基于硅烷化三聚氰胺海綿的改良QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS快速測定豬肉中49 種抗生素多殘留

季寶成，侯鑄琛，任承雨，許 旭，楊貽軻，王洪云，呂 佳，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

抗生素是用于預(yù)防和治療牲畜疾病，或通過加速牲畜生長而提高經(jīng)濟效益的藥物，已經(jīng)被廣泛用于畜牧產(chǎn)業(yè)[1]。目前自然界中大約存在200多種抗生素，根據(jù)其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能主要可分為氨基糖苷類、林可酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類等[2]，由于磺胺類和四環(huán)素類抗生素成本較低、效果較好而成為我國養(yǎng)殖領(lǐng)域使用最多的抗生素?？股氐臑E用會產(chǎn)生耐藥菌株，成為影響?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的安全隱患[3]。此外，抗生素濫用導(dǎo)致動物組織和動物源性食品中藥物殘留會對消費者的健康構(gòu)成潛在危害[4-6]。

近年來已經(jīng)在豬肉中檢測到多種抗生素殘留[7-9]。為了確保食品安全和人類健康，包括中國、歐美在內(nèi)的許多國家和組織均對豬肉中的抗生素最大殘留限量（maximum residue limits，MRLs）有明確規(guī)定[10-11]。目前，抗生素殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[12]、薄層色譜法[13]、液相色譜法[14]及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]等。其中，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有高靈敏度、高精確度、高通量的特點[18-20]，逐漸發(fā)展成為抗生素多殘留的主要確證技術(shù)。

有效的樣品前處理方法能夠提高樣品的檢測率和方法的靈敏度。QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）法因簡單、高效、成本低等特點，已經(jīng)廣泛用于抗生素多殘留檢測領(lǐng)域[21-24]，QuEchERS法中常用的凈化材料包括N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）及碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）等[25-27]，能夠?qū)崿F(xiàn)對大部分動物源性食品中抗生素多殘留的檢測。QuEChERS前處理技術(shù)對操作人員要求低、步驟簡單，但其基質(zhì)凈化過程主要通過限速、耗時的渦流和離心過程實現(xiàn)，且部分吸附劑存在材料團聚、分散性不足等問題[28-30]。

三聚氰胺海綿（melamine sponge，MeS）是由甲醛、三聚氰胺與亞硫酸氫鈉共聚而成，內(nèi)部為三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅孔隙率高、比表面積大，而且其微孔表面具有豐富的仲胺基，能通過修飾不同官能團作為不同功能化材料開發(fā)的活化位點[31-34]。此外，MeS理化性質(zhì)穩(wěn)定均一、成本低廉，且能在各種有機溶劑中保持良好的彈性和機械性能，在吸附與凈化方面顯示出較大的開發(fā)和應(yīng)用潛力。本課題組前期將其用于牛奶中抗生素多殘留凈化，研究結(jié)果表明其在牛奶基質(zhì)凈化中具有良好的吸附性能[35]。目前，在食品分析領(lǐng)域中基于MeS及其功能化改性材料的抗生素多殘留基質(zhì)凈化方法還鮮有報道。

本研究基于硅烷化MeS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），建立豬肉中同時檢測49 種抗生素的分析方法，以期為動物源食品中抗生素多殘留的快速分析及食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉 河南鄭州各大型超市及農(nóng)貿(mào)市場。

