人源分離長雙歧桿菌長亞種的體外益生特性分析

王明芳，陳麗瀾，張雪玲，田豐偉，倪永清,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

人體腸道菌群在整個生命活動過程處于動態(tài)變化，但是在生命早期最關(guān)鍵的2～3 歲嬰幼兒階段，腸道微生物逐漸趨于成人化，之后處于相對穩(wěn)定階段[1]。其中，隨著宿主年齡的變化，雙歧桿菌（Bifidobacterium）種群結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化[2]。在正常順產(chǎn)健康的母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道內(nèi)，由于母乳寡糖特殊的益生元功能[3]，以專性代謝各種母乳寡糖的兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、長雙歧桿菌長亞種（B.longumsubsp.longum）、長雙歧桿菌嬰兒亞種（B.longumsubsp.infantis）和短雙歧桿菌（B.breve）為優(yōu)勢雙歧桿菌種，被定義為“嬰兒型雙歧桿菌”[4]。而在成年化人腸道中，占主導(dǎo)地位的是B.longumsubsp.longum、青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、假小鏈雙歧桿菌（B.pseudocatenulatum）和鏈狀雙歧桿菌（B.catenulatum），被定義為“成人型雙歧桿菌”[5]。其中，B.longumsubsp.longum在嬰幼兒、成人甚至百歲老人腸道中普遍存在[6]。因此，就發(fā)生和母嬰間垂直傳遞來說，嬰兒和成人腸道雙歧桿菌的種類并沒有明確的界限[4]。實際上B.longumsubsp.longum在更寬泛年齡段人群的發(fā)生取決于其高度的遺傳多樣性和靈活的聚糖代謝能力，以及對宿主腸道多樣的飲食適應(yīng)性[7-8]。

數(shù)百萬年來，由于人類與以雙歧桿菌為代表的腸道專性共棲菌群的共生，這些腸道微生物譜系和人類相互適應(yīng)并形成了緊密的協(xié)同進化關(guān)系，被稱為共生體[9]。在人類的生產(chǎn)實踐中，人口大規(guī)模遷移往往伴隨著生活方式的周期性變化，主要反映在各個民族群體生存環(huán)境和飲食習(xí)慣的差異上[10]。腸道微生物的共生是建立在人類長期特色飲食中聚糖類化合物營養(yǎng)代謝的互惠關(guān)系[11]。此外，宿主的遺傳決定了母乳寡糖和腸道腸上皮黏液層糖蛋白的合成，從而使人類遺傳也會影響腸道重要共生細菌的多樣性和組成[12]。因此，人類飲食和遺傳差異將會對腸道微生物組成、物種組成甚至是菌株水平產(chǎn)生宿主的選擇性[13]?？梢灶A(yù)期不同民族來源的腸道菌群蘊含豐富的益生菌菌株資源。

目前報道顯示，B.longumsubsp.longum在治療胃腸道相關(guān)疾病、維持腸道微生物平衡、調(diào)節(jié)宿主免疫、緩解過敏癥狀以及抗感染等方面展現(xiàn)出卓越的益生特性，在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域作為潛在益生菌資源受到普遍關(guān)注[14]。本研究基于新疆地域?qū)拸V、各民族之間很少通婚的區(qū)域特點，針對新疆伊寧縣哈薩克族學(xué)齡兒童，對其糞便中雙歧桿菌進行分離鑒定，重點開展占優(yōu)勢的B.longumsubsp.longum菌株的耐酸、耐膽鹽能力、抑菌活性、抗生素耐藥性、體外抗氧化能力、碳水化合物代謝等體外益生特征實驗。從中篩選具有潛在益生特性的菌株，以期為后期體內(nèi)實驗開發(fā)適應(yīng)特定區(qū)域人群的高活性益生雙歧桿菌及產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

