基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探究黃連解毒湯治療膿毒癥的分子機(jī)制*

馬世河，惠普晟，龍 漫

1 重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400000； 2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400000；3 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000

膿毒癥是由于感染引起的全身性免疫反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的器官功能障礙，因該病進(jìn)展快、疾病診斷和治療不當(dāng)，常引發(fā)膿毒癥休克，危及患者生命［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要依賴控制感染源、液體治療、抗生素治療、糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白、血管活性藥物及血液凈化等手段治療膿毒癥［2］。近年來，盡管新的治療策略不斷發(fā)展，但該病的死亡率仍處于高位，而這一形勢(shì)在醫(yī)療欠發(fā)達(dá)地區(qū)更為嚴(yán)峻［3］。

近年來，中醫(yī)在治療膿毒癥及改善患者臨床癥狀上優(yōu)勢(shì)凸顯。中醫(yī)學(xué)中并無“膿血癥”這一病名，目前主要依據(jù)膿毒癥臨床表現(xiàn)的中醫(yī)特征，將其歸納至“溫病”及“外感熱病”范疇，以“熱、毒、瘀、虛”為其核心病機(jī)［4］。黃連解毒湯首見于《肘后備急方》，唐代王燾將其收錄至《外臺(tái)秘要》，是清熱解毒的代表方劑，在臨床上治療熱毒型膿毒癥每獲良效。黃連解毒湯由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成，四藥合用、苦寒直折，主治三焦火毒證，證見大熱煩渴、錯(cuò)語不眠或則熱病發(fā)斑。研究表明，黃連解毒湯可抑制膿毒癥引起的炎癥因子釋放；調(diào)整血小板活化功能，對(duì)降低膿毒癥死亡率有較大作用［5］。然而黃連解毒湯復(fù)方有效成分多樣，潛在分子機(jī)制尚不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“分子-靶點(diǎn)-通路-疾病”的理論，探究黃連解毒湯治療膿毒癥的生物學(xué)機(jī)制，為以后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供研究方向。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件資源中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；DisGeNET Database v5.0（http：//www.disgenet.org/）；Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）；疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniport，https：//www.uniprot.org/）；美國(guó)國(guó)家生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Venny 軟件、STRING平臺(tái)、Cytoscapes 3.2.1軟件。

1.2 黃連解毒湯活性成分篩選在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)［6］中依次輸入活性成分及藥物作用靶點(diǎn)黃連、黃柏、黃芩、梔子，以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，血腦屏障透過率（BBB）≥-0.3為條件［7］，篩選活性成分。另外，在中國(guó)知網(wǎng)、PubMed及萬方3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索上述4 味藥物的藥理研究及化學(xué)成分，尋找可能與膿毒癥相關(guān)的活性成分，同時(shí)將未被列入TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)或因上述篩選條件被刪除的作為補(bǔ)充。將篩選后的活性成分再次通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以獲得活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.3 膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)挖掘以“sepsis”為搜索詞，在以下數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)的信息：Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）；DisGenet數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）。

1.4 藥物活性成分靶點(diǎn)構(gòu)建藥物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。利用上述步驟獲取的黃連解毒湯中有效活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)名稱，上傳至Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)及美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置種屬為“Homo sapiens（Human）”，獲得靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化后的基因名稱。利用Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制黃連解毒湯活性成分靶點(diǎn)和黃連解毒湯靶點(diǎn)的韋恩圖，并得到交集靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1 軟件其中的“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，運(yùn)用上述方法識(shí)別黃連解毒湯中潛在的活性分子成分和靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-靶標(biāo)-通路-疾病的網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾昂Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)將上述藥物-疾病交集靶點(diǎn)上傳至STRING 平臺(tái)，限定研究物種為“人（“Homosapiens”），最低相互作用評(píng)分設(shè)置為最高置信度［“highest confidence（0.900）”］，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到黃連解毒湯作用于膿毒癥的藥物靶蛋白-疾病靶蛋白（protein-protein interaction，PPI）相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO功能分析及KEGG通路富集分析在DAVID（the database for annotation，visualization and integrated discovery）數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入黃芩、黃連、黃柏、梔子的作用靶標(biāo)，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱（official genesymbol），設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）生物過程分析、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.7 分子對(duì)接虛擬篩選是快速發(fā)展的藥物篩選技術(shù)之一，而分子對(duì)接是必不可少的活性化合物篩選的手段。采用AutoDock 軟件對(duì)化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病（PPI）網(wǎng)絡(luò)中得分?jǐn)?shù)最高的JUN 及TNF 蛋白質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接及三位結(jié)構(gòu)模擬?；衔锛暗鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）網(wǎng)站獲得。在AutoDockTools 軟件中對(duì)上述蛋白受體和配體進(jìn)行加氫、加電荷處理，再用其插件Autogrid 得到對(duì)接活性位點(diǎn)，進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能（affinity）。此外，配體與靶標(biāo)的相互作用通過配體相互作用圖模塊進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯有效化合物成分及靶點(diǎn)篩選采用“1.2”項(xiàng)下方法，刪除重復(fù)化合物后得到有效化合物206個(gè)，并通過在中國(guó)知網(wǎng)、PubMed等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，補(bǔ)充因篩選條件被刪除而對(duì)膿毒癥有一定作用的化合物，共得到有效化合物成分6個(gè)。將此化合物在TCMSP中再次輸入，得到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共211個(gè)，其主要活性成分見表1。

