基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療子宮內(nèi)膜異位癥的分子機制*

趙秀萍，馬小娜，郭亞楠

北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS，以下簡稱內(nèi)異癥）是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮腔以外的部位種植、浸潤的一種臨床常見多發(fā)疾病，全球育齡婦女患病率約5～10%［1］。因異位內(nèi)膜種植部位不同，臨床表現(xiàn)多種多樣，被認為是一種全身性多系統(tǒng)疾病。有報道指出EMS 可影響肝臟和脂肪組織的代謝，導(dǎo)致全身炎癥，并改變大腦中的基因表達，導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛敏感和情緒障礙［2］。

古代中醫(yī)學(xué)中，無內(nèi)異癥的病名記載，根據(jù)其痛經(jīng)、繼發(fā)不孕、異位囊腫等癥狀可歸屬于“痛經(jīng)”“不孕”“癥瘕”等范疇。中醫(yī)理論認為異位的內(nèi)膜形似離經(jīng)之血，即瘀血，可作為病理產(chǎn)物，也可為致病因素，核心病機為胞宮、沖任氣血瘀滯，臨床治療多從活血化瘀散結(jié)著手［3］。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊為婦科臨床常用中成藥，具有活血化瘀、散結(jié)止痛的功效，可有效治療內(nèi)異癥所致的痛經(jīng)、卵巢囊腫、慢性盆腔痛等［4］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以全方位、多角度對中藥多成分的藥理作用靶點進行預(yù)測、拓撲分析，并可以將藥物-靶點、靶點-通路等關(guān)系抽象成網(wǎng)絡(luò)模型圖，目前已成為中醫(yī)藥治療臨床疾病作用機制的新興研究技術(shù)［5］。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探索散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的有效成分、作用靶點、信號通路等分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于若干數(shù)據(jù)庫及軟件基礎(chǔ)上開展的，這些數(shù)據(jù)庫也成為中醫(yī)藥與現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)之間的橋梁。本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件主要包括：TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫、DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）、PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）、Venny 2.1 在線繪圖軟件、Cytoscape3.7.2（http：∥www.cytoscape.org/）軟件等。

1.2 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊活性成分及內(nèi)異癥交集靶點的篩選將三七、薏苡仁、浙貝母分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度（oral bio-availability，OB）值≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）值≥0.18 為合并篩選條件，得到各自活性成分，查找國內(nèi)外文獻［6-7］，篩選龍血竭的主要活性成分。通過Pubchem、TCMSP 數(shù)據(jù)庫進一步獲得這些成分的Smiles結(jié)構(gòu)并導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，預(yù)測散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊活性成分的靶點信息。借助TTD、Drugbank、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索子宮內(nèi)膜異位癥疾病相關(guān)靶點信息。檢索關(guān)鍵詞為“endometriosis”，刪去重復(fù)值后合并數(shù)據(jù)集獲得疾病靶點信息，利用Venny 2.1 工具繪制韋恩圖獲得交集基因。

1.3 靶點預(yù)測及核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建構(gòu)建成分-疾病靶點映射關(guān)系，運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，得到拓撲分析參數(shù)，經(jīng)篩選后得到的核心靶點上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫，進行蛋白-蛋白互作分析，保存TSV 結(jié)構(gòu)，再上傳Cytoscape 軟件進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用Network Analyzer 獲得自由度（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）等相關(guān)參數(shù)。

1.4 GO 功能富集分析將上述靶點信息輸入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫Gene List，選擇“OFFICIALGENE-SYMBOL”，設(shè)定基因物種和背景為“Homo sapiens”，進行GO功能富集分析，具體包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分，根據(jù)P-value 值選取前20 個條目，以氣泡圖進行可視化展示。

1.5 KEGG 通路富集分析及靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫選擇“KEGG_PATHWAY”，進行KEGG通路富集分析，根據(jù)P-value值篩選信號通路，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建活性成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，進一步說明靶點和信號通路在散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的作用。

