苗藥組方熏蒸療法對(duì)家兔早期膝骨性關(guān)節(jié)炎模型的差異基因分析及聚類分析*

張力文，王興桂，李 春，龐 平

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 花溪 550025

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）作為骨科常見(jiàn)疾病，在臨床上主要見(jiàn)于40 歲以上人群，年齡越大，患病率越高，女性發(fā)病多于男性［1］。主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵硬、畸形及關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，嚴(yán)重者可出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)內(nèi)、外翻，導(dǎo)致行走困難，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。近年來(lái)人口的老齡化趨勢(shì)加劇，早期KOA 患者日益增多［2］。研究表明，慢性勞損、肥胖、遺傳、氣候、飲食、細(xì)胞因子異常及自身免疫反應(yīng)等因素與早期KOA 的發(fā)病有密切聯(lián)系，其中遺傳因素是早期KOA 發(fā)病的最重要因素。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外眾多研究者認(rèn)為基因變異是早期KOA 的發(fā)病的關(guān)鍵因素。申成凱等［3-4］發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的基因變異可加重早期KOA 的患病風(fēng)險(xiǎn)。流行病學(xué)研究表明，KOA 影響因素是眾多的，但是影響KOA進(jìn)展的關(guān)鍵因素是遺傳因素［5-7］?，F(xiàn)在基因表達(dá)方面的研究主要依靠基因芯片的檢測(cè)技術(shù)，治療KOA 的研究重點(diǎn)是找尋易感部位，因此運(yùn)用基因芯片檢測(cè)技術(shù)篩選出的差異基因表達(dá)，可作為KOA 早診斷和靶向治療的生物標(biāo)記物［8］。前期實(shí)驗(yàn)表明，苗藥熏蒸療法可以改善早期KOA 的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)具有很好的止痛作用，苗藥熏蒸療法主要是經(jīng)皮直接作用，使熏蒸產(chǎn)生的藥氣通過(guò)皮膚黏膜滲入，是苗醫(yī)獨(dú)特的“以毒攻毒”治療方法，具有操作簡(jiǎn)便、綠色、副作用小等特點(diǎn)。但是這種治療早期KOA 的外治療法的具體機(jī)制以及其在基因表達(dá)譜方面有何改變，目前尚不清楚，因此本研究的主要目的是探索苗藥熏蒸療法治療早期KOA 在基因表達(dá)譜方面的改變，以期探明其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3 月齡新西蘭兔40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（0.50±0.10）kg，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCKK（黔）2018-0001。飼養(yǎng)條件：在室溫下標(biāo)準(zhǔn)育成飼料飼養(yǎng)，自由飲水，飲用干凈的自來(lái)水，飼養(yǎng)室溫度控制在24 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度控制在7%左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)周漢華教授鑒定的貴州苗族熏蒸外用處方［9］，藥物組成：透骨香30 g，艾納香30 g，白龍須6 g，大血藤10 g，五香血藤10 g，土一枝蒿10 g，艾葉10 g 等。將上述藥物煎煮成68%～70%藥液后備用。

1.3 試劑及儀器HB-4000 型中藥熏蒸機(jī)（蘇州好博醫(yī)療器械有限公司）；SIM-E124 型制冰機(jī)（三洋）；Leica2135 型切片機(jī)（泰州市開(kāi)發(fā)區(qū)鵬翔機(jī)械設(shè)備有限公司）；TXS-SP2 型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)LEICA 公司）；TRIzol（Invitrogen 公司）；Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix，批號(hào)：900433）；Ambion? WT Expression Kit※（Affymetrix，批號(hào)：4011974）；WT Terminal Labeling Kit：（Affymetrix，批號(hào)：900671）；4-20% TBE Gel、1.0，mm、12，well（Invitrogen，批號(hào)：EC62252）；SYBR Gold（目錄號(hào)：S-11494）；Molecular Probes10 bp DNA ladder（Invitrogen，批號(hào)：10821-015）；100 bp DNA ladder（Invit-rogen，批號(hào)：15628-019）；NeutrAvidin Biotin Binding Protein（Pierce Chemical，批號(hào)：31000）；Eukaryotic Hybridization Control Kit（Affymetrix，批號(hào)：900454）；Hybridization、Wash、and Stain Kit（Affymetrix，批號(hào)：901667）；Hybridization Module from Box 1（Affymetrix 5X WT Hyb Add1，批號(hào)：901618）；Wash Buffers A and B from Box2（Affymetrix，批號(hào)：901625）。

