基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討茵黃解毒湯治療HBV相關(guān)肝衰竭的活性成分及其作用機(jī)制*

曾勝瀾，王 娜，張榮臻，王挺帥，吳 聰，毛德文△

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530023；

肝衰竭是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致肝臟合成、解毒、代謝和生物轉(zhuǎn)化功能嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床證候群，具有發(fā)病急、病情重、傳變快、病死率高等特點(diǎn)［1］。在我國(guó)，HBV 感染者高達(dá)7000 萬(wàn)，HBV 是引起肝衰竭的主要病因［2］。目前，如何有效促進(jìn)肝再生、拮抗肝細(xì)胞壞死、抑制HBV 復(fù)制、提高機(jī)體免疫、減輕內(nèi)毒素血癥、抗感染等是肝衰竭防治的重點(diǎn)。

茵黃解毒湯是由茵陳蒿湯聯(lián)合黃連解毒湯組成，方中重用茵陳為君藥，苦瀉下降，善于清熱利濕，為黃疸之要藥；臣以黃芩瀉肺火于上焦，黃連瀉脾火于中焦，黃柏瀉腎火于下焦，梔子通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去；佐以大黃瀉熱逐瘀，通利大便，導(dǎo)瘀熱從大便而下，共奏清熱利濕、瀉火解毒之功。研究證實(shí)，茵陳蒿湯合黃連解毒湯具有護(hù)肝、抗HBV、降低內(nèi)毒素、減輕促炎因子等作用［3-5］。

鑒于肝衰竭的機(jī)制復(fù)雜，單一的治療手段無(wú)法奏效，而中醫(yī)藥復(fù)方具有“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的特性，遵從“君、臣、佐、使”的配伍原則。因此，支持及開(kāi)展中藥復(fù)方防治肝衰竭的研究顯得尤為重要。微陣列等基因表達(dá)分析的高通量平臺(tái)是推斷生物相關(guān)性的重要工具，特別是在構(gòu)建信息系統(tǒng)過(guò)程中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。目前，尚無(wú)對(duì)茵黃解毒湯治療HBV-LF的全基因組學(xué)研究。在本研究中，我們從基因表達(dá)總集（gene expression omnibus，GEO）得到了有文獻(xiàn)記載的原始數(shù)據(jù)，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）得到了茵黃解毒湯的有效化合物及其相關(guān)靶點(diǎn)，進(jìn)行生物功能注釋、PPI網(wǎng)絡(luò)、GO和KEGG等相關(guān)分析。利用生物信息學(xué)方法，可以對(duì)HBV 相關(guān)肝衰竭的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為中藥復(fù)方茵黃解毒湯的臨床應(yīng)用和藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)篩選運(yùn)用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索關(guān)鍵詞“l(fā)iver failure”“hepatic failure”“hepatitis B virus”或“HBV”，設(shè)置條件Homo sapiens、series、Expression profiling by array，得到符合條件的基因表達(dá)譜GSE38941和GSE62029。

1.2 DEGs 分析將上述兩組數(shù)據(jù)均分為正常組和HBV-LF 組，利用perl 合并兩組數(shù)據(jù)，R 語(yǔ)言中sva 進(jìn)行批次矯正（batch normalization），limma用于識(shí)別兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的差異基因（differentially expressed genes ，DEGs），閾值設(shè)為|log2FC|＞1，adjustPvalue＜0.05。R 包pheatmap繪制兩個(gè)數(shù)據(jù)的DEGs熱圖。

1.3 中藥靶點(diǎn)預(yù)測(cè)茵黃解毒湯共包含6 味中藥：茵陳、梔子、大黃、黃芩、黃連、黃柏。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索6 味中藥各自的有效化合物及其相關(guān)靶點(diǎn)，設(shè)置條件口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。

