基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“山藥-杜仲”藥對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制*

郭 超，張興彩，王衛(wèi)國(guó)，劉曉晨，呂文學(xué)，蔡余力△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355； 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種常見(jiàn)的全身性代謝性骨?。?］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著中國(guó)人口老齡化的加劇，罹患OP 的患者人數(shù)不斷增加，絕經(jīng)后婦女尤為突出，由骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折例次也在不斷上漲，OP 已成為我國(guó)老年人面臨的重要健康問(wèn)題［2］?；谥袊?guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論體系，OP 按其癥狀表現(xiàn)和致病機(jī)理應(yīng)歸屬“骨萎”“骨枯”“骨痹”等范疇。《素問(wèn)·痿論篇》中指出：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，可見(jiàn)腎氣的充盈與否，是OP 發(fā)病的重要因素［3］。《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“谷入氣滿，澤注入骨，骨屬屈伸”，說(shuō)明脾氣充盛，運(yùn)化水谷，充髓養(yǎng)骨。若脾氣不足，運(yùn)化乏力，亦可以導(dǎo)致筋肉骨骼失養(yǎng)而發(fā)為骨質(zhì)疏松［4］。故治療OP當(dāng)以補(bǔ)腎健脾為主。全國(guó)名中醫(yī)藥專家曹貽訓(xùn)教授結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)采用“益腎健脾法”治療OP 臨床療效顯著，尤以山藥、杜仲最為常用，且用量較大。山藥為健脾要藥，具有補(bǔ)中益氣，滋腎益肺等功效?！侗静萁?jīng)》云：“山藥氣溫平，味甘，無(wú)毒，主傷中……益氣力，長(zhǎng)肌肉；杜仲味辛平，主腰脊痛，補(bǔ)中，益精氣［5］。杜仲為補(bǔ)腎強(qiáng)骨要藥，能補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨。補(bǔ)腎健脾中藥配伍應(yīng)用，符合益腎健脾治療原則，在臨床中常常取得良好療效［6-8］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的新興科研方法。它通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析等技術(shù)，揭示“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)中藥潛在藥理作用及分子機(jī)制，評(píng)估藥物療效及副作用等［9］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究益腎健脾藥對(duì)“山藥-杜仲”藥對(duì)在抗骨質(zhì)疏松中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索益腎健脾法治療OP提供研究思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 杜仲、山藥活性成分的獲取與篩選在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中分別以“山藥”“杜仲”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得山藥、杜仲的成分信息，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，獲取山藥、杜仲的活性成分。

1.2 山藥、杜仲活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋山藥-杜仲活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org /）將作用靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范，剔除非人源、重復(fù)靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)。并將基因靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分輸入“Cytoscape 3.7.2”，構(gòu)建山藥、杜仲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 OP 靶點(diǎn)的獲取與收集在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）檢索OP關(guān)鍵詞“Osteoporosis”獲取靶點(diǎn)信息，根據(jù)靶點(diǎn)信息的Score值，篩選出與OP聯(lián)系緊密的關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)。

1.4 山藥、杜仲與OP 共同靶點(diǎn)篩選與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明確山藥-杜仲活性成分靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，將獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比后，取兩者交集，繪制Venn 圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org），物種限定為“Homo sapiens”，構(gòu)建“藥物-疾病”關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（key target protein protein interactions，PPI）。同時(shí)將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入“Cytoscape 3.7.2”，對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析將藥物-疾病相互作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息上傳至Metascape（http：//metascape.org）平臺(tái)，分別選定對(duì)關(guān)鍵基因所涉的生物進(jìn)程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞成分（cellular components，CC）和京東基因與基因組全書(shū)（Kyoto enlyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 山藥、杜仲活性成分的收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建經(jīng)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)在線檢索得到山藥的化學(xué)成分71個(gè)，杜仲化學(xué)成分147 個(gè)。通過(guò)ADME 參數(shù)篩選后得到山藥的活性成分16 個(gè)，杜仲活性成分28 個(gè)。剔除無(wú)作用靶點(diǎn)的活性成分，最終得到山藥-杜仲活性成分共38 個(gè)（山藥活性成分12 個(gè)，杜仲活性成分26 個(gè)，無(wú)重復(fù)活性成分），見(jiàn)表1。將基因靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分輸入“Cytoscape 3.7.2”，構(gòu)建山藥、杜仲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。