1.4 造模方法按照文獻(xiàn)［10］的造模方法：將含量為1.6%的木瓜蛋白酶0.5 mL 注入兔的右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，隔3 天后再注射1 次，共2 次。造模成功后，隨機(jī)抽取2 只，通過(guò)觀察其關(guān)節(jié)外形變化、光鏡觀察及Mankin，s評(píng)分［11］鑒定是否造模成功。

1.5 分組及處理將40 只3 月齡新西蘭兔隨機(jī)分為空白組、模型組、苗藥熏蒸組、清水組，每組10 只?？瞻讓?duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)，不造模，每天驅(qū)趕其不停運(yùn)動(dòng)20 min。模型對(duì)照組：普通飼料喂養(yǎng)，造模后每天驅(qū)趕其不停運(yùn)動(dòng)20 min。苗藥熏蒸組：普通飼料喂養(yǎng)，造模的第1 天就開(kāi)始熏蒸治療，每天將提前煎好的藥液放于熏蒸器里，加熱到39～40 ℃時(shí)，開(kāi)始熏蒸治療，每次10 min。清水熏蒸組：普通飼料喂養(yǎng)，造模的第1 天就開(kāi)始熏蒸治療，每天將清水放于熏蒸器里，加熱到39～40 ℃時(shí)，開(kāi)始熏蒸治療，每次10 min。當(dāng)治療滿20 天后處死。

1.6 取材方法將上述處死后的兔右膝關(guān)節(jié)軟骨，用1%DEPC 水沖洗后，用切取l cm×l cm 全層軟骨，用低溫PBS 液反復(fù)沖洗后，置于凍存管內(nèi)迅速放入液氮罐中。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 軟骨的RNA 提取法 將取得的軟骨組織稱量后研磨成粉狀，然后放于含有Trizol 液的離心管中。總RNA 的提取是參照異丙醇沉淀法［12］；純化按照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)操作，最后置于-20 ℃中保存。

1.7.2 軟骨組織的基因表達(dá)譜的測(cè)定 采用異丙醇沉淀法提取total RNA，取2 μL 提取出的RNA，進(jìn)行電泳，通過(guò)28S、18S 條帶的清晰度判斷RNA 的純度，當(dāng)RNA 的吸光度值（A260/A280、A260/A230）和濃度是1.8～2.0 時(shí)，說(shuō)明RNA 的純度高。然后行基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)程序，所有的芯片檢測(cè)及數(shù)據(jù)匯總由北京博奧生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將基因芯片檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入分析軟件，得到ratio值后，使用GeneAtlas?Workstation 將芯片的熒光掃描圖像保存成.ga.DAT文件，并進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。用RMA算法預(yù)處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行DEG 分析，然后將每個(gè)樣品的全基因表達(dá)，進(jìn)行聚類分析，數(shù)據(jù)的分析由北京博奧生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織的RNA 提取結(jié)果RNA 純度：A260/280≥1.70，RNA 總量：總量≥1 μg，符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA 完整性：RNA 樣品電泳條帶清晰，28S：18SrRNA條帶亮度大于或接近1∶1，質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組電泳圖