19 份哈薩克族學(xué)齡兒童糞便樣品采集自新疆維吾爾自治區(qū)伊寧縣某小學(xué)。提前聯(lián)系好志愿者，簽訂知情同意書，記錄志愿者年齡、性別、身高、體質(zhì)量和飲食習(xí)慣等基本信息。糞便采集前3 個月內(nèi)，兒童均未使用過抗生素，無益生菌攝入，無胃腸道疾病。采樣時，取樣人員戴無菌手套，用取樣勺采集糞便約5～10 g，糞便自采集后立即放入已滅菌的取樣管，貼標簽后置于車載冰箱－10 ℃冷藏，盡快運回實驗室進行菌種分離。

1.1.2 指示菌

抑菌實驗選用6 種常見致腹瀉的病原菌，分別為致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421、單核細胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754，均購自中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

TaqPlus Master Mix（2×）南京諾唯贊生物科技股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；Wilkins-Chalgren厭氧瓊脂培養(yǎng)基 山東拓普生物工程有限公司；改良MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基、胰胨大豆瓊脂（trypcasein soy agar，TSA）培養(yǎng)基北京博奧拓達科技有限公司；18 種碳源（純度≥90%）上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG520厭氧培養(yǎng)箱 英國DS公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；TC-512聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國Techne公司；PoerPac Universal水平電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 雙歧桿菌的分離鑒定

將l g新鮮糞便用9 mL無菌生理鹽水進行梯度稀釋，涂布于Wilkins-Chalgren固體培養(yǎng)基[15]，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，每個樣品選取30 個菌落，劃線培養(yǎng)3 次，鏡檢至純。菌株DNA的提取依據(jù)苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法進行[16]。提取好的DNA進行g(shù)roEL基因（表1）擴增[17]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到500 bp左右的清晰單一條帶。擴增產(chǎn)物送至江蘇金唯智生物有限公司進行測序，測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對（BLAST），比對相似值大于99%初步確定菌種物種。采用MEGA v7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.2B.longum亞種鑒定

對B.longum進行4 種母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）代謝基因（表1）擴增[18]，PCR條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性30 s，58 ℃（59 ℃）退火60 s，72 ℃延伸60 s，共進行30 個循環(huán)，最后68 ℃終延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。

1.3.3 rep-PCR指紋圖譜分析

采用通用引物BOXAIR、m13和(GTG)5（表1）對菌株進行重復(fù)性外源性回文聚合酶鏈反應(yīng)（repetitive exogenous palindrome polymerase chain reaction，rep-PCR）指紋圖譜分析[19-20]。PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s（(GTG)5為50 ℃），72 ℃延伸4 min，共進行35 個循環(huán)，最后72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。指紋圖譜使用GelCompar II v6.0軟件進行聚類。

1.3.4 雙歧桿菌益生特性分析

1.3.4.1 耐酸、耐膽鹽實驗

參照Tang Wei等[21]的方法并作適當改進，采用平板菌落計數(shù)法測定雙歧桿菌對酸和膽鹽的耐受性。分別配制普通MRS培養(yǎng)基和不同pH值（3.5和4.0）的MRS培養(yǎng)基，按照2%接種量將活化好的菌懸液分別接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中振蕩混勻，于厭氧工作站內(nèi)進行培養(yǎng)。分別在0 h和4 h測定接種于普通MRS培養(yǎng)基和不同pH值的MRS培養(yǎng)基中雙歧桿菌活菌數(shù)，進行3 次平行實驗。以相同的方法分別配制普通MRS培養(yǎng)基和不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)（0.1%和0.2%）的MRS培養(yǎng)基，接菌后厭氧培養(yǎng)，分別在0 h和2.5 h測定活菌數(shù)，進行3 次平行實驗。統(tǒng)計結(jié)果，按式（1）計算存活率：

式中：N1為不同pH值或膽鹽質(zhì)量分數(shù)處理后平板上的活菌數(shù)/（CFU/mL）；N為對照樣品中的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4.2 抑菌實驗

將活化后的雙歧桿菌按2%的接種量接種于添加0.5%L-半胱氨酸的改良MRS液體培養(yǎng)基[22]中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后將菌株發(fā)酵液離心（12 000×g，10 min，4 ℃），通過0.22 μm微孔濾膜過濾得到無細胞發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將指示菌株致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421分別接種于L B 液體培養(yǎng)基，單核細胞性李斯特菌CGMCC 1.9136接種于PYG液體培養(yǎng)基，血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754接種于TSA液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL指示菌懸液于無菌生理鹽水中梯度稀釋至濃度約為106～107CFU/mL。將稀釋液涂布于對應(yīng)固體培養(yǎng)基，向牛津杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，同時以不接菌的MRS培養(yǎng)基為空白對照。在4 ℃冰箱預(yù)擴散6 h后，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.3.4.3 藥敏實驗

抗生素藥敏實驗采用紙片瓊脂擴散法（K-B法）進行，吸取100 μL活化后濃度在107～108CFU/mL的雙歧桿菌菌懸液，使用無菌棉簽將其均勻涂布于MRS瓊脂平板表面，將藥片貼于其上，37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)48 h，檢測抑菌圈直徑，每種抗生素做3 個平行。16 種常用抗生素藥敏紙片中抗生素的含量分別為：青霉素（10 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、頭孢噻啶（30 μg/片）、利福平（5 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片）、萬古霉素（30 μg/片）、米洛環(huán)素（30 μg/片）、阿卡米星（30 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、鏈霉素（300 μg/片）、氨曲南（30 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、安西林（100 μg/片）。

1.3.4.4 體外抗氧化能力測定

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定：參照Kim等[23]的方法，將7 mmol/L ABTS工作液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液按照1∶1（V/V）混合均勻后避光放置12～16 h（室溫）。加入無水乙醇溶液調(diào)節(jié)ABTS工作液濃度，使得工作液在734 nm波長處的吸光度約為0.700±0.005。取待測樣品0.5 mL與調(diào)整好濃度的ABTS工作液3.0 mL混合均勻，室溫放置30 min后在734 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以等體積蒸餾水代替待測樣品，測其吸光度，計算方法如式（2）所示：

式中：A為樣品吸光度；Ac為空白組吸光度。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定：參照Zhao Li等[24]的方法并略作改進，取0.1 mmol/L DPPH自由基溶液4.0 mL于試管中，加入待測樣品2.0 mL和50%乙醇溶液1.0 mL，混勻后暗處避光反應(yīng)60 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液在517 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M以等體積蒸餾水代替待測樣品，測其吸光度，計算公式同式（2）。

1.3.4.5 碳水化合物代謝實驗

將活化后的雙歧桿菌按2%接種量接種于添加0.5%L-半胱氨酸鹽酸鹽的改良MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，無菌條件下離心（10 000×g，5 min，4 ℃）棄上清液，用無菌生理鹽水將菌體洗滌2 次后，重懸于1 mL生理鹽水中[25]。以2%的接種量將菌懸液接種到含有不同碳源（抗性淀粉、低聚木糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、D-(＋)-海藻糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、菊粉、果膠、麥芽糊精、D-(＋)-綿子糖、水蘇糖、木糖醇、甘露醇、聚葡萄糖、殼寡糖、L-山梨醇）的改良MRS液體培養(yǎng)基中，以葡萄糖為陽性對照，不添加碳源為陰性對照，測定0 h的OD600nm并記為OD1。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，測定OD600nm并記為OD2，最終OD600nm＝OD1－OD2。定義OD600nm＜0.15為不生長，OD600nm＝0.15～0.35為有限生長，OD600nm＞0.35為生長良好。實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Gel Compar II v6.0凝膠分析軟件進行指紋圖譜聚類分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MEGA v7.0軟件，熱圖的繪制采用TBtools軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌的分離與鑒定

經(jīng)groEL基因測序，19 份學(xué)齡兒童糞便樣本中共分離得到416 株雙歧桿菌，其中B.longum336 株、B.bifidum35 株、B.pseudocatenulatum14 株、B.catenulatum19 株、B.breve12 株。選取部分菌株groEL基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。雙歧桿菌分布在3 個大分支中，其中B.longum、B.bifidum和B.breve位于獨立的分支，B.pseudocatenulatum和B.catenulatum共同組成一個分支。