1.4 疾病-中藥復(fù)方靶基因運(yùn)用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將從GEO獲取的HBV-LF靶點(diǎn)與中藥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集對(duì)比，最終獲得茵陳蒿湯聯(lián)合黃連解毒湯治療HBV-LF的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建茵黃解毒湯治療HBV-LF 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape 構(gòu)建茵陳蒿湯聯(lián)合黃連解毒湯治療HBV-LF 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，插件Bisogenet 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。Biso-Genet 是一個(gè)新的用于基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化和分析的插件，其特點(diǎn)是可以包含編碼關(guān)系來(lái)區(qū)分基因及其產(chǎn)物，存儲(chǔ)相互作用、分子絡(luò)合物和路徑的完整描述，以搜索所有已知的相互作用［6］。CytoNCA 是一種綜合計(jì)算、評(píng)價(jià)和可視化分析的多中心性插件，計(jì)算了PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和關(guān)系特征，包括：中間性中心性（betweenness centrality，BC）、度中心性（degree centrality，DC）等，適當(dāng)?shù)淖钚￠撝涤删W(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和邊緣分布決定［7］。

1.6 GO 富集分析及KEGG 信號(hào)通路富集分析利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）上傳潛在靶蛋白，進(jìn)行GO 的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析；同時(shí)利用KEGG 信號(hào)通路分析，綜合預(yù)測(cè)茵黃解毒湯治療HBV-LF 關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。

2 結(jié)果

2.1 DEGs分析GSE38941數(shù)據(jù)集包括27個(gè)樣本（正常樣本10 例，HBV-ALF 樣本17 例），GSE62029數(shù)據(jù)集包括23 個(gè)樣本（正常樣本10 例，HBV-ALF樣本13 例）。共得出差異基因2160 個(gè)，其中上調(diào)基因1172個(gè)、下調(diào)基因988個(gè)。見(jiàn)圖1—2。

圖1 HBV-ALF的DEGs火山圖

圖2 HBV-ALF的DEGs熱圖

2.2 中藥復(fù)方靶點(diǎn)茵黃連解毒湯包含6 味中藥，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及篩選，共得到化合物109個(gè)，包括beta-sitosterol、Genkwanin、Skrofulein、Isoarcapillin、Eupalitin、capillarisin、Demethoxycapillarisin、kaempferol、Stigmasterol、rhein 等，涉及相關(guān)靶點(diǎn)255 個(gè)，其中包含ESR1、CDK2、VEGF2、BAX、IL-6、JUN、IL-2、CXCL2 等。

2.3 疾病-中藥復(fù)方靶基因及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)所得結(jié)果，將GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的DEGs 與茵黃連解毒湯的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，共得到31 個(gè)靶基因，涉及66 個(gè)小分子化合物，包括Quercetin、Kaempferol、Isocorypalmine、（S）-Canadine、baicalein、beta-sitosterol、（R）-Canadine、Cavidine、Stigmasterol、wogonin、（2R）-7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、Berlambine、Fumarine、oroxylin a、acacetin、Dehydrotanshinone Ⅱ A、aloeemodin、crocetin、isorhamnetin、berberine、Genkwanin 等。利用Cytoscape 構(gòu)建茵黃連解毒湯治療HBV-LF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖3。

圖3 茵黃解毒湯治療HBV-ALF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（節(jié)點(diǎn)大小按Degree排列）

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)鋵W(xué)分析運(yùn)用Cytoscape 中插件Bisogenet 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，將“2.3”項(xiàng)中得到的31 個(gè)靶基因輸入Bisogenet，設(shè)置條件：Homo sapiens，protein protein interaction，數(shù)據(jù)來(lái)源為DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND，最后得到相互作用的1927 個(gè)互作基因。運(yùn)用CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)置DC＞60，BC＞600，最后得到55個(gè)關(guān)鍵靶基因。見(jiàn)圖4—5，表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

圖4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 CytoNCA網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