2.2 聚類分析結(jié)果每個(gè)組別的標(biāo)本大體可歸為一類，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)性好，每個(gè)治療組與對(duì)照組的基因表達(dá)有各自特點(diǎn)，軟骨組織改變是KOA 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，且通過(guò)苗藥熏蒸治療后它的分子機(jī)制及基因表達(dá)發(fā)生特殊改變。見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)樣品的聚類分析結(jié)果（具體編號(hào)同電泳圖）

2.3 芯片雜交掃描結(jié)果各組熒光信號(hào)強(qiáng)度較高、背景均一，未見(jiàn)缺陷，符合基因芯片結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 芯片雜交結(jié)果分析散點(diǎn)圖結(jié)果模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較基因表達(dá)上調(diào)，差異顯著且數(shù)量最多，進(jìn)一步分析得出苗藥熏蒸組與模型對(duì)照組相對(duì)清水熏蒸組與模型對(duì)照組比較，有差異的基因最顯著且數(shù)目最多。見(jiàn)圖3—5。

圖3 清水熏蒸組與模型對(duì)照組重疊的散點(diǎn)圖比較

圖4 苗藥熏蒸組與模型對(duì)照組重疊的散點(diǎn)圖比較

圖5 模型對(duì)照組與空白對(duì)照組重疊的散點(diǎn)圖比較

2.5 DEG總體分析結(jié)果

2.5.1 模型對(duì)照組與空白對(duì)照組重疊后差異基因 對(duì)兩個(gè)樣本分別進(jìn)行差異基因的分析，進(jìn)行重疊后鑒定出差異基因總數(shù)共23283個(gè)，其中827個(gè)基因表達(dá)差異顯著，392 個(gè)下調(diào)，435 個(gè)上調(diào)，大于2倍308個(gè)，大于3倍60個(gè)，大于4倍20個(gè)，大于5 倍18 個(gè)，大于6 倍7 個(gè)，大于7 倍12 個(gè)，大于8 倍4 個(gè)，大于10 倍1 個(gè)，大于11 倍2 個(gè)，大于13 倍1個(gè)，大于16倍1個(gè)，大于17倍1個(gè)。由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻(xiàn)，將目前已知學(xué)術(shù)界認(rèn)同的影響KOA 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的模型對(duì)照組顯著表達(dá)的基因進(jìn)行簡(jiǎn)單描述。見(jiàn)表2。

表2 模型對(duì)照組影響KOA發(fā)生發(fā)展顯著表達(dá)的基因

2.5.2 苗藥熏蒸組相對(duì)模型對(duì)照組重疊后差異基因 對(duì)兩個(gè)樣本分別進(jìn)行差異基因的分析，進(jìn)行重疊后鑒定出差異基因符合有效信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)的基因總數(shù)共23283 個(gè)，與模型組相比較苗藥熏蒸組存在差異表達(dá)顯著的基因有208 個(gè)，96 個(gè)下調(diào)，112 個(gè)上調(diào)，大于2 倍87 個(gè)，大于3 倍10 個(gè)，大于4倍4 個(gè)，大于5 倍4 個(gè)，大于6 倍1 個(gè)，大于7 倍2個(gè)，大于9 倍1 個(gè)，大于12 倍1 個(gè)，大于20 倍1 個(gè)，大于24倍1個(gè)。由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻(xiàn)，將目前已知學(xué)術(shù)界認(rèn)同的影響KOA 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的苗藥熏蒸組顯著表達(dá)的基因簡(jiǎn)單描述。見(jiàn)表3。

2.5.3 清水熏蒸組相對(duì)模型對(duì)照組重疊后差異基因 對(duì)兩個(gè)樣本進(jìn)行差異基因分析，進(jìn)行重疊后鑒定出符合有效信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)的基因總數(shù)共23283個(gè)，其中有152 個(gè)基因表達(dá)顯著差異，93 個(gè)上調(diào)，59 個(gè)下調(diào)，大于2 倍63 個(gè)，大于3 倍18 個(gè)，大于4倍的有6 個(gè)，大于5 倍的有1 個(gè)，大于6 倍的有2個(gè)，大于9 倍的有1 個(gè)，大于11 倍的有1 個(gè)，大于19 倍的有1 個(gè)，由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻(xiàn)，將目前已知學(xué)術(shù)界認(rèn)同的影響KOA 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的清水熏蒸組顯著表達(dá)的基因進(jìn)行簡(jiǎn)單描述，見(jiàn)表4。

表4 清水熏蒸組影響KOA發(fā)生發(fā)展顯著表達(dá)的基因

2.5.4 3 組重疊差異基因表達(dá)數(shù)目 通過(guò)上面描述，我們對(duì)三組重疊差異基因表達(dá)數(shù)目進(jìn)行比較。見(jiàn)表5。

表5 3組差異基因統(tǒng)計(jì)表

3 討論

KOA 是中老年人群的常見(jiàn)病與多發(fā)病，女性發(fā)病率高于男性，臨床主要以膝關(guān)節(jié)腫脹、變形、疼痛、活動(dòng)受限為主要臨床表現(xiàn)［13］。人體最重要的負(fù)重關(guān)節(jié)是膝關(guān)節(jié)，人體的行走、運(yùn)動(dòng)等功能的正常與否直接與膝關(guān)節(jié)息息相關(guān)，KOA 的發(fā)生會(huì)使人體活動(dòng)受限，而且KOA 患者會(huì)有不同程度的疼痛，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，導(dǎo)致患者長(zhǎng)期缺乏鍛煉而發(fā)生其他疾病。目前KOA 的發(fā)病機(jī)制還不清楚，目前治療KOA 以西醫(yī)對(duì)癥治療為主，可以改善患者關(guān)節(jié)功能、緩解臨床癥狀，病情進(jìn)展時(shí)時(shí)采取手術(shù)療法，但是治療的效果有限，費(fèi)用昂貴、容易復(fù)發(fā)、副作用大［14］。