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國賽默飛公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純）、分散固相萃取吸附劑（dispersive solid phase extraction，d-SPE）（PSA、C18和GCB）上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸（色譜純）、十八烷基三氯硅烷（octadecyltrichlorosilane，OTS）、N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺（N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine，ATS）上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）、硫酸鈉（Na2SO4）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）（均為分析純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；QUICLEAR FQuECHERS-AOAC MFF 3202多功能針型過濾器（50 mg PSA、50 mg C18和150 mg MgSO4）天津阿爾塔科學(xué)有限公司；MeS 科林美高新材料有限公司；49 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺胍（sulfaguanidine，SGD）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STA）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺二甲基異噁唑（sulfisoxazole，SSX）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺氯吡嗪（sulfachloropyrazine，SPZ）、氨苯砜（dapsone，DAP）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQZ）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine，SM2）、磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、甲氧芐定（trimethoprim，TMP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDX）、磺胺二甲基異嘧啶（sulfisomidine，SID）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole，SPP）、琥珀?；前粪邕颍╯uccinylsulfathiazole，SST）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺甲氧噠嗪（sulfamethoxypyridazine，SMP）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、奧比沙星（orbifloxacin，ORB）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、萘啶酸（nalidixic acid，NA）、二氟沙星（difloxacin，DIF）、麻保沙星（marbofloxacin，MAR）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）、氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LU）、吡哌酸（pipemidic acid，PIP）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、氟羅沙星（fleroxacin，F(xiàn)LE）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、西諾沙星（cinoxacin，CIN）、司帕沙星（sparfloxacin，SPA）、噁喹酸（oxolinic acid，OXA）、交沙霉素（josamycin，JOS）、泰勒菌素（tylosin，TYL）、柱晶白霉素（kitasamycin，KIT）、洛硝噠唑（ronidazole，RON）、甲硝唑（metronidazole，MET）、二甲硝咪唑（dimetridazole，DMZ）、克林霉素（clindamycin，CLR）、雙氯青霉素（dicloxacillin，DIC）美國o2si公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290 Infinity II UPLC超高效液相色譜儀 美國Agilent公司；QTRAP 5500質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；JSM-7001F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）日本JEOL公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；ZGDCY-12干式氮吹儀上海梓桂儀器有限公司；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；SB-4200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ME204分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 硅烷化MeS的制備與表征

硅烷化MeS采用兩步溶膠-凝膠法制備[36]。將MeS剪裁成底部直徑為9 mm、高為3 mm的微型圓柱體，分別浸入含有不同種類硅烷試劑（OTS、ATS，10 mg/g）的甲苯溶液中振蕩30 min。將收集的海綿用甲苯洗滌數(shù)次，并置于120 ℃干燥1 h。將得到的硅烷化海綿分別表示為OTS@MeS和ATS@MeS。

將得到的OTS@MeS和ATS@MeS樣品剪切成薄片，鋪展在導(dǎo)電膠片上，噴金條件：20 mA，40 s。用SEM觀察不同放大倍數(shù)下的改性海綿微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2.0 μL；流動相A 為含有0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的甲醇-水溶液（5∶95，V/V），流動相B 為甲醇。流動相梯度洗脫程序：0～4 min，95%～55% A、5%～45% B；4～10 min，55%～10% A、45%～90% B；10～11 min，10% A、90% B；11～11.1 min，10%～95% A、90%～5% B；11.1～13.1 min，95% A、5% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI＋；離子掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：10.0 L/min；加熱氣流速：10.0 L/min；脫溶劑溫度：250 ℃；接口溫度：300 ℃；加熱氣溫度：400 ℃。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

49 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：分別準(zhǔn)確稱取49 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于－18 ℃冰箱保存。精密量取各化合物標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.5 mL置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋，配制成5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃冰箱冷藏保存。在實驗過程中根據(jù)需要精確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用初始流動相稀釋成所需質(zhì)量濃度。

1.3.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.5 g充分均質(zhì)的樣品于50 mL離心管中，加入1 mL水，渦旋混合0.5 min后，加入10 mL 1.0%乙酸-乙腈溶液，渦旋混合2 min；然后依次加入2.0 g Na2SO4和0.5 g NaCl，立即渦旋2 min，在4 ℃、8 000 r/min離心10 min。將OTS@MeS和ATS@MeS（2∶2，n/n）預(yù)先裝入2.5 mL注射筒中，然后取1 mL上清液于注射筒中，通過拉動、按壓注射器柱塞進行基質(zhì)凈化，凈化液用等量甲醇-水溶液（50∶50，V/V）稀釋后，用0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Analyst 1.6.3 軟件采集，用MultiQuantTM3.0軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、計算結(jié)果；圖表繪制采用Microsoft Excel 2013軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅烷化MeS的表征

如圖1所示，采用不同硅烷化試劑對海綿改性后，其微觀形貌發(fā)生顯著變化。MeS由纖維骨架相互交織而成，整體呈多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，硅烷化改性前其表面較光滑平整。相比之下，MeS通過OTS和ATS烷化改性，硅烷化試劑在海綿表面發(fā)生共聚反應(yīng)，海綿纖維骨架表面微觀形貌變得粗糙，所制備得到的OTS@MeS和ATS@MeS表面聚合物分別呈絨毛狀和泥狀。此外，采用移液槍滴加5 μL超純水至上述不同海綿表面觀察其親疏水性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)微液滴能夠緩慢浸潤未改性MeS，而在OTS@MeS和ATS@MeS表面均形成了良好的球形液滴且難以進入海綿內(nèi)部。改性后海綿表面疏水性發(fā)生改變，水滴在改性海綿界面上不能被親水吸附，因此在水的表面張力作用下形成球形液滴。以上實驗結(jié)果均表明成功制備的兩種硅烷化海綿具有與原始海綿不同的理化性質(zhì)。

圖1 未修飾MeS與硅烷化改性MeS的SEM圖Fig.1 SEM images of raw and silylated MeS

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過直接注射質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的單標(biāo)溶液，快速優(yōu)化MRM參數(shù)。分別將各標(biāo)準(zhǔn)溶液在全掃描模式下依次注入質(zhì)譜中進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有化合物在正離子（ESI＋）模式下，均能得到質(zhì)子化分子離子[M＋H]＋。雖然少數(shù)藥物還能得到[M＋Na]＋，但其[M＋H]＋強度更高且能產(chǎn)生更穩(wěn)定的碎片離子，因此，在ESI＋模式下選擇[M＋H]＋作為各種抗生素的母離子，將得到的母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇強度最高的2 個子離子分別作為定量離子和定性離子，優(yōu)化后MRM參數(shù)如表1所示。

表1 49 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 49 antibiotics

2.3 提取條件的優(yōu)化

適宜的提取條件是利用UPLC-MS/MS實現(xiàn)準(zhǔn)確、靈敏檢測多類抗生素的重要前提。本實驗分別對比和考察了以下4 種不同提取條件對回收率結(jié)果的影響：1）1 mL 0.5 mmol/L Na2EDTA溶液和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl；2）1 mL純水和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl；3）1 mL 0.5 mmol/L Na2EDTA溶液和10 mL乙腈，脫水劑為2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl；4）1 mL純水和10 mL乙腈溶液，脫水劑為2.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl。如圖2所示，通過對4 種提取條件下目標(biāo)化合物的回收率分布統(tǒng)計結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，組合2回收率處于80%～120%的目標(biāo)物數(shù)量最多且回收率小于60%的化合物數(shù)量最少，因此選擇組合2用于進一步提取條件的優(yōu)化。

圖2 提取條件對回收率的影響Fig.2 Effect of extraction condition on the recoveries of analytes

由于部分抗生素屬于兩性化合物，提取溶液的pH值可能會影響目標(biāo)物的存在狀態(tài)及其提取效率。本實驗比較了乙腈中不同乙酸添加量（0%、0.5%、1%、3%和5%，體積分數(shù)）對抗生素回收率分布的影響。如圖3所示，在提取溶劑中添加乙酸能夠明顯提高化合物的回收率，且當(dāng)乙酸添加量為1%時，抗生素回收率處于80%～120%理想?yún)^(qū)間的數(shù)目最多。當(dāng)持續(xù)提高乙酸添加量至1%以上時，回收率在80%～120%范圍內(nèi)的化合物數(shù)量逐漸減少。此外，過高的乙酸添加量會致使豬肉樣品在提取過程中出現(xiàn)結(jié)塊團聚現(xiàn)象而不利于抗生素的充分提取以及實驗結(jié)果的重現(xiàn)，這可能與豬肉中蛋白質(zhì)在較低pH值環(huán)境下會發(fā)生變性有關(guān)。

圖3 提取溶劑中乙酸的含量對回收率的影響Fig.3 Effect of acetic acid content on the recoveries of analytes

因此，綜合上述兩部分實驗結(jié)果，研究最終選擇1 mL純水和10 mL 1%乙酸-乙腈溶液作為提取溶劑，并用2.0 g無水Na2SO4和0.5 g NaCl作為脫水劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