1.6 成分-靶點對接選擇PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的靶點與藥物關(guān)鍵成分進行對接，下載小分子配體mol2 格式。通過PDB 數(shù)據(jù)庫篩選下載靶蛋白pdb結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL 2.4軟件進行去水、刪除配體等處理。將優(yōu)化后的大分子蛋白導(dǎo)入AutoDock-Tools，進行加氫、計算電荷數(shù)等處理，導(dǎo)入小分子配體，設(shè)置Gird Box 為默認值，再通過AutoDock在Windows10環(huán)境下將大分子蛋白與小分子配體進行對接，按Binding energy排序，選取結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的對接目標(biāo)，將pdbqt 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為pdb 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PyMOL軟件將對接結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊的活性成分與作用靶點篩選散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊中包括三七、薏苡仁、浙貝母和龍血竭4 味中藥。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及文獻檢索篩選，共得到散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊54 個活性成分，其中三七8 個、薏苡仁8 個、浙貝母7 個、龍血竭31 個。其中beta-sitosterol 為三七、龍血竭、浙貝母的共有成分，Stigmasterol 為三七、薏苡仁、龍血竭共有成分，Mandenol 為三七、薏苡仁共有成分。保存每個化學(xué)成分的Smiles 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，共預(yù)測成分靶點943個。見表1—2。

表1 藥物有效成分（除龍血竭）

表2 龍血竭有效成分

2.2 內(nèi)異癥疾病靶點篩選從TTD、Drugbank、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫以“endometriosis”為關(guān)鍵詞檢索，合并后刪除重復(fù)值得到EMS 靶點1088 個。將獲得的藥物成分靶點和疾病靶點錄入Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖，兩者交集部分可能即為散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的關(guān)鍵核心靶點。最終獲得NR3C2、CYP19A1、MMP9、PGR、EGFR、IL-2 等231個潛在靶點。見圖1。

圖1 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊藥物成分-靶點韋恩圖

2.3 “藥物成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將獲得的231 個交集基因?qū)隒ytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建藥物成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖，利用Tool 模塊中的Network Analyzer獲得Degree值，Degree值越高表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，排名前5 位成分為Stigmasterol（豆甾醇）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、Mandenol（亞油酸乙酯）、Resveratrol（白藜蘆醇）、pterostilbene（紫檀芪）。見圖2。

圖2 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)分析將獲得的231 個交集靶點蛋白進行拓撲網(wǎng)絡(luò)分析，以degree 和betweenness 均大于中位數(shù)為條件進行篩選，共獲得45 個核心靶點，以gene symbol 的形式輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為Homo sapiens，設(shè)置選擇置信度分數(shù)score≥0.400（高置信度），隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)的節(jié)點，默認其他參數(shù)，下載保存為tsv形式后導(dǎo)入Cytoscape軟件進行PPI互作可視化展示。中間圓形節(jié)點代表10個核心靶點，周圍圓形節(jié)點為其他核心靶點，圓形越大、顏色越深表示degree 越大?？梢娧軆?nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、ALB、蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、類固醇激素受體輔激活子（steroid receptor coactivator，SRC）、表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、半胱天冬蛋白酶3（recombinant caspase 3，CASP3）、抑癌基因（tumor protein P53，TP53）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）等位于核心基因位置。見圖3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊-內(nèi)異癥交集基因的GO富集分析GO 富集分析共獲得328 個生物學(xué)過程（biological process，BP），74 個分子功能（molecular function，MF）和37 個（cellular component，CC）細胞組分。其中生物過程顯著富集在對RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、內(nèi)皮細胞增殖的正調(diào)控等；分子功能主要富集酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA 結(jié)合；細胞組分主要富集在細胞核、蛋白質(zhì)復(fù)合物、核染色質(zhì)、核質(zhì)等。紅色圓點越大表示富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。見圖4—6。

圖4 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的生物過程富集分析

圖5 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的分子功能富集分析

圖6 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的細胞組分富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行KEGG 富集分析，獲得102 條相關(guān)通路，按P值排序挑選出前20條信號通路，使用氣泡圖進行展示，見圖7?？梢姾诵陌悬c主要富集在癌癥通路、VEGF 信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF 信號通路等。紅色氣泡越大則富集基因數(shù)目越多，顏色越紅富集越顯著。通過Cytoscape 軟件繪制“成分-疾病靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。根據(jù)度值排序可見成分、靶點關(guān)聯(lián)最主要的通路為HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路。