2.5 GO 和KEGG 富集分析利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)55個(gè)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO分析，共涉及細(xì)胞組分構(gòu)成或來(lái)源（cellular component organization or biogenesis）、對(duì)刺激的反應(yīng)（response to stimulus）、免疫過(guò)程（immune system process）、正/負(fù)調(diào)節(jié)的生物過(guò)程（positive/negative regulation of biological process）、細(xì)胞死亡（cell killing）、細(xì)胞增殖（cell proliferation）等24 個(gè)生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）；催化活性（catalytic activity）、結(jié)合（binding）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)（transcription regulator activity）等10 種分子功能（molecular function，MF）；細(xì)胞（cell）、胞外區(qū)（extracellular region）、細(xì)胞器（organelle）等16 個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）。見(jiàn)圖6。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG富集分析（前20）

通過(guò)KEGG分析，共得到175條信號(hào)通路，見(jiàn)圖7（top 20），去除與HBV-LF 無(wú)關(guān)的信號(hào)通路，并且靶基因富集數(shù)＞3，共篩選出27 條信號(hào)通路，包括PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Cell cycle、Hepatitis B、Apoptosis、Cellular senescence、FoxO signaling pathway、Ras signaling pathway、IL-17 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Wnt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等信號(hào)通路等。見(jiàn)表2

表2 KEGG信號(hào)通路分析

3 討論

全基因組分析（genome-wide analysis，GWAS）是一項(xiàng)系統(tǒng)的、有力的、公正的研究，探討了常見(jiàn)序列及其變異與疾病易感性之間的關(guān)系［8］。鑒于目前肝衰竭的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，GWAS 在揭示肝衰竭的病機(jī)方面發(fā)揮著重要的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將現(xiàn)有的“一靶一藥”的研究范式更新為新的“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)-多組分”的研究范式，分析生物網(wǎng)絡(luò)中的化合物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系［9］。利用GWAS并與中醫(yī)藥、疾病相聯(lián)系構(gòu)建中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將從系統(tǒng)角度和分子水平上進(jìn)一步揭示“藥物-基因-疾病”共模塊關(guān)聯(lián)，篩選中藥復(fù)方中的協(xié)同多化合物，解釋中藥方劑的組合規(guī)律、網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效應(yīng)及疾病防治的相關(guān)機(jī)制。

茵黃解毒湯由6 味中藥構(gòu)成，涉及的小分子化合物及其藥物靶點(diǎn)眾多，通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及一系列比對(duì)分析，最終篩選得到的小分子化合物及其作用靶點(diǎn)可能是茵黃解毒湯拮抗HBV-LF的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素（quercetin）可通過(guò)降低肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）、增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性、提高B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B cell leukemia 2，Bcl-2）的表達(dá)、減弱Bcl-2相關(guān)x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）的表達(dá)，從而起到保護(hù)肝臟的作用［10］。研究證實(shí)，槲皮素能顯著降低HBsAg/HBeAg 分泌和HBV-DNA 水平，這可能與熱休克蛋白水平和病毒轉(zhuǎn)錄水平的下降有關(guān)［11］。除此之外，槲皮素還有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高機(jī)體免疫等作用［10，12］。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚（kaempferol）可通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡，降低D- 氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）/內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS），從而誘導(dǎo)ALF 小鼠的死亡率［13］。黃芩素（baicalein）可抑制D-Galn/LPS 誘導(dǎo)的ALF 大鼠細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與減輕炎癥損傷、調(diào)節(jié)MAPK 與NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)［14-15］。蘆薈大黃素（aloe-emodin）具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、改善肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化等作用，可干預(yù)肝纖維化、肝硬化、非酒精性脂肪肝、肝衰竭等疾病的進(jìn)展［16-18］。黃連素可降低百草枯誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成和乳酸鹽脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的釋放，抑制肝細(xì)胞中谷胱甘肽的消耗［19］。本研究顯示，槲皮素、山柰酚、黃芩素、蘆薈大黃素、黃連素、異鼠李素、大黃酸等作為重要的小分子化合物參與了茵黃解毒湯拮抗HBV-LF 的過(guò)程，說(shuō)明本研究準(zhǔn)確性較高。

