基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討健脾疏肝方治療非酒精性脂肪性肝病的作用機(jī)制*

姜 慧，李軍祥，譚 祥1，，張 陽(yáng)1，，萬 雯1，，施曉軍1，，韓海嘯△

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝細(xì)胞脂肪的過度積累，從非酒精性單純性脂肪肝（simple nonalcoholic fatty liver，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并可能發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1-2］。近年來，NAFLD 已成為最常見的慢性肝病，影響了全球約25%的普通人群［3］。目前，臨床上仍沒有獲得批準(zhǔn)的治療的NAFLD藥物［4］。因此，探索和開發(fā)有效的NAFLD藥物療法非常重要。

中醫(yī)藥歷史悠久，具有“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，其臨床療效也得到普遍認(rèn)可［5］。健脾疏肝方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授以“肝病實(shí)脾”理論為依據(jù)，謹(jǐn)合“肝郁脾虛，濕熱瘀阻”病機(jī)，并根據(jù)多年的臨證經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方。本方主要由絞股藍(lán)、水飛薊、炒白術(shù)、廣郁金、茯苓、白芥子、澤瀉、決明子、丹參、生山楂等十味中藥組成。然而，健脾疏肝方的分子機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的新方法，與中草藥多組分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)相契合，已被證明適用于分析中草藥中各種成分和作用的復(fù)雜關(guān)系［6］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究健脾疏肝方治療NAFLD的活性化合物、靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供支撐。

1 資料與方法

1.1 健脾疏肝方活性成分和靶標(biāo)的篩選將健脾疏肝方中的中藥材的名稱輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)［7］（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），設(shè)定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，藥物利用度（drug-likeness，DL）≥0.18，以獲得中藥材中合格的有效成分。TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)沒有錄入的中藥信息從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲得。然后在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢中藥對(duì)應(yīng)的蛋白靶標(biāo)，利用UniProt蛋白序列資源［8］（https：//www.uniprot.org）查詢蛋白靶標(biāo)的基因名稱和規(guī)格ID，方便進(jìn)一步進(jìn)行研究。

1.2 藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Cytoscape（V3.6.1）進(jìn)行活性化合物靶網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，以清晰顯示網(wǎng)絡(luò)和潛在目標(biāo)之間的關(guān)系。將鑒定的活性化合物和潛在靶標(biāo)導(dǎo)入軟件。使用“Network Analyzer”模塊對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩詤?shù)進(jìn)行分析，計(jì)算出整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的“Degree”值。Degree值越高，該化合物越有可能成為中草藥的關(guān)鍵化合物。

1.3 疾病潛在作用靶點(diǎn)的篩選以“Non-alcoholic fatty liver disease”為檢索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)［9］（GeneCards，http：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)［10］（online mendelian inheritance in man，omim，http：//www.omim.org/）及藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)［11］（therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)信息，并將上述3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的目標(biāo)進(jìn)行合并，刪除冗余目標(biāo)，得到總的疾病靶點(diǎn)目標(biāo)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶點(diǎn)。后將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［12］（https：//string-db.org/）構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。將物種設(shè)置為“Homo sapiens”（智人），最小交互閾值設(shè)置為“high confidence”（≥0.700），其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，導(dǎo)出并保存其TSV 格式文件，后導(dǎo)入到Cytoscape（V3.6.1）軟件中進(jìn)行可視化分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）獲得靶點(diǎn)GO 和KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果，并將所得結(jié)果導(dǎo)入微生信云平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證將核心化合物和關(guān)鍵靶基因進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。首先，從PubChem 平臺(tái)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性化合物的三維分子結(jié)構(gòu)，并使用openbabel（v3.1.1）軟件將SDF文件轉(zhuǎn)換為mol2格式。然后在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)和PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www1.rcsb.org/）中搜索所選基因編碼的受體蛋白，下載蛋白的3D結(jié)構(gòu)。用PyMOL（v2.3.0）軟件去除受體蛋白中的水分子。用AutoDock tools（v1.5.6）軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氫化并計(jì)算電荷。最后利用AutoDock Vina（v1.1.2）分子對(duì)接軟件驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 健脾疏肝方的活性成分和靶標(biāo)信息通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表文獻(xiàn)篩選，刪除重復(fù)項(xiàng)后，共獲得符合OB≥30%、DL≥0.18 的潛在活性成分共117 個(gè)，其中絞股藍(lán)15 種、水飛薊9 種、決明子13種、澤瀉7 種、白術(shù)4 種、茯苓6 種、郁金3 種、丹參58 種、白芥子1 種、山楂9 種。在這些活性化合物中，槲皮素是絞股藍(lán)、水飛薊和山楂的常見化合物；谷甾醇是絞股藍(lán)、澤瀉、郁金和山楂的常見化合物；豆甾醇是水飛薊、決明子和山楂的常見化合物；木犀草素是丹參和山楂的常見化合物；CLR 是絞股藍(lán)、水飛薊和決明子的常見化合物。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶基因預(yù)測(cè)系統(tǒng)，刪除重復(fù)值后共獲得279 個(gè)潛在靶標(biāo)，其中絞股藍(lán)161 個(gè)、水飛薊187個(gè)、決明子64個(gè)、澤瀉5個(gè)、白術(shù)18個(gè)、茯苓23個(gè)、郁金67個(gè)、丹參134個(gè)、白芥子17個(gè)、山楂198個(gè)。