圖7 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥的KEGG富集分析

圖8 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 藥物成分-靶點對接將PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5 的靶點蛋白分別與散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊關(guān)鍵成分進行分子對接驗證，見表3。結(jié)合能（binding energy）小于0 提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，數(shù)值越低結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，所需結(jié)合能越低，Binding energy≤-4.0 kcal/mol 說明有較好結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol表明有強的結(jié)合活性［8］。結(jié)果顯示β-谷甾醇與AKT1、β-谷甾醇與SRC、紫檀芪與AKT1、紫檀芪與MAPK3 的結(jié)合能較小，分子結(jié)合構(gòu)象更穩(wěn)定，見圖9。結(jié)合上述結(jié)果，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊有效成分與核心靶點具有較好的結(jié)合活性，β-谷甾醇、紫檀芪可能是散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對內(nèi)異癥發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分。

圖9 散結(jié)鎮(zhèn)痛活性成分與核心靶點對接圖（結(jié)合能≤6.3 kcal/mol）

表3 藥物成分與核心靶點的對接結(jié)果kcal/mol

3 討論

散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊中龍血竭、三七專入血分，可活血散瘀止痛；浙貝母散結(jié)消癰；薏苡仁健脾利濕。諸藥合用，可使氣血通暢而無瘀滯，脾氣健運而無痰濕。研究表明，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可有效減輕內(nèi)異癥及子宮腺肌病患者痛經(jīng)癥狀［9］，改善子宮內(nèi)膜的血管形成和血液循環(huán)、抑制平滑肌收縮、炎癥反應(yīng)、降低雌激素分泌，從而有效減輕臨床癥狀［10］。

本研究在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共得到散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊有效活性成分54 個，預(yù)測成分靶點943 個。檢索獲得內(nèi)異癥靶點1088個，兩者取交集后獲得231個靶點，可見散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥是通過多成分、多靶點發(fā)揮作用。借助Cytoscape軟件構(gòu)建成分-疾病靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖，分析篩選有效核心成分為豆甾醇、β-谷甾醇、亞油酸乙酯、白藜蘆醇、紫檀芪等，分子對接結(jié)果顯示β-谷甾醇、紫檀芪具有較強的結(jié)合效能，可能是散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊對內(nèi)異癥發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分?，F(xiàn)代藥理研究認為，豆甾醇作為諸多中藥的關(guān)鍵成分之一，具有調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)、血管生成等藥理作用，可通過神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路緩解內(nèi)異癥患者臨床癥狀［11］。β-谷甾醇可阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，具有抗菌、消炎、抗氧化等作用，從而對內(nèi)異癥起治療效果［12］。而紫檀芪具有抗癌、抗氧化、抑制炎癥因子IL-6、TNF-α等作用［13-14］。以degree 和betweenness 為條件篩選出45個核心靶點，借助STRING數(shù)據(jù)庫根據(jù)度值獲得VEGFA、AKT1、MAPK3、SRC 等10 個核心靶點，這些靶點涉及血管生成、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤生成等多個生物過程。

本研究GO 功能富集分析得出散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可能影響細胞凋亡、內(nèi)皮細胞增殖、細胞缺氧等多個生物學(xué)過程。KEGG 分析顯示散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊治療內(nèi)異癥主要涉及血管內(nèi)皮生長因子信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF 信號通路等。提示散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可能通過干預(yù)雌激素的分泌、改善缺氧環(huán)境及影響子宮內(nèi)膜血管形成等作用來對內(nèi)異癥起治療作用。

綜上所述，散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊可通過多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用治療內(nèi)異癥，為從分子機制探討中醫(yī)藥治療內(nèi)異癥疾病的研究提供了一定依據(jù)，但該研究是基于在線數(shù)據(jù)庫及生物信息軟件計算得出的，結(jié)果可能存在一定偏差，還需進一步通過臨床試驗及動物實驗進行驗證。