滋月萃降糖方介導Fetuin B-AMPK/ACC 通路對高脂誘導肥胖小鼠肝臟胰島素抵抗的調控機制研究*

劉曼曼，馮珍鳳，胡春平，陳見紡，沈怡華，高俊鳳，嚴 軍△

1 上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201899； 2 上海中醫(yī)藥大學研究生院，上海 201203

近年來，肥胖導致的代謝綜合征發(fā)病率逐年增長［1］。肥胖是由于能量攝入大于消耗導致的一種代謝障礙狀態(tài)，受到生活狀態(tài)、環(huán)境、遺傳等多種因素的共同影響。而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其發(fā)病的關鍵因素，并貫穿發(fā)病過程的始終。肝臟在全身代謝調節(jié)中發(fā)揮著至關重要的作用，肝臟IR 導致的代謝紊亂是影響機體葡萄糖和脂質代謝的關鍵［2］。Fetuin B 是近年來新發(fā)現的半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，是一種新型的肝臟分泌蛋白，由肝臟產生分泌入血［3］。研究表明，Fetuin B增多會引起糖代謝和脂代謝異常，且Fetuin B 在體內長期積累會增加罹患IR的風險，但其在代謝中的具體作用機制尚不明確［4-5］。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）即絲氨酸/蘇氨酸激酶AMP 依賴的蛋白激酶，是一種重要的能量感應酶，是調節(jié)機體能量代謝的總開關。乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是一種依賴生物素的變構羧化酶，是AMPK 的下游分子，AMPK/ACC 通路抑制可加重IR，從而加劇葡萄糖和脂質代謝紊亂。最新的一項研究表明，Fetuin B抑制胰島素信號傳導，加重心肌缺血再灌注損傷。大量研究表明，在嚙齒動物中，心肌缺血再灌注損傷可通過激活AMPK/ACC通路改善心肌IR，起到保護心臟的作用［6-9］。

滋膵降糖方是上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內分泌科的臨床經驗方，相關臨床研究證實滋膵降糖方可有效改善2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者高體質量及IR［10-11］，但具體機制仍需進一步研究探索。本實驗采用高脂飲食誘導建立C57BL/6J小鼠IR模型，觀察其肝臟組織Fetuin B及AMPK、ACC相關表達，計算糖耐量曲線下面積（area under ROC curve，AUC）和胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment-estimated insulin resistance，HOMA-IR），從新的角度探討滋膵降糖方改善IR的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇SPF 級健康C57BL/6J 小鼠50只，6周齡，雄性，體質量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：北京百善SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：北京SYXK（京）2017-0033。飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)于北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0011；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2017-0014。SPF 級實驗動物設施IVC 系統(tǒng)，動物房溫度（22±5）℃，相對濕度（50±10）%，明暗周期12 h∶12 h，鼠籠每日清潔消毒，所有小鼠自由飲水，自由飲食。動物飼料為60%Kcal High-Fat（DIO）Diet（美國RDI，貨號：D12492）。本實驗經上海中醫(yī)藥大學倫理會委員會批準。

1.2 實驗藥物滋膵降糖方組成：生黃芪20 g，山萸肉10 g，山藥15 g，生地黃15 g，黃連6 g，葛根15 g，鬼箭羽10 g。上述顆粒制劑購自上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，批號：20190863。鹽酸二甲雙胍片（格華止）（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370）。

