麻黃附子細(xì)辛湯治療緩慢性心律失常的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制*

馬春麗，于 藝，遲倩慧，張 蕾，劉 穎

山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300

緩慢性心律失常（bradyarrhythmia，BA）是以心率減慢為特點(diǎn)的心血管疾病，分為竇性緩慢性心律失常、房室交界性心率、心室自主心律、傳導(dǎo)阻滯，臨床上常見于竇性心動(dòng)過緩、病態(tài)竇房結(jié)綜合征［1］。BA 病因形成復(fù)雜，主要原因是其沖動(dòng)形成異常和傳導(dǎo)異常［2］。其癥狀主要表現(xiàn)為長時(shí)間的心動(dòng)過緩所引起的臟器供血不足，通常會(huì)引起心絞痛、冠心病、心功能障礙等疾?。?］。

麻黃附子細(xì)辛湯出自張仲景《傷寒雜病論》，由麻黃、附子、細(xì)辛等3 味藥組成，其用量為麻黃、細(xì)辛各二兩，制附子一枚，常用于治療少陰感寒癥。近代醫(yī)家在繼承仲景之志的基礎(chǔ)上提出治療心血管疾病的原則是溫陽通氣，方中附子辛甘大熱，通行十二經(jīng)之陽氣，麻黃與附子同用，既散表寒又逐里寒，加之辛溫發(fā)散的細(xì)辛，補(bǔ)散兼施，共奏溫陽散寒之效。

1 資料與方法

1.1 麻黃、附子、細(xì)辛化合物及作用靶點(diǎn)、相應(yīng)基因的檢索與篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索麻黃、附子、細(xì)辛的化合物，再根據(jù)生物利用度（oral bioavailability OB）≥30%、類藥性（drug-likeness DL）≥0.18、半衰期（Half Life HL）≥4 h，篩選出符合條件的候選化合物及相應(yīng)的靶點(diǎn)信息。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB 搜索功能，將物種設(shè)定為人，將所得到的靶點(diǎn)全部校正為基因名。

1.2 BA 相關(guān)靶點(diǎn)的檢索以bradyarrhythmia為關(guān)鍵詞，運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www，genecards.org）獲取疾病的相關(guān)靶點(diǎn)與基因，去除重復(fù)值，得到BA相關(guān)靶點(diǎn)基因的數(shù)據(jù)庫。

1.3 構(gòu)建“麻黃附子細(xì)辛湯-化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖利用Venny 圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將麻黃附子細(xì)辛湯有效成分的靶點(diǎn)基因與疾病的靶點(diǎn)基因取交集，得到麻黃附子細(xì)辛湯與BA 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。運(yùn)用Cytoscape 軟件，構(gòu)建“麻黃附子細(xì)辛湯-BA-化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，分析得出麻黃附子細(xì)辛湯治療BA的作用機(jī)制。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)將疾病與藥物的共有關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為“人”，以獲取蛋白之間的相互作用關(guān)系，下載結(jié)果中的TSV格式文檔，摘取其中的node1、node2 和combined score 列數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理，利用Cytoscape 3.6.2軟件繪制關(guān)鍵靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)degree 值找出關(guān)鍵靶點(diǎn)，以獲取蛋白之間的相互作用關(guān)系。

1.5 基因功能及作用通路分析為了進(jìn)一步說明與中藥化合物對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在基因功能和作用通路中的作用，運(yùn)用David 數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對(duì)疾病與藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 生物通路分析，標(biāo)識(shí)符選擇OFFICIAL GENE SYMBOL，列表類型選擇基因表，選擇物種為“Homo species”，將閾值設(shè)定為P＜0.05，篩選排名靠前的生物過程和通路，并繪制barplot柱狀圖和圖表，闡明麻黃附子細(xì)辛湯治療BA的基因功能和關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果

2.1 麻黃附子細(xì)辛湯藥物活性成分借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合條件的候選化合物共52 個(gè)，其中麻黃23個(gè)，附子21個(gè)，細(xì)辛8個(gè)。除去無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)后剩余主要活性成分36 個(gè)，其中麻黃的活性成分有22個(gè)，附子的活性成分有7 個(gè)，細(xì)辛的活性成分有8個(gè)，細(xì)辛與麻黃共有的活性成分有1個(gè)。見附表1。

表1 大黃附子細(xì)辛湯抗BA KEGG通路富集分析

表2 麻黃附子細(xì)辛湯候選化合物相關(guān)信息

2.2 麻黃附子細(xì)辛湯活性成分的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)借助TCMSP、Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲取麻黃附子細(xì)辛湯的作用靶點(diǎn)并去除重復(fù)值，共得到麻黃、附子、細(xì)辛的作用靶點(diǎn)229個(gè)，并轉(zhuǎn)化為基因。