本研究采用的苗藥熏蒸療法是貴州地區(qū)治療KOA 最常用的治療方法，歷史悠久且應(yīng)用基礎(chǔ)良好。我們?cè)谇捌陂_(kāi)展了相關(guān)的一系列實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究，證明本苗藥經(jīng)驗(yàn)方治療KOA 療效顯著。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及分子生物的發(fā)展，相關(guān)研究表明對(duì)KOA的發(fā)生具有決定性作用的是遺傳因素［15-17］。因此通過(guò)研究苗藥經(jīng)驗(yàn)方治療KOA 的差異性基因的篩選和研究將為早期KOA 的診治、預(yù)防、診斷提供理論依據(jù)及參考?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)融合了分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)信息技術(shù)等眾多學(xué)科技術(shù)，作為一項(xiàng)研究基因組前沿生物技術(shù)，具有多樣化、自動(dòng)化、微型化、高通量及高集成等優(yōu)點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)：1）空白對(duì)照組與模型對(duì)照組差異表達(dá)基因有827 個(gè)，435 個(gè)上調(diào)，392 個(gè)下調(diào)，通過(guò)分析這些差異基因與早期KOA 軟骨組織的改變，得到一系列與KOA相關(guān)基因。有研究發(fā)現(xiàn)KOA的發(fā)生原因是關(guān)節(jié)軟骨的降解，這與MMPs 在滑膜組織中的顯著表達(dá)有關(guān)［18］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP14（NM-001082793）等基因上調(diào)，抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶抑制劑TIMP4（NM-001195690）等基因下調(diào)，模型成功的關(guān)鍵與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致軟骨損傷有關(guān)。模型組中BCL2L1（NM-001082135）基因發(fā)生上調(diào)，該基因可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，因此該基因的差異表達(dá)與本模型復(fù)制成功相關(guān)，同時(shí)在研究中我們還發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膹?fù)制成功與影響細(xì)胞增殖的核糖體蛋白類RPL22（ENSOCUT00000028925）、LOC100354714（XM-002718133）、LOC100352995（XM-002709326）等基因表達(dá)有關(guān)，因?yàn)樵诒狙芯恐兴鼈兙l(fā)生了下調(diào)?？傊?，通過(guò)對(duì)模型對(duì)照組差異基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)本模型復(fù)制是成功的，且得出KOA 是一種多基因疾病。2）苗藥熏蒸組與模型對(duì)照組差異基因有208 個(gè)，有112 個(gè)上調(diào)，有96 個(gè)下調(diào)。通過(guò)整體分析這些差異基因與KOA 軟骨組織的改變，得到一系列與KOA表達(dá)相關(guān)的差異基因。我們發(fā)現(xiàn)，苗藥熏蒸療法可以促進(jìn)細(xì)胞增殖KGF（NM-001195837）、微纖蛋白類MFAP5（ENSOCUT00000-002406）等上調(diào)，可以通過(guò)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的活性，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。同時(shí)本課題還發(fā)現(xiàn)苗藥熏蒸療法可以上調(diào)保護(hù)軟骨周圍組織不被過(guò)度的酶解，保證彈性蛋白酶發(fā)揮正常，這是通過(guò)被抑制的組織蛋白酶ECTSE（NM-001082244）實(shí)現(xiàn)的。與細(xì)胞免疫相關(guān)的中性粒細(xì)胞激活肽ENA-78（AF123437）基因、巨噬細(xì)胞清道夫受體MSR1（NM-001082248）基因等上調(diào)，和能量相關(guān)及內(nèi)吞的肌聯(lián)蛋白TTN（Y18102）基因、整合素ITGB8（NM-001082304）等上調(diào)，調(diào)節(jié)炎性因子的趨化配體CCL14（ENSOCUT00000027247）等下調(diào)，苗藥熏蒸療法可以通過(guò)提高能量代謝、增加細(xì)胞免疫、抑制炎癥和促進(jìn)內(nèi)吞作用來(lái)延緩KOA 的發(fā)生發(fā)展。3）清水熏蒸組與模型對(duì)照組有152個(gè)差異基因，有93個(gè)上調(diào)，59個(gè)下調(diào)，通過(guò)分析我們得出，細(xì)胞免疫相關(guān)中性粒細(xì)胞激活肽ENA-78（AF123437）等上調(diào)，能量相關(guān)的輔肌動(dòng)蛋白ACTN3（X62075）基因等上調(diào)，清水熏蒸法可以通過(guò)它的熱療法來(lái)提高能量代謝、增加細(xì)胞免疫等作用來(lái)緩解KOA關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)生發(fā)展。4）通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)苗藥熏蒸法與清水熏蒸法延緩早期KOA 的關(guān)節(jié)軟骨退變，但是苗藥熏蒸的差異基因更為顯著（＞20 倍的差異基因有2 個(gè)）：而與能量相關(guān)的MYL1（NM-001101713）基因上調(diào)（＞24 倍），苗藥熏蒸有208個(gè)基因發(fā)生顯著差異，清水熏蒸僅有152 個(gè)基因發(fā)生顯著差異。進(jìn)一步分析這些DEG，苗藥熏蒸DEG顯著表達(dá)與早期KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此苗藥熏蒸療法延緩早期KOA 的發(fā)生發(fā)展可以通過(guò)它的藥療和熱療共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，療效優(yōu)于清水熏蒸法，今后我們將進(jìn)一步探討起作用的“關(guān)鍵基因”。

綜上所述，通過(guò)基因芯片檢測(cè)技術(shù)篩選出與早期KOA發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異基因，發(fā)現(xiàn)早期KOA的發(fā)病是多基因的共同作用，進(jìn)一步對(duì)這些基因進(jìn)行分析，可以找到苗藥熏蒸療法治療KOA 的關(guān)鍵基因，為早期KOA的診治提供新方法、新思路。