1.3 試劑與儀器小鼠胰島素ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：CSB-E05071m）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術公司，批號：P0013，P0033），ECL 發(fā)光劑（上海碧云天生物技術公司，批號：P0018S）；BCA試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：C503021］；AMPKα1（批號：ab32047）、P-AMPKαT183/T172（批號：ab133448）、ACC（批號：ab45174）、P-ACCS79（批號：ab68191）Antibody均購自英國abcam公司；內參抗體GAPDH（英國abcam公司，批號：ab9485；成都正能生物技術公司，批號：AF7021）；Fetuin B Antibody（成都正能生物技術公司，批號：384299）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物科技技術股份有限公司，批號：R212-02）。卓越型羅氏血糖儀（上海魚躍醫(yī)療設備公司）；GL-20G-II 型高速恒溫冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；ATPIO-650D 型超聲波細胞粉碎機（南京先歐生物科技有限公司）；微量移液器（日本NICHIRYO 公司）；SLAN-96P 全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；Thermo-117123001 型酶標儀（美國賽默飛公司）；GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING（美國Bio Tek Instruments，Inc公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備 小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機選擇40只小鼠進行造模，10只小鼠作為空白對照組，給予普通飼料；其余40 只給予高脂飼料建立IR模型，每周進行體質量稱量記錄，持續(xù)時間為8周。造模結束后，所有小鼠隔夜禁食，次日尾靜脈取血行空腹注射葡萄糖耐量實驗（intraperitioneal glucose tolerance trial，IPGTT），根據IPGTT實驗結果及糖耐量曲線判斷IR模型建立是否成功（AUC高于正常組均值的小鼠視為IR模型小鼠）［12］。

1.4.2 分組及給藥 按照標準，造模成功的小鼠共32 只，采用隨機數字表的方法將造模成功的小鼠分為模型組、滋膵降糖方組、二甲雙胍組和聯合組，每組8 只。按人標準體質量60 kg，人的每日服藥量是91 g/60 kg=1.52 g/kg，根據黃繼漢《藥理實驗中動物間和動物與人間的等效劑量換算》的藥物和人的體質量劑量系數，換算為1.52×12.33/1000=0.0187416?？瞻讓φ战M和模型組給予0.9%生理鹽水灌胃，滋膵降糖方組給予滋膵降糖方18.741 g/kg 灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍混懸液0.103 g/kg 灌胃，聯合組給予滋膵降糖方聯合二甲雙胍灌胃，持續(xù)給藥4周。

1.4.3 標本取材 小鼠給藥4周后，隔夜禁食8 h，予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，眼球取血，離心，取上清，-20 ℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗；快速取出肝臟，并稱質量，-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠一般情況監(jiān)測 實驗過程中，每天觀察并記錄小鼠的毛色、飲食、飲水及二便情況、精神狀態(tài)，每周定時記錄小鼠體質量，直至給藥結束。

1.5.2 血清胰島素（fasting insulin，FINS） 以小鼠胰島素酶聯免疫試劑盒測定小鼠血清胰島素濃度，嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。根據公式計算胰島素抵抗指數HOMA-IR［13］。