2.3 BA的相關(guān)靶點(diǎn)運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取BA的相關(guān)靶點(diǎn)，去除重復(fù)及人沒有的后得到595個(gè)。利用Venny 圖將麻黃附子細(xì)辛湯中的作用靶點(diǎn)與BA的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)65個(gè)，見圖1。

圖1 麻黃附子細(xì)辛湯與BA交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “麻黃附子細(xì)辛湯-化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖將麻黃附子細(xì)辛湯的作用靶點(diǎn)基因的靶點(diǎn)基因上傳到Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“麻黃附子細(xì)辛湯-化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。其中淺綠色圓形代表藥物，深綠色菱形代表藥物的靶點(diǎn)基因，粉色、黃色、藍(lán)色六邊形代表化合物，紫色六邊形代表麻黃和細(xì)辛共有化合物，每條邊表示化合物與藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系，degree 越大說明化合物與靶點(diǎn)之間的關(guān)系越密切。其中排名前四的化合物為槲皮苷，山柰酚，木犀草素，多根烏頭堿，說明這些化合物可能是麻黃附子細(xì)辛湯治療緩慢性心律失常的關(guān)鍵化合物，而degree 值排名前5 的靶點(diǎn)為PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4，作用于多個(gè)化合物有效成分，體現(xiàn)了麻黃附子細(xì)辛湯治療BA 中多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，見圖2。

圖2 “麻黃附子細(xì)辛湯-化合物-靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)將藥物與疾病的65 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，獲得相應(yīng)人源蛋白。并將從STRING 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出的文件中的node1、node2 和Combined score 信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以探究麻黃細(xì)辛附子湯的藥理學(xué)作用機(jī)制，其中“節(jié)點(diǎn)”（node）表示分子、靶蛋白，“邊”（edge）表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。見圖3。此網(wǎng)絡(luò)圖共包括關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)65個(gè)，Degree越大，其節(jié)點(diǎn)越大，蛋白與蛋白之間的作用越大。結(jié)果表明麻黃附子細(xì)辛湯治療BA 的靶標(biāo)中，degree值排前十的為IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-1B、FOS、NOS3、IL-10、CAT、ICAM1。見圖4。

圖3 麻黃附子細(xì)辛湯抗BA網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 麻黃附子細(xì)辛湯-緩慢性心律失常的PPI網(wǎng)絡(luò)示意圖

2.6 基因功能及作用通路分析將65 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David 數(shù)據(jù)庫中的基因列表，標(biāo)識(shí)碼為OFFICIAL GENE SYMBOL，清單類型為基因表，選擇物種為“Homo sapiens”，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 富集及KEGG 通路分析，GO 富集主要涉及100 個(gè)生物學(xué)過程（biological process，BP），14 個(gè)細(xì)胞組成（cellular component，CC）和15 個(gè)分子功能（molecular function，MF）。將GO 富集按P值大小進(jìn)行排序，其中BP排名前20的條目為腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G-蛋白耦合受體信號(hào)通路、細(xì)胞信號(hào)、氧化還原過程、過氧化氫生物合成過程、免疫反應(yīng)、膜蛋白外膜蛋白的正調(diào)控、宿主共生體生長的負(fù)調(diào)控、通過死亡域受體對(duì)外在凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、正調(diào)控平滑肌收縮、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、血管收縮的正向調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、正調(diào)控鈣化二醇1-單氧合酶活性，CC 排名前十的條目為細(xì)胞外隙、等離子膜的整體成分、神經(jīng)元投影、細(xì)胞外基質(zhì)、等離子膜的外側(cè)、細(xì)胞表面、線粒體外膜、受體復(fù)合體、GABA-A受體復(fù)合體、胞外體，MF排名前10的條目為α1-腎上腺素受體活性、去甲腎上腺素結(jié)合、血紅素結(jié)合、腎上腺素結(jié)合、細(xì)胞因子活性、NADP 綁定、蛋白質(zhì)同二聚化活性、生長因子活性、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、多巴胺綁定，見圖5。KEGG 通路分析主要涉及69 條通路，根據(jù)P值進(jìn)行排序，其中排名前20 的分別為瘧疾、恰加斯?。绹F蟲?。?、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非洲錐蟲病、TNF 信號(hào)通路、炎癥性腸病、Toll 樣受體信號(hào)通路、乙肝、神經(jīng)活性配體受體相互作用、異體排斥、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、HIF-1 信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、阿米巴病、弓形體病、cGMP-PKG 信號(hào)通路、利什曼病、5-羥色胺能突觸，見表1—2。

圖5 大黃附子細(xì)辛湯抗BA GO富集分析柱形圖

3 討論

BA 是以心率減慢為特征的心血管疾病，大多好發(fā)于老年人，其中以病態(tài)竇房結(jié)綜合征最為常見。病因主要是由于多種原因造成竇房結(jié)自律性降低，導(dǎo)致竇房功能衰竭、起搏功能障礙、傳導(dǎo)功能障礙、G蛋白基因表達(dá)障礙的疾?。?］。BA的臨床表現(xiàn)早期并不明顯，隨病情加劇逐漸表現(xiàn)為乏力、心悸、頭暈、嗜睡、記憶力減退，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致心絞痛、心力衰竭等［5］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)BA的治療，一般采用阿托品、莨菪堿等藥物，藥物長期效果不穩(wěn)定，副作用大，病情嚴(yán)重者通常安裝永久性心臟起搏器改善癥狀，價(jià)格昂貴且作用期限有限［6］。故中醫(yī)藥治療BA具有重要的臨床意義和發(fā)展前景。

祖國醫(yī)學(xué)通常將BA 歸為“心悸”“怔忡”“遲脈”范疇，歷代醫(yī)家對(duì)其病因病機(jī)都有不同的見解，大多認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之證。病機(jī)大多為“心脈瘀阻““心氣虧虛”“陽氣虧虛”。周次清［7-8］認(rèn)為，陽氣虛衰是病態(tài)竇房結(jié)綜合征發(fā)病的根本，陽氣主動(dòng)，對(duì)人體各臟腑起著溫煦和推動(dòng)的作用。心陽虧虛無力鼓動(dòng)心臟搏動(dòng)，溫運(yùn)血脈，脾為氣血生化之本，脾陽不振導(dǎo)致運(yùn)化失常，脾濕生痰，痰濁心包，蒙蔽心神，影響氣血發(fā)源，進(jìn)一步影響其他臟腑的生理功能。腎為元陰元陽之本，心陽、脾陽根于腎陽，腎陽不足影響心陽、脾陽等陽氣的生成。因陰陽互為對(duì)立又互相轉(zhuǎn)化，故腎陽不足日久，引起腎陰不足，陰不斂陽，陰陽不相順接，導(dǎo)致陰陽兩虛，形成寒凝、血瘀、痰濁等由虛轉(zhuǎn)實(shí)的病理產(chǎn)物。劉渡舟認(rèn)為，心為陽中之陽臟，以陽氣為用，故心臟病亦恒多陽氣之病，或陽氣太過，或陽氣不足［9］。老年人陽氣虛弱，心陽不足時(shí)會(huì)出現(xiàn)心搏頻率下降、脈遲緩無力、胸悶氣短等癥狀。中醫(yī)藥治療BA 主要以麻黃附子細(xì)辛湯、四逆湯、參附湯、血府逐瘀湯等為主。劉小鋒等［10］篩選病態(tài)竇房結(jié)綜合征致BA患者41例，采用麻黃附子細(xì)辛湯加味進(jìn)行治療，結(jié)果顯示總有效率95%。說明益氣溫陽、通絡(luò)活血的中藥可以改善竇房結(jié)功能，提高心率。王海波［11］選取BA患者60例，治療組采用麻黃附子細(xì)辛湯和陽和湯治療，對(duì)照組采用阿托品治療，結(jié)果治療組總有效率95%，對(duì)照組總有效率76.67%。楊周宇等［12］選取70 例BA 的患者，給予麻黃附子細(xì)辛湯加味治療，結(jié)果顯示顯效36例，有效29 例，說明麻黃附子細(xì)辛湯在提高BA 患者心率方面有明顯效果。

麻黃附子細(xì)辛湯出自《傷寒論》第301 條：“少陰病，始得之，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃附子細(xì)辛湯主之?！痹街饕委熽柼撏飧兄C，腎陽為一身陽氣之本，溫煦腎陽，諸臟腑陽氣得之裨益［13］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云附子：“主風(fēng)寒咳逆邪氣，溫中，金瘡，破癥堅(jiān)、積聚血癥”，上助心陽通利百脈，下補(bǔ)腎陽補(bǔ)益元?dú)猓又辄S、細(xì)辛共奏溫經(jīng)散寒，助陽解表之功。童妍等［14］通過觀察附子對(duì)BA 大鼠cAMPPKA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響得出附子能提高緩BA大鼠Na+-K+-ATP 酶活性，升高大鼠心肌cAMP 含量，升高心肌PKA 含量，具有強(qiáng)心肌的作用。景紅娟［15］指出麻黃堿有興奮心臟的作用，且麻黃堿的濃度越高，加快心率、抑制心電圖上QT 間期的效果越明顯。黃順旺［16］證實(shí)細(xì)辛醇提液對(duì)離體兔和豚鼠心臟具有明顯的興奮作用，增強(qiáng)心肌收縮力，加快心率。研究表明，麻黃附子細(xì)辛湯可明顯提高BA的心率。

本次研究首先在TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)研究了麻黃附子細(xì)辛湯（麻黃、附子、細(xì)辛）中的有效成分和作用靶點(diǎn)，通過化合物-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示：槲皮苷、木犀草素、山柰酚、多根烏頭堿、去甲烏藥堿、兒茶酚等化合物與多個(gè)藥物靶點(diǎn)相互作用，故說明它們是麻黃附子細(xì)辛湯中的有效化合物成分，PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4 是化合物-藥物靶點(diǎn)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。麻黃附子細(xì)辛湯主要通過IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、FOS、NOS3、IL10、CAT、ICAM1 作用于BA，可能是核心靶點(diǎn)。JANSSEN 等［17］通過體外試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IL-6對(duì)心肌有負(fù)性效應(yīng)，低濃度的IL-6可能導(dǎo)致心肌肥大，而高濃度的IL-6 可能影響心肌并產(chǎn)生擴(kuò)張，進(jìn)一步導(dǎo)致心律失常的發(fā)生，可見IL-6 水平與心室擴(kuò)張和心肌收縮功能的減退等程度呈正相關(guān)。

根據(jù)GO 富集分析顯示麻黃附子細(xì)辛湯治療BA 的生物學(xué)過程主要體現(xiàn)在腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動(dòng)節(jié)脈血壓調(diào)等方面。腺苷酸環(huán)化酶通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP，引起細(xì)胞內(nèi)的酶反應(yīng)或者微環(huán)境變化，產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，包括心臟收縮、免疫反應(yīng)等，AC6 從哺乳動(dòng)物心臟中介導(dǎo)β-腎上腺素能受體刺激的信號(hào)異構(gòu)體［18］。TANG 等［19］在心力衰竭小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，AC6 可明顯緩解心力衰竭，增強(qiáng)心肌收縮力。細(xì)胞組成主要體現(xiàn)在細(xì)胞外隙、等離子膜的整體成分、神經(jīng)元投影等。分子組成則主要體現(xiàn)在α1-腎上腺素受體活性、去甲腎上腺素結(jié)合、血紅素結(jié)合等。去甲腎上腺素在心血管疾病中具有增加心率、加強(qiáng)心肌收縮的作用［20］。KEGG 通路主要涉及TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路等。心律失常與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca＋濃度有重要聯(lián)系，張青［21］證明TNF-α可能通過增加心室肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca＋濃度，致心肌細(xì)胞早期后除極，引起心肌梗死室性心律失常。本研究中麻黃細(xì)辛附子湯治療BA 的KEGG 分析結(jié)果中亦包含有鈣信號(hào)通路，說明鈣信號(hào)具有成為緩慢型心律失常治療靶點(diǎn)的潛質(zhì)。研究表明，抑制炎癥途徑可能有助于預(yù)防血管損傷。TNF-α 也被證明能刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放的內(nèi)皮微粒，參與內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。因此，TNF-α 抑制劑在預(yù)防血管功能障礙方面有新的作用［22］，可以增強(qiáng)心肌收縮力，提高心率。HAN 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，cGMP 含量的增加可有效激活PKG，保護(hù)心肌細(xì)胞，進(jìn)一步降低心律失常的發(fā)病率。趙燦等［24］發(fā)現(xiàn)，心肌肌鈣蛋白在被cAMP 活化的鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶作用下磷酸化，參與細(xì)胞收縮等生理功能，增加心肌收縮力從而改善心律失常。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)麻黃附子細(xì)辛湯干預(yù)BA 的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路進(jìn)行深入分析，通過IL-6、TNF、VEGFA 等核心靶點(diǎn)的表達(dá)作用于腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)等生物過程，并作用于TNF 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG 等信號(hào)通路，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力，提高心率，達(dá)到治療緩慢性心律失常的目的。本研究仍有很多不足，比如像Toll 樣受體信號(hào)通路未找到其作用機(jī)制，但仍希望為中醫(yī)藥治療BA的藥理學(xué)研究提供新的思路，旨在為臨床應(yīng)用麻黃附子細(xì)辛湯治療BA提供基礎(chǔ)的生物信息學(xué)支撐。