圖1 “山藥—杜仲”藥對(duì)成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 “山藥—杜仲”藥對(duì)主要成分

2.2 山藥-杜仲活性成分抗OP 的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集“2.1”項(xiàng)中山藥-杜仲的活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，剔除無(wú)效和重復(fù)的靶點(diǎn)后，得到山藥-杜仲的活性成分作用靶點(diǎn)共225 個(gè)。通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索OP 的作用靶點(diǎn)，共得到OP 的作用靶點(diǎn)4315 個(gè)，根據(jù)Score 值大于中位數(shù)篩選出關(guān)鍵基因1376 個(gè)。利用維恩圖在線繪制平臺(tái)制作維恩圖。見(jiàn)圖2。

圖2 “山藥—杜仲”藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)Venn圖

2.3 藥物-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 構(gòu)建將關(guān)鍵交集靶點(diǎn)基因80 個(gè)導(dǎo)入至STRING 平臺(tái)構(gòu)建PPI，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)共有80個(gè)節(jié)點(diǎn)、1250條邊，將該網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)信息上傳至“Cytoscape 3.7.2”，進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)加工制作，見(jiàn)圖3。根據(jù)各節(jié)點(diǎn)Degree 值、緊密度、介度等信息，查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步分析各節(jié)點(diǎn)與OP 的關(guān)聯(lián)程度。其中與OP 關(guān)聯(lián)程度較高的靶點(diǎn)主要有白蛋白（albumin，ALB）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腺苷酸激酶同工酶1（ATK1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、抑癌基因p53（tumor suppressor gene p53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等。

圖3 “山藥—杜仲”藥對(duì)作用于OP靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 和KEGG 富集分析結(jié)果應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選出的山藥-杜仲藥對(duì)與OP交集的80個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析，80 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)共涉及5030 個(gè)生物進(jìn)程，564 個(gè)分子功能，392 個(gè)細(xì)胞成分，富集在422條通路上（P＜0.01）。根據(jù)P值大小排列，分別選取BP、MF、CC前20位的進(jìn)行分析。其中生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等。分子功能主要涉及：受體調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 、蛋白酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞成分主要包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、內(nèi)吞小泡、質(zhì)網(wǎng)腔、核膜。見(jiàn)圖4—6。KEGG通路分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)富集在與骨質(zhì)疏松相關(guān)的重要通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等，選取P值前20的通路進(jìn)行分析，繪制高級(jí)氣泡圖，見(jiàn)圖7。

圖4 “山藥—杜仲”藥對(duì)作用于OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程分析

圖5 “山藥—杜仲”藥對(duì)作用于OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分子功能分析

圖6 “山藥—杜仲”藥對(duì)作用于OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO細(xì)胞成分分析

圖7 “山藥—杜仲”藥對(duì)作用于OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG分析氣泡圖

3 討論

OP 作為發(fā)病因素多樣的慢性全身代謝性骨病，其病理機(jī)制復(fù)雜，好發(fā)于老年人，尤以絕經(jīng)后婦女常見(jiàn)，增加了老年人骨折的風(fēng)險(xiǎn)［10］。目前抗OP 的一線藥物主要是雙膦酸鹽類藥物，這類藥物能夠抑制骨的過(guò)度吸收，達(dá)到抗OP 的目的，但副作用較大［11-12］。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中指出：“脾胃強(qiáng)健，飲食水谷……充養(yǎng)骨髓；反之，脾胃虛弱……無(wú)以充養(yǎng)后天之精，勢(shì)必精虧髓枯而百骸萎廢”，說(shuō)明OP的發(fā)生多責(zé)之于腎虧脾虛。曹貽訓(xùn)教授在“益腎健脾法”的理論指導(dǎo)下，以大劑量“山藥-杜仲”為主藥治療OP，療效顯著。

