Glu384，二者之間形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)是L1與ACE穩(wěn)定結(jié)合的關(guān)鍵；L1還與ACE中的氨基酸殘基His353、His513形成鹽橋作用，這些作用為化合物的結(jié)合提供了－6.117 3 kcal/mol的靜電力貢獻(xiàn)。此外，結(jié)合口袋中具有多個(gè)疏水殘基，可與L1形成較強(qiáng)的疏水作用，提供范德華力貢獻(xiàn)，這些疏水性較強(qiáng)的氨基酸殘基包括Arg124、Ile201、Asp358、Phe391、Tyr523等。

圖1 L1（LVLLFLFGE）與ACE結(jié)合模式圖Fig.1 Binding mode of L1 (LVLLFLFGE) to ACE

2.5 紅毛藻ACE抑制肽L1的穩(wěn)定性分析

2.5.1 不同溫度處理對(duì)L1穩(wěn)定性的影響

由于多肽自身的不穩(wěn)定性以及在高溫下容易降解等原因，往往限制了多肽類功能因子的使用，同時(shí)給多肽的生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存造成了困難。為了確保ACE抑制肽L1在實(shí)際情況中的正常應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)研究了不同溫度條件下抑制肽L1的ACE抑制活性變化。

由圖2可知，L1經(jīng)不同溫度加熱處理后，ACE抑制率均在96%以上，表明L1在20～100 ℃內(nèi)均能保持較好的ACE抑制活性。邵燕秋[25]從鰻魚(yú)骨膠原蛋白中提取多肽GPAGPAGPR和GPPGPPGL并將其在不同溫度（20～100 ℃）進(jìn)行處理，結(jié)果表明處理后ACE抑制活性沒(méi)有明顯的變化（P＞0.05）。楊晨[26]以南瓜籽蛋白為原料制備ACE抑制肽，當(dāng)溫度為20～80 ℃時(shí)，南瓜籽ACE抑制肽的活性抑制率基本沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）?？傮w看來(lái)，L1受溫度的影響較小，能夠耐受長(zhǎng)時(shí)間高溫，這對(duì)于利用活性成分制備功能性食品具有一定的實(shí)用意義。

圖2 加熱溫度對(duì)L1的ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of heating temperatures on the ACE inhibitory activity of L1

2.5.2 不同pH值處理對(duì)L1穩(wěn)定性的影響

L1溶解于甲酸，故L1肽溶液呈酸性（pH＜2）。L1在不同pH值下分別處理2 h后，其ACE抑制率的變化情況如圖3所示，對(duì)照組L1的ACE抑制率最高，為（98.32±0.07）%，隨著pH值的升高，L1的ACE抑制率呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）；pH值為10和12時(shí)，L1的ACE抑制率顯著低于pH值為2、4、6和8（P＜0.05），這可能是由于在堿性條件下，多肽易發(fā)生外消旋或脫酰胺反應(yīng)，導(dǎo)致活性減弱[27]。因此推測(cè)L1對(duì)pH值處理較敏感，在酸性條件下ACE抑制率相對(duì)較強(qiáng)。

圖3 pH值對(duì)L1穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of L1

2.5.3 體外模擬胃腸消化對(duì)L1穩(wěn)定性的影響

L1對(duì)胃腸道消化酶系的穩(wěn)定性研究結(jié)果如圖4所示。胃液的pH值為1～2，且存在胃蛋白酶，食物在胃里被排空的時(shí)間一般為1～2 h，單獨(dú)模擬胃消化反應(yīng)2 h后L1的ACE抑制率下降顯著（P＜0.05），但ACE抑制率仍達(dá)到（93.54±0.13）%；單獨(dú)模擬腸消化反應(yīng)2 h后，L1的ACE抑制率顯著下降（P＜0.05），但ACE抑制率仍達(dá)到（93.99±0.27）%；當(dāng)同時(shí)模擬胃腸消化時(shí)，L1的ACE抑制率亦顯著下降（P＜0.05），但是其抑制率比單獨(dú)處理時(shí)高，為（97.64±0.51）%，這與羅鵬等[28]用葵花籽粕制備的ACE抑制肽在模擬胃液和腸液中活性的變化規(guī)律類似，而王樂(lè)[29]對(duì)桃仁分離蛋白酶解物AN4、BA6和CN6進(jìn)行模擬胃消化后，ACE抑制率呈上升趨勢(shì)，但經(jīng)過(guò)模擬腸消化后的ACE抑制率卻顯著降低。多肽的生物活性主要依靠肽鏈中氨基酸分子間的協(xié)同作用，因此，氨基酸與多肽相比活性較弱[30]，多肽在胃腸消化過(guò)程中，經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶的作用進(jìn)一步水解成分子質(zhì)量更小的短肽或氨基酸，部分具有ACE抑制活性的多肽被破壞[31]，從而導(dǎo)致ACE抑制活性降低，單獨(dú)或者同時(shí)模擬胃腸消化所生成的短肽不一樣，亦會(huì)使其抑制率變化規(guī)律不一致。

圖4 體外模擬胃腸消化對(duì)L1穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of in vitro simulated gastric and intestinal digestion on the stability of L1

2.5.4 不同質(zhì)量濃度金屬離子對(duì)L1穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，隨著金屬離子質(zhì)量濃度的升高，L1的ACE抑制率總體呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），但是ACE抑制活性相對(duì)較高，抑制率均在96%左右；L1經(jīng)10 g/100 mL和15 g/100 mL的NaCl/KCl處理后，ACE抑制率差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)金屬離子質(zhì)量濃度增加到30 g/100 mL時(shí)，ACE抑制率顯著降低（P＜0.05）；不同濃度的MgCl2處理后L1的ACE抑制活性差異顯著（P＜0.05）。劉鑫烔等[32]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的NaCl對(duì)皮氏蛾螺降血壓肽ACE抑制活性的影響很小，但在高濃度NaCl條件下，對(duì)皮氏蛾螺降血壓肽ACE抑制活性的影響顯著，但Zhu Qiaonan等[33]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于油茶籽餅粕蛋白的ACE抑制肽在Na＋、Mg2＋金屬離子處理過(guò)程中，ACE抑制活性無(wú)明顯變化。

圖5 不同質(zhì)量濃度金屬離子對(duì)L1穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of metal ions on the stability of L1

2.5.5 不同光照類型對(duì)ACE抑制肽穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，與對(duì)照組相比，黑暗和日光燈照射處理對(duì)L1的ACE抑制活性無(wú)顯著影響（P＞0.05），而紫外燈照射條件下，L1的ACE抑制率顯著下降（P＜0.05），表明該產(chǎn)品在實(shí)際生產(chǎn)中和貯藏過(guò)程中應(yīng)盡量避免暴露于紫外條件下，以減少影響其ACE抑制活性。

圖6 不同光照類型對(duì)L1穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different types of light exposure on the stability of L1

3 結(jié)論

海藻作為重要的海洋生物資源，因其含有豐富的活性成分，已成為海洋生物制品研究領(lǐng)域的重要發(fā)展方向之一。海洋來(lái)源降血壓肽的開(kāi)發(fā)極具發(fā)展前景，本實(shí)驗(yàn)基于中性蛋白酶法和超濾分離獲得具有ACE抑制活性的紅毛藻肽組分，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與PEAKS Studio軟件的de novo模塊相結(jié)合，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭測(cè)序分析，獲得ALC高于80%的紅毛藻肽39 條。并以此為配體、優(yōu)化后的ACE晶體結(jié)構(gòu)為受體，采用分子對(duì)接高效篩選出與ACE結(jié)合最緊密的6 條ACE抑制肽L1（LVLLFLFGE）、L2（LLPPLELYN）、L3（KFGSKAKN）、L4（LADGNKR）、L5（TTMLWFP）和L6（LLSTRN）；通過(guò)HPLC法對(duì)所獲得肽的ACE抑制活性進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)L1（LVLLFLFGE）的抑制活性最強(qiáng)，IC50為14.22 μg/mL；通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，該肽與ACE之間共有6 個(gè)氫鍵相互作用，并與ACE中的氨基酸殘基His353、His513形成鹽橋作用，與結(jié)合口袋中多個(gè)疏水殘基形成較強(qiáng)的疏水作用。

在實(shí)際的生產(chǎn)加工和人體胃腸消化過(guò)程中，ACE抑制肽的活性可能會(huì)發(fā)生變化，因此，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)L1的加工及消化穩(wěn)定性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：20～100 ℃加熱2 h對(duì)L1的ACE抑制活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）；L1對(duì)不同pH值處理較敏感，隨著pH值的升高，ACE抑制肽活性顯著下降（P＜0.05）；經(jīng)體外模擬胃腸液處理后L1的ACE抑制率雖然低于對(duì)照組，但仍具有較高ACE抑制活性；隨著金屬離子質(zhì)量濃度的升高，L1的ACE抑制率總體呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），但是ACE抑制活性相對(duì)較高，ACE抑制率均在96%左右；此外，紫外處理會(huì)使L1的ACE抑制活性顯著下降（P＜0.05）。