2.2 活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了進(jìn)一步說明健脾疏肝方活性成分與相應(yīng)靶標(biāo)的相互作用，構(gòu)建了化合物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由404個(gè)節(jié)點(diǎn)（115 個(gè)活性成分，279 個(gè)靶標(biāo)，10 個(gè)藥草名稱）和2071 條邊組成。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲岛Y選健脾疏肝方治療NAFLD 的關(guān)鍵活性成分，并將大于degree 中位數(shù)2 倍值、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）中位數(shù)作為篩選指標(biāo)，見表1。槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等高度值活性化合物可能是健脾疏肝方治療NAFLD的重要活性成分。

表1 健脾疏肝方中篩選活性化合物的基本信息

圖1 健脾疏肝方潛在靶點(diǎn)的復(fù)合靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.3 NAFLD 的潛在靶基因從GeneCards、OMIM和TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別收集到806 個(gè)、622 個(gè)和4 個(gè)已知的NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)，取并集后共得到1362 個(gè)疾病靶點(diǎn)信息。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建首先Venn圖分析得出了133個(gè)健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)是健脾疏肝方治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)，見圖2。然后將133個(gè)靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，PPI評(píng)分設(shè)為0.700的高置信度。后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)CytoHubba插件中的MCC方法，獲得排名前50 的核心基因，見表2、圖3。

表2 排名前50的核心基因

圖2 健脾疏肝方治療NAFLD的Venn圖

圖3 健脾疏肝方治療NAFLD的PPI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 和KEGG通路富集分析為了進(jìn)一步了解交集基因的功能，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)健脾疏肝方治療NAFLD的50個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG信號(hào)通路富集分析。設(shè)定篩選條件為P＜0.01，GO 富集分析得到生物過程（biological process，BP）主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）主要包括細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能（molecular function，MF）主要包括酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞增殖活性等。將篩選出的排名前10 的BP、CC、MF 結(jié)果通過微生信平臺(tái)作柱狀圖進(jìn)行可視化分析，見圖4。

圖4 排名前50核心基因的GO富集分析柱狀圖（BP、CC、MF）

KEGG 信號(hào)通路富集分析篩選共得到104 個(gè)富集條目（P＜0.01），主要包括癌癥相關(guān)通路、TNF信號(hào)通路、乙型肝炎、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路及NAFLD 信號(hào)通路等。將篩選出的排名前20 的通路通過微生信平臺(tái)作氣泡圖進(jìn)行可視化分析，見圖5。該結(jié)果表明，中醫(yī)藥可從多靶點(diǎn)、多途徑干預(yù)本病，對(duì)NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后發(fā)揮積極作用。

圖5 排名前50核心基因的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對(duì)接將健脾疏肝方主要活性成分槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚與潛在主要治療靶點(diǎn)蛋白IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、VEGFA進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，計(jì)算結(jié)合能，并將結(jié)合能≤-5 kcal/moL作為說明受體蛋白與藥物活性成分可能具有較好的結(jié)合活性的標(biāo)準(zhǔn)［13］，將最小結(jié)合能進(jìn)行展示，見表3。其中結(jié)合活性較強(qiáng)的化合物與靶蛋白分子對(duì)接模式見圖6。結(jié)果顯示，健脾疏肝方主要活性化合物可與靶點(diǎn)受體蛋白通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

表3 分子對(duì)接結(jié)合能kcal/moL

3 討論

NAFLD 是最常見的肝臟疾病之一，是一種多因素發(fā)病機(jī)制和多種臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性、代謝性疾?。?4］。NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均在本病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色［15］。目前尚未研制出特效藥物，而中醫(yī)藥在代謝性疾病的防治中具有較為確切的療效［16］。健脾疏肝方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科李軍祥教授治療NAFLD 的臨床經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用療效顯著［17］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾疏肝方具有降低NASH 大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積、改善組織炎癥狀態(tài)、對(duì)抗氧化損傷等作用［18-19］，不過具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡釋及明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)地識(shí)別藥物與疾病的關(guān)系，揭示多分子藥物協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)［20］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法篩選健脾疏肝方的有效成分和治療靶點(diǎn)，并進(jìn)行基因功能分析和KEGG 通路富集分析，以期進(jìn)一步闡明健脾疏肝方治療NAFLD的機(jī)制。

從藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)活性化合物都與多個(gè)靶點(diǎn)蛋白相連，說明健脾疏肝方治療NAFLD 的多成分、多靶點(diǎn)的生物學(xué)特性。其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚是健脾疏肝方主要的活性化合物，起到關(guān)鍵的治療作用。槲皮素是一種具有多種生物活性的多羥基黃酮類化合物，具有很高的藥用抗炎、抗癌、抗氧化及抗纖維化價(jià)值［21-22］。木犀草素是一種在許多中藥及蔬菜中存在的天然類黃酮，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用［23-24］。豆甾醇是存在較為廣泛的一種植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及降低膽固醇等作用［25］。研究證明，豆甾醇可較明顯改善NAFLD 肝細(xì)胞脂肪變性程度，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)［26］。山柰酚是一種植物來源的類黃酮化合物，具有諸多藥理特性，如減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗腫瘤和抗炎作用等。有報(bào)道稱山柰酚對(duì)PI3K/Akt 通路和環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）有抑制作用［27］。

本研究構(gòu)建了健脾疏肝方和NAFLD 共有的133靶標(biāo)的核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。在這些指標(biāo)中，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 被認(rèn)為是顯著的，是健脾疏肝方干預(yù)NAFLD 潛在的理想靶點(diǎn)選項(xiàng)。TNF 和IL-6 作為炎癥介質(zhì)，當(dāng)肝臟受損時(shí)可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維組織增生［28］，因此二者在NAFLD 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以通過抑制IL-6、TNF-α 的產(chǎn)生，起到改善NAFLD 的作用［29］。PTGS2又可稱作COX-2，是一種較為重要的生理酶，在炎癥和腫瘤疾病中發(fā)揮作用，是藥學(xué)界存在較高關(guān)注度的靶點(diǎn)分子之一［30-31］。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2酶上調(diào)導(dǎo)致前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）水平升高，而PGE2有促炎作用的同時(shí)具有抗炎作用，所以COX-2 酶代謝產(chǎn)物的戰(zhàn)略性調(diào)控可用于治療性控制炎癥疾病的進(jìn)展［32］。STAT3 是STAT 家族成員之一，在人類惡性腫瘤的各種細(xì)胞因子、激素和生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用［33］，研究認(rèn)為STAT3 可能是抗癌治療的新靶點(diǎn)［34-35］。相關(guān)研究報(bào)道，槲皮素可能通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號(hào)通路，達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)肝癌自噬的作用［36］。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA的表達(dá)與NAFLD 具有一定的相關(guān)性［37］。由以上分析結(jié)果得出，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 等靶點(diǎn)可能是健脾疏肝方治療NAFLD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。此外，健脾疏肝方主要活性成分與這些靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果也進(jìn)一步證明了健脾疏肝方對(duì)NAFLD 具有治療作用。

GO 分析結(jié)果顯示，健脾疏肝方干預(yù)NAFLD 在生物過程方面最可能與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等相關(guān)，在細(xì)胞組分方面最有可能與細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面等組成成分相關(guān)，而在分子功能方面則最可能與酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等相關(guān)。KEGG 分析顯示，與健脾疏肝方治療NAFLD 有關(guān)的通路主要涉及癌癥相關(guān)通路、TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路及NAFLD 信號(hào)通路。其中，癌癥相關(guān)通路排在首位，說明健脾疏肝方在很大程度上發(fā)揮抗腫瘤的積極作用，這也與藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果相互印證。研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的重要通路［38］，也是與NASH 纖維化密切相關(guān)的因子［39］。NAFLD 信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）信號(hào)通路是NAFLD 信號(hào)通路中的主要通路之一，IR 在NAFL 向NASH 發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且IR 已被證實(shí)是NAFLD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是NAFLD 進(jìn)展的關(guān)鍵［40］。AMPK 的激活可促進(jìn)下游抗氧化基因Nrf2 的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)［41］。PI3K/Akt 在介導(dǎo)生長(zhǎng)因子信號(hào)在生物體生長(zhǎng)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝等方面起著重要作用，是一個(gè)潛在的治療NAFLD 的靶點(diǎn)［42］。研究表明，槲皮素能通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路改善NASH 大鼠肝組織脂肪變性程度，從而減輕肝臟炎癥［43］。

綜上所述，本研究主要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法，對(duì)健脾疏肝方治療NAFLD 的主要活性成分、靶點(diǎn)間的相互作用進(jìn)行探討。研究結(jié)果表明，健脾疏肝方可能通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝等多種途徑干預(yù)NAFLD，其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和山柰酚為健脾疏肝方潛在的最核心化合物，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 五個(gè)靶蛋白為干預(yù)網(wǎng)絡(luò)中潛在的最佳靶點(diǎn)選項(xiàng)。本研究在一定程度上對(duì)中醫(yī)治療疾病提供理論依據(jù)具有很大的價(jià)值，為中藥復(fù)方作用機(jī)制提供了新方向。但是，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于現(xiàn)有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)中的數(shù)據(jù)，如果這些數(shù)據(jù)存在偏差，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果就會(huì)不準(zhǔn)確，這也是預(yù)測(cè)的局限性所在。因此，關(guān)于健脾疏肝方在NAFLD 中的作用，還需進(jìn)行進(jìn)一步的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。