圖1 基于groEL基因序列雙歧桿菌代表菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of representative Bifidobacterium strains based on the groEL gene sequences

2.2 B.longum subsp.longum遺傳差異性分析

對B.longum進行HMOs基因擴增，凝膠電泳結(jié)果顯示均為B.longumsubsp.longum。根據(jù)rep-PCR指紋分型技術(shù)，從帶型相同的菌株中挑選2～4 個典型菌株，共得到27 株代表性菌株（表2），采用Gel Compar II軟件將3 種不同引物對應(yīng)的指紋圖譜進行聚類。由BOXAIRPCR、m13-PCR和(GTG)5-PCR指紋聚類圖（圖2）可見，B.longumsubsp.longum的指紋圖譜帶型豐富，遺傳多樣性較高。

圖2 基于rep-PCR擴增的27 株代表性B.longum subsp.longum的聚類圖Fig.2 Cluster map of 27 representative B.longum subsp.longum according to the genetic profiles obtained by rep-PCR

表2 篩選出的B.longum subsp.longum菌株及其宿主信息Table 2 Host information of selected strains of B.longum subsp.longum

2.3 益生特性分析

2.3.1 酸、膽鹽耐受性分析

如表3所示，厭氧培養(yǎng)4 h后，所有菌株在pH 4.0的MRS培養(yǎng)基中均能存活，且菌株2B33-3在pH 4.0的存活率達到170.83%；但菌株1B11-26、1B62-16、1B62-15和2B130-4在pH 3.5的MRS培養(yǎng)基中存活率低于0.0001%?？傮w而言，27 株B.longumsubsp.longum代表菌株均具有較強的耐酸能力，其中菌株2B3-21、2B13-5、2B33-3和1B68-16的耐受性最強。

表3 27 株B.longum subsp.longum代表菌株耐酸耐膽鹽存活率Table 3 Acid and bile tolerance of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

厭氧培養(yǎng)2.5 h后，實驗中所有B.longumsubsp.longum均能夠在添加0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中存活，菌株1B23-11的存活率最高，為81.81%，菌株2B13-5的存活率最低，為5.31%。當膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，菌株2B6-28的存活率低于0.0001%，菌株2B13-28的存活率最高，為64.05%。相對而言，菌株1B23-11、1B68-16、2B13-28和2B33-3的耐膽鹽能力最優(yōu)。

2.3.2 抑菌活性分析

采用牛津杯法檢測27 株B.longumsubsp.longum代表菌株對常見致腹瀉病原菌的抑菌活性，結(jié)果見表4。實驗菌株中有22 株B.longumsubsp.longum發(fā)酵上清液具有較好的抑菌性能，均可以抑制致瀉大腸埃希氏菌CICC 10411、出血性大腸埃希氏菌CICC 21530、鼠傷寒血清型腸沙門氏菌腸亞種CICC 10420、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌CICC 10421、單核細胞性李斯特菌CGMCC 1.9136、血清型腸炎沙門氏菌腸亞種CGMCC 1.10754，其中菌株1B68-16、2B13-5、2B33-3和1B39-2的抑菌能力較強。

表4 27 株B.longum subsp.longum代表菌株抑菌活性分析Table 4 Bacteriostatic activities of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

2.3.3 耐藥性分析

根據(jù)紙片瓊脂擴散法對27 株B.longumsubsp.longum代表菌株進行16 種抗生素抗性分析，從圖3可知，所有菌株對氨芐西林、利福平、米諾環(huán)素敏感，對安西林、卡那霉素、諾氟沙星、氨曲南、左氧氟沙星表現(xiàn)中敏或耐藥。14 株對頭孢噻肟敏感，20 株對青霉素敏感，21 株對四環(huán)素敏感，14 株對慶大霉素敏感，24 株對鏈霉素敏感，7 株對萬古霉素敏感。除菌株1B62-16對阿卡米星敏感，菌株1B23-11、2B130-3和1B5-4對苯唑西林敏感，其余菌株對以上兩種抗生素均表現(xiàn)中敏或耐藥?？傮w而言，菌株2B13-28、2B6-28、2B102-10對大多數(shù)抗生素耐藥。