表1 黃連解毒湯活性成分（前20位）

2.2 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)“活性成分-藥物”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)每一活性成分映射的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)通過Cystoscopes 軟件繪制［8］，其中藍(lán)色代表復(fù)方，綠色代表中藥小分子，紅色代表在多味中藥中出現(xiàn)的小分子，黃色代表靶基因，節(jié)點(diǎn)（node）意為黃連解毒湯中所含藥物活性成分及其作用靶點(diǎn)；邊（edge）則表現(xiàn)了中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。見圖1。

圖1 “活性成分-藥物”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 膿毒癥靶點(diǎn)基因采集通過“Gene Cards、OMIM、DisGenet”數(shù)據(jù)庫(kù)以疾病名稱“Sepsis”搜索，其中“Gene Card”數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)1590 個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出301 個(gè)基因靶點(diǎn)，DisGenet 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出1264 個(gè)基因靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)去重后共得到1891個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 化合物及膿毒癥靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及篩選共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。將上述“2.1”項(xiàng)及“2.2”項(xiàng)步驟中所得的靶點(diǎn)依次上傳至Uniport或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。然后運(yùn)用Venny 2.1 軟件繪制兩者交集的韋恩圖，顯示兩者共有基因105 個(gè)，包含IL-10、CXCL8、CRP 等，見圖2。在STRING平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，網(wǎng)絡(luò)中有105個(gè)靶點(diǎn)之間存在蛋白相互作用。見圖3—4。

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 barplot圖

2.5 GO 及KEGG 分析結(jié)果105 個(gè)交集靶點(diǎn)得到的GO 條目以P值大小排序，主要影響的前20 個(gè)生物進(jìn)程，主要包括細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子激活等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)106個(gè)交集靶點(diǎn)基因顯著富集在152條通路上，按照P值從小到大的順序篩選前20 條，其中最有意義的20 條通路包括AGEs-RAGE通路、TNF信號(hào)通路、IL-17通路等，再將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。圓點(diǎn)越大則基因數(shù)量越多，顏色代表富集顯著性，顏色越紅則富集性越高。見圖5—6。

圖5 GO分析圖

圖6 KEGG信號(hào)通路圖

2.6 分子對(duì)接結(jié)果所有分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合能均小于0，且波動(dòng)在-5.5～-11.9 KJ/mol 之間，表示所有配體可以自發(fā)地與受體結(jié)合其中吳茱萸次堿與TNF結(jié)合最好，進(jìn)一步證明了黃連解毒湯中的活性成分在治療膿毒癥中起重要作用。見表2、圖7。

圖7 TNF-Rutaecarpine分子對(duì)接

表2 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

膿毒癥常發(fā)生于重大傷害或嚴(yán)重感染之后，由其引發(fā)的感染會(huì)引發(fā)循環(huán)衰竭，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞和多器官代謝功能障礙，占膿毒癥預(yù)后不良原因的大多數(shù)［9］。王林等［10］研究表明，黃連解毒湯能明顯改善膿毒癥熱毒型患者體內(nèi)白細(xì)胞、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎癥因子水平。黃連解毒湯復(fù)方中藥制劑成分復(fù)雜，其作用途徑涉及靶點(diǎn)較多，從多維度、多層次針對(duì)疾病各個(gè)方面。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，探討了中藥復(fù)方黃連解毒湯治療膿毒癥的作用機(jī)制。