本研究在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及查閱文獻(xiàn)，共獲得“山藥-杜仲”藥對(duì)存在明確作用靶點(diǎn)的活性成分有薯蕷皂苷元、花旗松素、槲皮素、山柰酚等38個(gè)。研究表明，山藥中的薯蕷皂苷元可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及抑制破骨細(xì)胞形成，減緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展［14］。花旗松素具有良好的抗氧化、抑制細(xì)胞焦亡、抗炎作用，且能抑制破骨細(xì)胞活性并降低破骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)［15-16］。研究表明，杜仲提取物可顯著抑制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型、骨密度的降低及骨微結(jié)構(gòu)的改變［13］。槲皮素和山柰酚是杜仲的主要成分，山柰酚是一種存在于植物中的膳食生物類黃酮，有廣泛的藥用特性。WONG 等［17］發(fā)現(xiàn)，山柰酚可以抑制脂肪生成、炎癥、氧化應(yīng)激、破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活成骨細(xì)胞自噬，實(shí)現(xiàn)骨保護(hù)。此外，YUAN 等［18］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）增殖和成骨分化，并保護(hù)MSCs 免受TNF-α 誘導(dǎo)的成骨損傷，從而顯著改善VOX大鼠OP。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示山藥-杜仲藥對(duì)作用于OP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)有ALB、IL-6、ATK1、VEGFA、MMP9、TP53、ESR1等，ALB和IL-6是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要成分，可加速骨質(zhì)疏松進(jìn)程［19-20］。MUKHERJEE 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，ATK1是成骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，且ATK1在成骨細(xì)胞偶聯(lián)破骨細(xì)胞生成的過(guò)程中，具有強(qiáng)陽(yáng)性介質(zhì)的獨(dú)特作用，因此ATK1 的抑制能夠明顯的增加骨重塑，有效控制OP。MMP-9 是屬于MMPs 家族的一類依賴鋅離子來(lái)水解胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞中MMP-9的基因表達(dá)度較高，應(yīng)用MMP-9合成抑制類藥物，可以有效抑制破骨細(xì)胞的吸收［22-23］。雌激素缺乏引起的絕經(jīng)后OP是最常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松類型，雌激素受體主要有兩種結(jié)構(gòu)相似的亞型，即ESR1 和ESR2。研究證明ESR1 有與髖部骨密度呈顯著相關(guān)性的基因位點(diǎn)，且具有遺傳傾向，運(yùn)用ESR 調(diào)節(jié)劑可有效增高PMOP 患者的骨密度，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)［24-26］。此外，TP53、VEGFA 也通過(guò)基因的多態(tài)性表達(dá)影響OP的發(fā)生［27-28］。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，藥物作用于疾病的靶點(diǎn)集中在炎癥反應(yīng)、成骨-破骨的動(dòng)態(tài)偶聯(lián)和人體內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)等方面，與OP的發(fā)病因素的多樣化一致。

KEGG 分析可見(jiàn)，“山藥-杜仲”藥對(duì)作用于OP的通路主要包括AGE-RAGE信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。研究表明，AGE-RAGE 信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松的治療中起著關(guān)鍵作用［29-30］。HIF-1α 是HIF-1信號(hào)通路的主要激活蛋白，且具有促進(jìn)破骨細(xì)胞形成、增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性的作用［31］。此外，p53 信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路都是作用于OP 的重要通路，能夠刺激P53、TGF-β等調(diào)節(jié)因子的釋放，加重骨質(zhì)疏松的發(fā)展［27，32］。

綜上所述，益腎健脾藥對(duì)“山藥-杜仲”可能參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物進(jìn)程，通過(guò)細(xì)胞因子的生成與釋放、調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)AGE-RAGE 信號(hào)通路、HIF-1 等信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)對(duì)OP 可以起到治療作用，進(jìn)一步揭示益腎健脾藥對(duì)“山藥-杜仲”與骨質(zhì)疏松之間“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用。