圖3 27 株B.longum subsp.longum代表菌株抗生素耐藥性分析Fig.3 Antibiotic resistance of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

2.3.4 體外抗氧化能力分析

2.3.4.1 ABTS陽離子自由基清除能力

由圖4a可知，待測B.longumsubsp.longum無細胞提取物組對ABTS陽離子自由基清除率最高，13 株菌株的清除率高于80%，其中菌株2B25-16清除率最高，達到89.49%；菌株2B3-21清除率最低，為24.21%。發(fā)酵上清液組的ABTS陽離子自由基清除率略低于無細胞提取物組，其中菌株2B3-21的清除率最高，為84.4%；菌株1B63-15的清除率最低，為23.29%。而菌體細胞組對ABTS陽離子自由基清除水平最低，其中菌株2B33-3的清除率最高，為74.95%；菌株1B23-1清除率最低，為39.26%。綜上，待測菌株對ABTS陽離子自由基清除作用的代謝物可能主要存在于無細胞提取物中，菌株2B13-28、2B6-28、2B33-3和1B68-16對ABTS陽離子自由基總體清除效果較好。

2.3.4.2 DPPH自由基清除能力

由圖4b可知，待測B.longumsubsp.longum發(fā)酵上清液組對DPPH自由基清除率最高，除菌株1B63-15和2B3-6外，其余菌株的清除率均高于50%，其中菌株1B38-1清除率最高，達到91.81%。待測菌株無細胞提取物組的DPPH自由基清除率介于30%～80%之間，其中菌株2B13-28的清除率最高，為76.69%；菌株1B11-26的清除率最低，為30.79%。菌體細胞組對DPPH自由基清除水平體現(xiàn)了較大的菌株差異性，其中菌株1B38-1的清除率最高，為77.6%，其次是菌株1B68-16，其余菌株的清除率均低于70%。菌株1B13-11的清除率最低，為20.9%。綜上，待測菌株對DPPH自由基清除作用的代謝物可能主要存在于發(fā)酵上清液中，菌株1B38-1、2B33-3、1B68-16和2B13-28對DPPH自由基總體清除效果較好。

2.3.5 碳水化合物代謝分析

B.longumsubsp.longum能利用多種宿主與飲食來源的聚糖是其在不同年齡段人群腸道內(nèi)均能定植的主要因素之一。本研究選取18 種植物源聚糖對27 株B.longumsubsp.longum進行糖發(fā)酵實驗，碳源代謝結(jié)果使用TBtools軟件繪制熱圖并聚類（圖5）。受試菌株中，15 株能有效利用低聚果糖，16 株能有效利用低聚異麥芽糖，17 株能有效利用大豆低聚糖，8 株能很好地利用菊粉，10 株能有效利用蘋果果膠，17 株能有效利用棉子糖，18 株有效利用麥芽糊精，17 株有效利用水蘇糖，9 株有效利用聚葡萄糖，10 株有效利用殼寡糖。除菌株1B3-21外，其余菌株都不能有效利用木糖醇。相反，除菌株1B11-26外，其余26 株菌株都能很好地利用低聚半乳糖。菌株1B38-1和2B130-3能有效利用抗性淀粉，菌株1B5-4、1B39-2、1B63-15和2B102-10能有效利用低聚木糖，菌株1B38-1、2B130-3、2B130-4、1B13-11和1B3-21能有效利用D-海藻糖，菌株2B102-3、1B23-11、1B13-11、2B6-28和2B17-16能很好地利用甘露糖醇和L-山梨糖。

圖5 27 株代表性B.longum subsp.longum碳水化合物代謝譜的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of carbohydrate utilization profiles of 27 representative strains of B.longum subsp.longum