2.4.1 硅烷化海綿配比優(yōu)化

OTS@MeS和ATS@MeS存在較大的理化性質(zhì)差異，其基質(zhì)凈化能力不同。基于此，研究考察2 種不同硅烷化海綿不同配比對基質(zhì)凈化效果的影響。以1 mL提取液為凈化對象，將不同數(shù)目的硅烷化海綿微柱預(yù)先裝入2.5 mL注射器中，通過抽拉注射器塞桿輔助完成對體積樣品溶液的“自發(fā)浸潤-物理擠壓”基質(zhì)分離過程。當(dāng)使用1 個或2 個海綿微柱時，浸入海綿內(nèi)部微孔的溶液體積均不足50%。當(dāng)填裝過多海綿微柱時（n≥5），頂部的海綿難以被提取液浸潤。同時放置4 個海綿微柱時，1 mL提取液能夠完全被吸入海綿微孔內(nèi)。因此，在后續(xù)凈化過程中，均選取海綿微柱數(shù)目為4。研究比較OTS@MeS與ATS@MeS不同用量比（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，n/n）對回收率分布的影響，并與未改性MeS進行對比。結(jié)果如圖4所示，MeS經(jīng)硅烷化改性后能顯著提高化合物的回收率，且OTS@MeS和ATS@MeS比例為2∶2和0∶4時，回收率在80%～120%的化合物數(shù)量最多。研究表明凈化吸附劑C18和PSA的使用可以有效降低豬肉樣品中磷脂含量，C18的除脂效果優(yōu)于PSA，且對磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸的去除效果好于磷脂酰膽堿，而聯(lián)合使用C18和PSA吸附劑能增加弱基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）（±20%）的化合物數(shù)量[37]。據(jù)此推測上述實驗結(jié)果與C18和PSA兩種吸附劑不同的基質(zhì)凈化選擇性相關(guān)。綜合考慮基質(zhì)凈化選擇性及回收率結(jié)果，選擇OTS@MeS和ATS@MeS配比為2∶2用于后續(xù)豬肉提取液基質(zhì)凈化。

圖4 不同MeS及其用量配比對回收率分布的影響Fig.4 Effect of MeS and mixtures of OTS@MeS and ATS@MeS in different proportions on the recoveries of analytes

2.4.2 動靜態(tài)凈化模式對比

MeS良好的機械性能和彈性可支持動態(tài)凈化和靜態(tài)凈化2 種模式。動態(tài)凈化是通過反復(fù)快速抽拉注射器塞桿加速基質(zhì)在提取液混合擴散，以達到高效吸附基質(zhì)的目的，屬于動力學(xué)行為；而靜態(tài)凈化則是將提取液吸取到注射器內(nèi)后，通過穩(wěn)態(tài)的自由擴散方式達到基質(zhì)吸附的目的，屬熱力學(xué)行為。本實驗比較了6 種凈化方式對回收率結(jié)果的影響：1）動態(tài)吸附1 次（1 cycle）；2）動態(tài)吸附3 次（3 cycle）；3）動態(tài)吸附5 次（5 cycle）；4）靜態(tài)吸附1 min（1 min）；5）靜態(tài)吸附5 min（5 min）；6）靜態(tài)吸附10 min（10 min）。如圖5所示，動靜態(tài)凈化模式下目標(biāo)化合物的回收率分布總體差異較小，除SMP外所有抗生素回收率均處于60%～120%之間，且動態(tài)吸附1 次處于80%～120%范圍內(nèi)化合物數(shù)量較多。分析比較6 種凈化方式相應(yīng)平均回收率（依次為89.0%、87.9%、88.6%、88.3%、84.8%和85.8%）可知，較長時間的靜態(tài)凈化（5 min和10 min）會降低所監(jiān)測抗生素的總體回收率。綜合考慮回收率結(jié)果和凈化速率，最終選擇快速動態(tài)吸附1 次作為基質(zhì)凈化模式。

圖5 不同凈化模式下吸附次數(shù)和靜置時間對回收率的影響Fig.5 Effect of number of adsorption times and standing time on the recoveries of analytes in different purification modes

2.5 方法驗證

2.5.1 線性范圍、ME、檢出限（limit of detection，LOD）及定量限（limit of quantitation，LOQ）

在1～400 μg/kg范圍內(nèi)配制49 種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示，49 種抗生素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，說明本實驗建立的方法具有良好的線性關(guān)系，能夠滿足定量分析的要求。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算目標(biāo)物的LOD和LOQ，49 種抗生素的LOD為0.1～10.0 μg/kg，LOQ為0.3～30.3 μg/kg。

表2 49 種抗生素的線性方程、相關(guān)性數(shù)、ME、LOD和LOQ及MRLTable 2 Calibration curve equations,correlation coefficients,matrix effects,LODs and LOQs for 49 antibiotics

當(dāng)使用UPLC-MS/MS檢測時，豬肉樣品中的干擾基質(zhì)會對化合物產(chǎn)生離子增強或抑制效應(yīng)，稱為ME。對每種化合物在豬肉種的ME進行評估，計算公式如下：

式中：ka和kb分別為目標(biāo)化合物在基質(zhì)匹配溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)線性方程的斜率。

一般而言，ME＝0表示不存在ME；ME在±20%范圍內(nèi)表示ME不顯著；ME＜－20%和ME＞20%則表示存在顯著基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)。如表2所示，經(jīng)2 種硅烷化海綿凈化后，所考察抗生素ME均不顯著（≤±20%）。除了SMP、PIP與OXA外，其余抗生素ME均在±10%以內(nèi)，這表明使用硅烷化MeS凈化可有效消除豬肉的ME。為獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，本實驗進一步采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進行定量分析。