在本次研究中，黃連解毒湯治療膿毒癥主要活性成分為小檗堿、黃連堿、黃芩苷、黃芩素、槲皮素等。REN 等［11］研究表明，黃連解毒湯主要的黃芩黃酮類化合物和環(huán)烯醚萜類化合物對(duì)炎癥模型大鼠具有協(xié)同抗炎作用，能明顯降低大鼠血漿中IL-6、IL-1β、MIP-2、TNF-α 表達(dá)水平。晉金蘭等［12］研究表明，小檗堿通過降低膿毒性心肌病模型大鼠心肌組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的上調(diào)，還降低了心肌組織中TNF-a 和IL-1β的含量。黃芩苷具廣譜抗菌、抗病毒活性，對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒有抑制作用，其機(jī)制可能與干擾細(xì)胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細(xì)胞蛋白合成、影響核酸合成、干擾遺傳密碼復(fù)制等有關(guān)［13-14］。另有研究表明，膿毒癥的發(fā)展中，活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用。這種氧化應(yīng)激會(huì)損害細(xì)胞膜和其他細(xì)胞大分子，槲皮素是強(qiáng)大的抗氧化劑，抑制ROS 并激活肺細(xì)胞的酶促抗氧化系統(tǒng)，減輕由膿毒癥引起的肺損傷［15-16］。PPI分析表明，黃連解毒湯中有效成分可能是通過c-Jun 氨基末端激酶（jun kinase，JNK）、TNF、Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、IL-6 等靶標(biāo)作用于膿毒癥。GO 生物過程分析提示，黃連解毒湯通過影響細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑等途徑，改善膿毒癥所致的機(jī)體炎癥及對(duì)器官組織的功能損傷。KEGG 富集分析顯示，黃連解毒湯作用通路主要涉及AGEs-RAGE通路、HIF-1通路、IL-17信號(hào)通路及TNF 信號(hào)通路等。晚期糖基化受體（RAGE）與晚期糖基化產(chǎn)物（AGEs）結(jié)合后在人體影響各組生物進(jìn)程。CHEN 等［17］證實(shí)，晚期糖基化受體通過影響T 細(xì)胞的表達(dá)在炎癥反應(yīng)的始動(dòng)和持續(xù)作用中扮演重要角色，并且RAGE 參與T 細(xì)胞向Th1 表型的分化的過程。此外，研究證明，抑制RAGE 的活性對(duì)于腹腔感染、膿毒癥具有正面作用［18］。低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）在機(jī)體對(duì)病理應(yīng)激和環(huán)境適應(yīng)的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)抑制糖酵解代謝時(shí)，LPS 處理巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)減輕，IL-1β的產(chǎn)生減少，這表明抑制HIF-1α 介導(dǎo)的有氧糖酵解是逆轉(zhuǎn)膿毒癥過程的潛在靶點(diǎn)?？烧{(diào)控下游相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，從而改善因膿毒癥導(dǎo)致的心肌等器官對(duì)的損傷［19-20］。IL-17a 作為宿主免疫的重要組成部分，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲引起的感染具有強(qiáng)大的保護(hù)作用。一系列研究表明，膿毒癥患者IL-17a循環(huán)水平升高，調(diào)控IL-17a 的表達(dá)可降低全身促炎細(xì)胞因子或趨化因子水平，提高膿毒癥患者生存率［21］。TNF-α是關(guān)鍵的促炎因子，其通過細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生“炎癥風(fēng)暴”，從而引起心、肺、腎等組織器官損傷及功能障礙等［22］。在膿毒癥患者中，TNF-α 的濃度升高水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)［23］。此外，劉雨濃等［24］證實(shí)，黃連解毒湯有效組分通過抑制Caspase-11 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抗膿毒癥的作用。由此可見，黃連解毒湯主要發(fā)揮其抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用治療膿毒癥。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步預(yù)測(cè)黃連解毒湯的活性成分、藥物靶點(diǎn)及藥物-疾病的相關(guān)通路，黃連解毒湯抗膿毒癥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的特點(diǎn)，其主要生物學(xué)機(jī)制可能與抑制各種炎癥通路如TNF-α、IL-1β及T 細(xì)胞的分化相關(guān)。當(dāng)然，本研究尚存在一些局限，如對(duì)有效成分相關(guān)靶點(diǎn)的尋找和確認(rèn)方法需要進(jìn)一步優(yōu)化，而且本研究未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此次靶點(diǎn)及機(jī)制預(yù)測(cè)的可靠性需進(jìn)一步研究。