通過(guò)Bisogenet和CytoNCA構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，最后得到茵黃解毒湯-HBV相關(guān)肝衰竭的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)55 個(gè)，包括TP53、NTRK1、HSP90AA1、ESR1、CUL3、MCM2、CDK2、HSP90AB1、YWHAZ、NPM1、EGFR、HSPA8、VCP、FN1、BRCA1、HSPA5、COPS5、EP300等，提示茵黃解毒湯可能通過(guò)優(yōu)效小分子化合物與篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用，從而對(duì)HBV 相關(guān)肝衰竭起到治療作用。TP53 是重要的抑癌基因，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、DNA 修復(fù)、衰老和凋亡方面發(fā)揮重要作用［20］；同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)TP53 可通過(guò)p53 途徑在肝衰竭的進(jìn)展和恢復(fù)階段調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［21］。研究發(fā)現(xiàn)，ESR1 是肝再生過(guò)程中膽紅素水平下降的重要介質(zhì)，而CYP2A6 是膽紅素水平下降過(guò)程中雌激素信號(hào)的重要介質(zhì)，ESR1-CYP2A6軸可能參與肝細(xì)胞的成熟和恢復(fù)，通過(guò)增加肝細(xì)胞數(shù)量和肝祖細(xì)胞成熟以促進(jìn)肝再生［22］。ESR1甲基化可作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，對(duì)預(yù)測(cè)HBV相關(guān)肝衰竭28 天死亡率具有較高的價(jià)值［23］。Cul3和NPM1可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡等［24-25］。Cul3介導(dǎo)的原代成纖維細(xì)胞周期蛋白E 降解途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E 穩(wěn)態(tài)的主要機(jī)制［24］。EGFR 及其相關(guān)信號(hào)通路對(duì)肝細(xì)胞的正常功能和肝再生都至關(guān)重要，EGF/EGFR 信號(hào)通路是人體被切除2/3 肝臟后最早被激活的信號(hào)通路之一［26］。

GO 富集分析提示BP 主要涉及細(xì)胞組分構(gòu)成或來(lái)源、對(duì)刺激的反應(yīng)、免疫過(guò)程、正/負(fù)調(diào)節(jié)的生物過(guò)程、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖等。KEGG 通路分析提示PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Cell cycle、Hepatitis B、自噬、FoxO 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、Jak-STAT 信號(hào)通路等信號(hào)通路與本研究密切相關(guān)。PI3K-Akt 信號(hào)通路一直被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞增殖和防止細(xì)胞凋亡的重要途徑，磷酸化Akt 作用于下游靶點(diǎn)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的蛋白表達(dá)［27］。研究發(fā)現(xiàn)，在Akt 基因敲除的小鼠中，由于肝細(xì)胞增殖能力受損，肝再生嚴(yán)重受損，死亡率增加［28］。MAPKs 信號(hào)通路是細(xì)胞抵抗損傷的重要途徑，它整合了包括生長(zhǎng)、炎癥、代謝和凋亡等多種途徑［29］。肝臟內(nèi)發(fā)生的自噬主要具有維持肝組織正常的結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)節(jié)肝臟三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、調(diào)控肝臟免疫和炎癥反應(yīng)的生物學(xué)作用，對(duì)急性肝衰竭具有保護(hù)作用［30］。IL-17 主要是由活化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、免疫性疾病、腫瘤、移植排斥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［31］。說(shuō)明茵黃解毒湯可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖和凋亡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抑制HBV病毒復(fù)制等方面發(fā)揮拮抗HBV-LF的作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了茵黃解毒湯防治HBV-LF 的作用機(jī)制，對(duì)篩選出的優(yōu)效小分子化合物、優(yōu)效靶點(diǎn)、優(yōu)效途徑進(jìn)行了初步的探索。體現(xiàn)了中藥復(fù)方具備“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的特點(diǎn)，揭示了其拮抗肝衰竭的作用機(jī)制。探討茵黃解毒湯防治HBV-LF 的研究，進(jìn)一步挖掘了中藥復(fù)方優(yōu)效的單體成分，為新藥的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，并為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供堅(jiān)實(shí)的證據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐。