基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的作用機制*

陳雅桐，賀紅安，周 旭，張葆青△

1 山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014； 2 山東中醫(yī)藥大學博士后流動站，山東 濟南 250355；3 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

腺樣體肥大是兒科、耳鼻喉科的臨床常見病。中醫(yī)認為該病屬“頏顙”“鼾證”等范疇，臨床以鼻塞、打鼾為主癥，可伴見聽力下降、注意力不集中、認知障礙等癥狀，日久不愈甚至并發(fā)化膿性中耳炎、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等疾病，嚴重危害患兒的身體健康［1］。西醫(yī)治療本病的保守治療常予生理鹽水局部沖洗、抗感染藥物、鼻噴霧激素等治療，但臨床收效欠佳，易反復發(fā)作。手術(shù)治療是目前最主要的治療手段，但也存在切除不徹底、鼻咽狹窄、鼻咽功能不全、術(shù)后易復發(fā)等問題。中醫(yī)治療本病，療效明顯且持久，副作用小，具有明顯的優(yōu)勢，可供臨床醫(yī)家的借鑒及運用。

柴胡桂枝干姜湯最早載于《傷寒論》，由柴胡、桂枝、干姜、黃芩、牡蠣、反蔞根、甘草組成。全方配伍上寒熱并用、苦辛通降，集清熱、化痰、散結(jié)、溫陽于一體，專為治療腺樣體肥大諸類少陽病兼痰結(jié)而設(shè)。劉渡舟教授概括腺樣體肥大的病機為“少陽膽熱、太陰脾寒”，臨床上使用柴胡桂枝干姜湯治療呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等凡是以“膽熱脾寒”為核心病機的疾病，均取得了良好的療效［2］。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法來系統(tǒng)性地探究柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的相關(guān)作用機制，為指導臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 柴胡桂枝干姜湯有效化合物及作用靶點篩選及檢索通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicinesystems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索柴胡、桂枝、干姜、黃芩、瓜蔞根的化合物，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（druglikeness，DL）藥物半衰期（drug half-life，HL），設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h篩選出符合條件的候選化合物并獲得其對應(yīng)的潛在靶點信息，除去沒有靶點及重合的成分。通過BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫檢索牡蠣、炙甘草的化合物及其作用靶點，將有效化合物對應(yīng)基因進行整理。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB 搜索功能，設(shè)定物種為人，將所得到的靶點全部校正為基因名，以解決藥物靶點存在的名稱不規(guī)范問題，利于進一步的與疾病靶點進行匹配。

1.2 疾病靶點的檢索與預測以腺樣體肥大（adenoid hypertrophy）為關(guān)鍵詞，運用Genecards 數(shù)據(jù)庫（https：//www，genecards.org）獲取疾病的相關(guān)靶點與基因。

1.3 藥物與疾病靶點的匹配運用Cytoscape軟件，構(gòu)建柴胡桂枝干姜湯“化合物-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。利用VENNY圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將柴胡桂枝干姜湯有效成分的靶點與疾病靶點進行映射，得到柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的相關(guān)靶點。

1.4 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)將疾病與藥物的匹配靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，以獲取蛋白之間的相互作用關(guān)系，再使用Cytoscape 3.7.2 繪制關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因功能及作用通路分析運用David 數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對交集靶點進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析，包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分析，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進行生物通路分析，以闡明柴胡桂枝干姜湯對腺樣體肥大的關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果

2.1 柴胡桂枝干姜湯有效化合物篩選借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為篩選條件，篩選出柴胡、桂枝、干姜、黃芩、瓜蔞根符合條件的候選化合物，運用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選出牡蠣、炙甘草符合條件的候選化合物，總共篩選出65 個候選化合物，其中柴胡13 個，桂枝6 個，干姜5 個，黃芩31 個，瓜蔞根2 個，牡蠣5 個，炙甘草3個。柴胡與麻黃芩共有的活性成分有1個，桂枝與黃芩共有的活性成分有3 個，桂枝與干姜共有的活性成分有2個，見表1。

表1 柴胡桂枝干姜湯中候選化合物相關(guān)信息

2.2 柴胡桂枝干姜湯有效活性成分的作用靶點借助TCMSP、Uniprot、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫，共得到柴胡、桂枝、干姜、黃芩、牡蠣、瓜蔞根、炙甘草的作用靶點288個，并轉(zhuǎn)化為基因。

2.3 腺樣體肥大的相關(guān)靶點運用Genecards數(shù)據(jù)庫獲取腺樣體肥大的相關(guān)靶點，處理后得到781 個。

2.4 藥物與疾病靶點的匹配將柴胡、桂枝、干姜、黃芩、牡蠣、瓜蔞根、炙甘草的作用靶點基因與疾病的靶點基因上傳到Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建柴胡桂枝干姜湯“化合物-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。其中淺綠色圓形代表藥物，深綠色菱形代表藥物的靶點基因，紅色、灰色、藍色、粉色、紫色、橘黃色、淡藍色八邊形代表化合物，深藍色六邊形代表桂枝和干姜、黃芩的共有化合物，黃色六邊形代表柴胡和黃芩共有化合物，玫紅色六邊形代表桂枝和黃芩共有化合物，每條邊表示化合物與藥物靶點之間的關(guān)系，Degree 越大說明化合物與靶點之間的關(guān)系越密切。其中，櫟精、β-谷甾醇、堪非醇、豆甾醇、18β-甘草次酸、漢黃芩素、黃芩素等化合物與多個藥物靶點相互作用，而PTGS1、PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PRKACA、AR 等靶點作用于多個化合物有效成分。利用VENNY 圖將柴胡桂枝干姜湯有效成分的基因與疾病的基因進行匹配，得到共有基因118 個，分別為PTGS1、PTGS2、NCOA2、PGR、PLAU、HTR2A、NOS2、ESR1、AR、PPARG、ESR2、MAPK14、GSK3B、HSP90AB1、CDK2、PIK3CG、PIM1、CCNA2、CHEK1、NOS3、RELA、IKBKB、AKT1、BCL2、BAX、TNF、JUN、CASP3、MAPK8、MMP1、STAT1、CDK1、CYP3A4、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、CYP1B1、ALOX5、GSTP1、AHR、GSTM1、MMP3、EGFR、VEGFA、CCND1、BCL2L1、FOS、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL-10、EGF、RB1、I-L6、TP53、ELK1、NFKBIA、ODC1、CASP8、TOP1、RAF1、SOD1、HIF1A、HSPA5、ERBB2、CAV1、MYC、GJA1、IL-1B、CCL2、CXCL8、BIRC5、HSPB1、TGFB1、IL-2、CCNB1、PLAT、IFNG、PTEN、IL1A、MPO、NFE2L2、NQO1、PARP1、CRP、CHUK、SPP1、RUNX2、RASSF1、E2F1、ACP3、CTSD、IGFBP3、IGF2、CD40LG、ERBB3、SLC6A4、LACTB、APOB、FASN、FASLG、CYP19A1、KDR、PRKCD、FN1、MCL1、CYCS、ALOX12、DMTN、SLC12A2、NR3C1、SRD5A1、CYP17A1、SHBG、IL-4。見圖2。

圖1 “化合物—靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 柴胡桂枝干姜湯與腺樣體肥大交集靶點韋恩圖

2.5 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)此網(wǎng)絡(luò)圖共包括關(guān)鍵節(jié)點118 個，Degree 的大小與節(jié)點的大小成正比，節(jié)點越大表示蛋白與蛋白之間的相互作用越大。結(jié)果如圖所示，柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的靶點按Degree 值排名依次為細胞腫瘤抗原p53（TP53）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子a（VEGFA）、caspase-3（CASP3）、轉(zhuǎn)錄因子ap-1（JUN）、白細胞介素6（IL-6）、myc 原癌基因蛋白質(zhì)（MYC）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體蛋白（ESR1）等，這些蛋白的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，可作為柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的核心靶點進行進一步研究，見圖3。

圖3 柴胡桂枝干姜湯“蛋白-蛋白相互作用”網(wǎng)絡(luò)示意圖（PPI網(wǎng)絡(luò)）

通過將藥物與疾病的交集靶點上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫來獲得相應(yīng)的人源蛋白。并將從STRING 數(shù)據(jù)庫中獲取的TSV 格式文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，其中分子、靶蛋白以“節(jié)點”（node）表示，靶點與藥物成分之間的關(guān)系以“邊”（edge）表示。見圖4。

圖4 柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 基因功能及作用通路分析將118 個共有基因上傳至David 數(shù)據(jù)庫中的基因列表，標識碼為OFFICIAL GENE SYMBOL，清單類型為基因表，將物種設(shè)定為“Homo sapiens”，對關(guān)鍵基因進行GO 富集及KEGG 通路分析，確定GO 富集主要涉及597 個生物學過程（biological process，BP），60個細胞成分（cellular component，CC）和106 個分子功能（Molecular Function，MF）。將GO 富集按P 值大小進行排序，其中BP 排名前10 的條目為凋亡過程的負調(diào)節(jié)、對藥物的反應(yīng)、基因表達的正調(diào)節(jié)、來自RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、衰老、無配體時的外源性凋亡信號通路、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、DNA 模板化、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、細胞增殖的正調(diào)節(jié)、凋亡過程；CC排名前10的條目為細胞外間隙、胞質(zhì)、線粒體、細胞核、細胞外區(qū)、膜、筏、核質(zhì)、細胞質(zhì)；MF排名前10的條目為酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、細胞因子活性、蛋白激酶活性、類固醇結(jié)合、血紅素結(jié)合。分別取排名前20的條目作圖，見圖5。

圖5 柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大GO富集分析柱形圖

KEGG 通路富集分析主要涉及112 條通路，根據(jù)P值進行排序，取排名前20 的通路繪圖，見圖6。研究顯示，腫瘤相關(guān)通路主要涉及癌癥中的途徑、hsa05215：前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、小細胞肺癌等疾?。徽{(diào)控細胞周期相關(guān)通路主要涉及細胞凋亡等；病毒感染相關(guān)通路主要涉及乙型肝炎、甲型流感等疾病；免疫炎癥相關(guān)通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路等，以上表明柴胡桂枝干姜湯主要通過抗腫瘤、抗病毒、調(diào)控細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫及炎癥因子水平等途徑起到治療作用。

圖6 柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

腺樣體病理性增生的病因主要包括以下幾點：1）腺樣體在兒童時期生長旺盛，兒童營養(yǎng)缺乏、抵抗力不足、寒冷刺激等引起的多種炎癥可致其出現(xiàn)病理性肥大［3］；2）鼻炎、鼻竇炎時分泌物增多后流，刺激鼻咽后壁使腺樣體肥大［4］；3）過敏及環(huán)境污染同樣可造成腺樣體肥大［5］。外科切除是目前西醫(yī)治療的主要手段，但腺樣體具有免疫作用，且兒童時期局部免疫組織起主導作用，不宜過早切除［6］。研究證實，患兒行腺樣體切除術(shù)1個月后的血清免疫球蛋白水平顯著下降，對免疫功能造成負面影響［7］。

腺樣體肥大屬于中醫(yī)學“鼾證”范疇，臨床癥狀纏綿難愈，病因包括外因和內(nèi)因，外因多是感受外邪，而內(nèi)因多是肺、脾、腎虧虛與飲食內(nèi)傷［8］。病機多從痰熱、瘀熱互結(jié)，痰濕結(jié)聚，寒熱互結(jié)，虛實夾雜論治［9-12］。臨床常見腺樣體肥大患兒，多數(shù)有長期濫用抗生素和過服清熱解毒類藥物的病史，因小兒脾常不足，加之藥物損傷脾陽，故脾失健運，津液轉(zhuǎn)輸不及，聚濕成痰，而小兒又為純陽之體，痰飲郁而化熱，隨少陽膽經(jīng)上犯，其基本病機可概括為少陽郁熱，太陰虛寒［13］。柴胡桂枝干姜湯中柴胡、黃芩清瀉膽經(jīng)實熱，疏利少陽樞機；桂枝、干姜、炙甘草溫補脾陽以制脾虛生濕［14］；其功效與腺樣體肥大的病機相切合，除此之外，瓜蔞根、牡蠣還可清熱瀉火，化痰散結(jié)［15］，二藥合用既能除少陽郁熱，促進膿涕排出，又有助于腺樣體縮小。

本次網(wǎng)絡(luò)藥理學研究首先在TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺研究了柴胡桂枝干姜湯（柴胡、桂枝、干姜、黃芩、瓜蔞根、牡蠣、炙甘草）中的有效成分和作用靶點，通過化合物-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示：櫟精、β-谷甾醇、堪非醇、豆甾醇、18β-甘草次酸、漢黃芩素、黃芩素是柴胡桂枝干姜湯最主要的有效化合物，PTGS1、PTGS2、HSP90AB1、NCOA2、PRKACA 是最主要的靶蛋白。在化合物中櫟精是與藥物靶點相互作用最多的活性成分，具有較強的抗菌、抗腫瘤、抗病毒作用；其次，β-谷甾醇、堪非醇、黃芩素等活性成分均具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用［16-17］，以上多種化合物相互協(xié)同可通過關(guān)鍵靶蛋白治療腺樣體肥大。

柴胡桂枝干姜湯主要通過細胞腫瘤抗原p53（TP53）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1 中JUN、白細胞介素6（interleukin，IL-6）等靶點作用于腺樣體肥大。IL-6由活化的T細胞產(chǎn)生，水平正常時參與免疫反應(yīng)，當水平過高時參與炎癥反應(yīng)，且在反應(yīng)中發(fā)揮核心作用［18］。研究顯示，IL-6隨著腺樣體肥大的程度而升高，提示IL-6的大量釋放易造成腺樣體的炎癥損害及免疫異常［19］。VEGF 是一種多功能細胞生長因子，其作用為加速新血管形成，以改善血供來緩解組織缺氧，實驗顯示，相較于正常及輕度腺樣體肥大患者，缺氧情況較重的中、重度腺樣體肥大患者的VEGF 水平明顯升高［20］。由此可見，腺樣體的病理性增生與炎癥、低氧有著密不可分的關(guān)系，因此通過作用于靶點來降低IL-6、VEGF 水平對治療該病具有重要臨床意義。

根據(jù)GO 富集分析顯示柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的生物學過程主要體現(xiàn)在凋亡過程的負調(diào)節(jié)、對藥物的反應(yīng)、基因表達的正調(diào)節(jié)等方面。實驗發(fā)現(xiàn)，低氧可延遲T 細胞凋亡，腺樣體肥大并發(fā)阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者的CD4+/CD8+T 細胞比值高于正常及輕度患者，揭示免疫細胞凋亡紊亂加重腺樣體增生［21-22］。KEGG 通路主要涉及TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、T細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路等。TNF 主要由激活的巨噬細胞產(chǎn)生，可促進炎癥反應(yīng)發(fā)生，腺樣體肥大患兒TNF-α 的血清濃度較正常明顯升高，且血清濃度越高，其腺樣體肥大程度越重［23］，結(jié)合KEGG通路分析顯示，作用于TNF信號通路可抑制TNF-α 在腺樣體中的高表達。近年來研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K 通路可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而緩解學習記憶的主要功能性腦區(qū)海馬因低氧造成的神經(jīng)細胞損傷，進而改善學習困難、注意力欠集中等癥狀［24］。綜上，柴胡桂枝干姜湯正是通過多靶點多通路來治療腺樣體肥大的。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的作用機制進行了初步分析，預測柴胡桂枝干姜湯中有效活性成分（櫟精、18β-甘草次酸、黃芩素等）通過PTGS1、PTGS2、HSP90AB1 等藥物靶點發(fā)揮抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等作用。通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵靶點（TP53、VEGFA、CASP3、IL-6）的表達，調(diào)節(jié)細胞凋亡等生物學過程，最終通過作用于相關(guān)通路（TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路等），抑制由炎癥細胞因子造成的炎癥反應(yīng)，維持人體正常免疫功能，抗氧化應(yīng)激，改善血供，緩解缺氧，達到治療腺樣體肥大的目的。本研究從微觀角度探討了柴胡桂枝干姜湯治療腺樣體肥大的作用機制，旨在為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)的生物信息學支撐，后續(xù)可進一步進行實驗驗證以指導臨床。