2.5.2 加標(biāo)回收率及精密度

分別在低中高3 個加標(biāo)水平（10、100、200 μg/kg）向空白豬肉樣品中添加適量抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)濃度均進行日內(nèi)精密度實驗（重復(fù)6 次）和日間精密度實驗（連續(xù)3 d，每天重復(fù)3 次），計算方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。考慮到部分抗生素LOQ較高（≥10 μg/kg），SGD、SSX和SCP的低濃度加標(biāo)水平選定為15 μg/kg，DMZ的低濃度加標(biāo)水平選定為30 μg/kg，其他抗生素低濃度加標(biāo)水平均選定為10 μg/kg。如表3所示，49 種抗生素的加標(biāo)回收率均在65.0%～112.7%范圍內(nèi)，日內(nèi)RSD為0.3%～11.8%，日間RSD為2.4%～18.4%，均小于20%，證明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 49 種抗生素在豬肉加標(biāo)回收率及精密度Table 3 Spiked recoveries and precision of 49 antibiotics in pork%

2.5.3 材料對比

商業(yè)固相分散吸附劑如PSA、C18與GCB及其組合等是采用QuEChERS技術(shù)高效凈化動物源食品的常用凈化劑。在同等條件下，對比分析了所開發(fā)“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料與“PSA＋C18”組合以及“PSA＋C18＋GCB”組合吸附劑的凈化效果，加標(biāo)回收率對比結(jié)果如圖6所示。采用“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合時加標(biāo)回收率均處于60%～120%之間，且處于80%～120%區(qū)間的藥物數(shù)量最多。與“PSA＋C18”凈化組合相比（CIP 73.1%、NOR 78.1%、PEF 77.2%、ENO 69.4%），凈化海綿組合能夠顯著提升部分喹諾酮類藥物（CIP 83.4%、NOR 84.5、PEF 91.4%、ENO 81%）的加標(biāo)回收率?！癙SA＋C18＋GCB”組合用于基質(zhì)凈化時，大部分喹諾酮類獸藥的回收率顯著降低（＜60%）。這可能是喹諾酮類藥物分子中的芳香共軛平面結(jié)構(gòu)與GCB材料間的強吸附作用導(dǎo)致的。此外，通過ME進一步考察和對比了“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料與“PSA＋C18”組合吸附材料的凈化效果，除SMM（ME＝47%）外，上述2 種凈化吸附劑組合ME均不顯著（ME≤±20%）（圖7）。相比較而言，“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿組合材料對較多藥物具有輕微的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而“PSA＋C18”組合吸附材料呈現(xiàn)出輕微的基質(zhì)增強效應(yīng)。綜合而言，所開發(fā)“OTS@MeS＋ATS@MeS”凈化海綿材料具有同等甚至更優(yōu)的基質(zhì)凈化效果，且基質(zhì)分離過程方便快捷、無需離心等耗時環(huán)節(jié)，在豬肉抗生素多殘留分析中具有良好的適用性。

圖6 不同凈化材料對所監(jiān)測49 種抗生素藥物回收率分布的影響Fig.6 Influence of different sorbents on the recoveries of 49 antibiotics

圖7 不同凈化材料對所監(jiān)測49 種抗生素藥物ME的影響Fig.7 Influence of different sorbents on the ME of 49 antibiotics

2.5.4 實際樣品分析結(jié)果

應(yīng)用本實驗建立的方法對市場購買的36 份豬肉樣品進行檢測，結(jié)果均未檢測出抗生素殘留。

3 結(jié)論

本實驗將硅烷化MeS用于豬肉抗生素多殘留基質(zhì)凈化，通過比較不同提取條件、海綿用量配比及基質(zhì)凈化模式確定最佳前處理條件，建立了改良QuEChERS結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)檢測豬肉中49 種抗生素多殘留的快速分析方法。該方法用硅烷化MeS代替常規(guī)的基質(zhì)凈化材料，僅需簡單推拉注射器即可完成樣品凈化，能夠大大簡化前處理過程，縮短樣品前處理時間，實現(xiàn)大批量樣品的快速檢測。此外，該方法線性范圍廣、ME低、準(zhǔn)確度和精密度良好、靈敏度高、適用范圍廣，可用于豬肉中49 種抗生素多殘留的快速定量檢測。