3 討論與結(jié)論

針對新疆少數(shù)民族腸道雙歧桿菌的研究前期主要集中在母嬰群體的差異性方面，課題組從新疆維吾爾族嬰幼兒糞便中分離得到雙歧桿菌B.longumsubsp.infantis、B.longumsubsp.suis、B.bifidum、B.pseudocatenulatum、B.adolescentis[26]；從另一組維吾爾族母嬰腸道中分離到雙歧桿菌B.longumsubsp.longum、B.pseudolongum、B.breve、B.animalsubsp.lactis[27-28]。根據(jù)文獻報道，大部分母乳喂養(yǎng)、順產(chǎn)的嬰幼兒以嬰兒型雙歧桿菌為主，在成人化的學(xué)齡兒童中B.longumsubsp.longum是最常見的種，在一部分兒童中有報道以B.breve為優(yōu)勢種[2]；除此之外，學(xué)齡兒童成人型雙歧桿菌的頻繁分離，顯示“嬰兒型雙歧桿菌”與“成人型雙歧桿菌”只有相對豐度差異，沒有明確的年齡界限[29]，很可能雙歧桿菌菌群結(jié)構(gòu)的演變需要更長的時間。同時，本研究基于BOXAIR、m13和(GTG)53 種rep-PCR指紋分型技術(shù)的遺傳差異研究顯示，所有B.longumsubsp.longum菌株分型聚類共獲得27 種基因型，顯示了高度的遺傳多樣性。不僅揭示了不同個體腸道內(nèi)B.longumsubsp.longum菌株遺傳差異，同時發(fā)現(xiàn)來自同一個體有多個菌株基因型現(xiàn)象存在，例如來自同一個體的菌株2B3-6和2B3-21，這表明人類個體在有限的時間內(nèi)雙歧桿菌同種腸道細菌群體遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)進化的動態(tài)變化特征和遺傳多態(tài)性，這和擬桿菌等其他細菌的報道[6-7,30]相一致，但仍需要開展更深入、全面的研究。這對于揭示以雙歧桿菌為代表的益生菌理論的認識和拓展目前僅認為益生特性是菌株特異性的有限認知很有必要[9,31-33]。

B.longumsubsp.longum在人體胃腸道定植過程中會受到酸、膽鹽、各種消化酶、宿主免疫以及腸道內(nèi)其他微生物和抗生素的影響[34-35]。然而，B.longumsubsp.longum通過對宿主源以及植物源多糖的競爭優(yōu)勢成功定植于不同年齡段人群胃腸道中，并保持極高的豐度[8]。Wei Yanxia等[34]對B.longum進行pH 3.5耐受性測試，結(jié)果顯示存活率在30%～60%。本研究受試菌株的耐酸耐膽鹽能力較強，個別菌株在低pH值和較高膽鹽質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)液中的存活率可分別達到170.83%、81.81%。趙志霞等[28]從母乳中分離得到的所有雙歧桿菌都對產(chǎn)腸毒大腸埃希氏菌有較強的抑菌能力，50%的菌株對出血性大腸埃希氏菌抑菌能力較強。本研究抑菌活性分析結(jié)果表明，所有受試菌株都對出血性大腸埃希氏菌和鼠傷寒血清型腸沙門氏菌表現(xiàn)出抑菌活性。有研究表明，B.longumsubsp.longum對氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素表現(xiàn)出耐藥[24]。此外，本研究耐藥分析結(jié)果表明受試菌株對β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素表現(xiàn)敏感。體外抗氧化能力分析結(jié)果表明，菌株的無細胞提取物對ABTS陽離子自由基清除能力最強，發(fā)酵上清液對DPPH自由基清除率最高，與其他研究結(jié)果[24]一致。B.longumsubsp.longum除了可以有效利用HMOs外，還能代謝多種植物源寡糖和聚糖，例如半纖維素和果膠[3,36-38]。本實驗中除菌株1B62-15外，受試菌株都能有效利用多種植物源聚糖。

本研究對哈薩克族學(xué)齡兒童腸道雙歧桿菌進行分離鑒定，通過基因型和表型相結(jié)合的方法對B.longumsubsp.longum代表性菌株進行分析后發(fā)現(xiàn)，菌株1B68-16和2B33-3可作為潛在益生菌菌株進行后期體內(nèi)益生特性研究。