1.5.3 IPGTT 給藥4 周后，行IPGTT。隔夜禁食，25%葡萄糖溶液腹腔注射，于注射前（0 min），注射后30、60、120 min 時分別測定血糖水平，根據梯形公式計算AUC［14］。

1.5.4 Q-RT-PCR法檢測小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC 通路mRNA 表達 取小鼠肝臟組織100 mg，加入液氮研磨后備用。使用Trizol試劑提取小鼠肝臟組織總RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書操作，去除基因組的DNA，將總RNA 逆轉錄成單鏈cDNA，進行實時熒光定量PCR，配制PCR 反應體系，每個基因做3 個復孔和1個陰性對照，在PCR 分析儀上進行DNA 擴增，擴增反應條件為變性（95 ℃，30 s）、退火（58 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，30 s）30個循環(huán)。以β-actin 為內參基因，校正目標基因的熒光強度。所有引物由上海東寰生物科技有限公司設計合成。見表1。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.5.5 Western Blot法檢測小鼠肝臟Fetuin BAMPK/ACC通路蛋白表達 取小鼠肝臟組織100 mg，液氮研磨后加入含有97%RIPA+1%PMSF+1%蛋白酶抑制劑+1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液及相關抑制劑中，勻漿液離心，4 ℃，12 000 r/min，3 min，取上清。按照BCA 蛋白質濃度測定試劑盒完成蛋白定量；制備聚丙烯酰胺凝膠，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37 ℃下在封閉液中封閉PVDF膜1 h，洗膜，將膜放在一抗稀釋液中（按說明書稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次15 min。將洗好的膜放入稀釋好的二抗中（按說明書稀釋），室溫孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，每次15 min。顯影：ECL 發(fā)光試劑盒顯影，用GENE GNOME 系統(tǒng)曝光顯像，導出圖片，用ImageJ 軟件對條帶進行灰度值分析，以GAPDH為內參蛋白，校正目的蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0 軟件對數據進行處理，計量資料采用表示，滿足正態(tài)性、方差齊性的計量資料采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗；滿足正態(tài)性，不滿足方差齊性時，組間多重比較用Dunnett′s T3 檢驗。不滿足正態(tài)性、方差齊性的計量資料用非參數的秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量、肝質量及肝體比給藥4 周期間，滋膵降糖方組、二甲雙胍組和聯合組與模型組相比小鼠體質量增加緩慢（P＜0.05），滋膵降糖方組小鼠體質量（自給藥第3 周開始）明顯低于模型組（P＜0.05）；末次給藥后，模型組小鼠體質量、肝臟質量和肝體比明顯高于空白對照組（P＜0.01）；滋膵降糖方組、二甲雙胍組和聯合組肝臟質量和肝體比明顯低于模型組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠體質量、肝質量、肝體比比較（）

表2 各組小鼠體質量、肝質量、肝體比比較（）

注：與空白對照組比較，▲表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，△表示P＜0.01

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2.2 小鼠FINS、HOMA-IR 水平與空白對照組比較，模型組小鼠FINS、HOMA-IR顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，滋膵降糖方組、二甲雙胍組和聯合組FINS、HOMA-IR 均明顯下降（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠血清FINS水平、HOMA-IR比較（）

表3 各組小鼠血清FINS水平、HOMA-IR比較（）

注：與空白對照組比較，▲表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.01

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2.3 小鼠IPGTT水平與空白對照組比較，模型組小鼠各個時間點的血糖值均顯著升高（P＜0.01），AUC 明顯增大（P＜0.01）。與模型組比較，聯合組及二甲雙胍組能顯著降低0、30、60、120 min 時間點的小鼠血糖水平（P＜0.05）；滋膵降糖方組有效改善0、120 min 血糖（P＜0.05）。與模型組比較，給藥各組的AUC顯著減少（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠IPGTT水平比較（）

表4 各組小鼠IPGTT水平比較（）

注：與空白對照組比較，▲表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，△表示P＜0.01

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2.4 小鼠肝臟Fetuin B、AMPK、ACC mRNA 相對表達量與空白對照組比較，模型組小鼠Fetuin B，ACC mRNA表達升高（P＜0.01），AMPK mRNA表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，滋膵降糖方組、二甲雙胍組和聯合組Fetuin B、ACC mRNA表達均下降（P＜0.01），AMPK mRNA 表達明顯上升（P＜0.01）；其中聯合組優(yōu)于滋膵降糖方組、二甲雙胍組（P＜0.05），滋膵降糖方組優(yōu)于二甲雙胍組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠肝臟Fetuin B、AMPK、ACC的mRNA表達比較（）

表5 各組小鼠肝臟Fetuin B、AMPK、ACC的mRNA表達比較（）

注：與空白對照組比較，▲表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.01；與滋膵降糖方組比較，#表示P＜0.05；與二甲雙胍組比較，*表示P＜0.01

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2.5 小鼠肝臟Fetuin B-AMPK/ACC 通路蛋白表達與空白對照組比較，模型組小鼠Fetuin B蛋白表達明顯增加，P-AMPKαT183/T172/AMPKα1，P-ACCs79/ACC水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟Fetuin B蛋白表達均下降，P-AMPKαT183/T172/AMPKα1、P-ACCs79/ACC水平升高（P＜0.05）。組間比較，聯合組下調Fetuin B蛋白表達，上調P-AMPKαT183/T172/AMPKα1、P-ACCs79/ACC水平效果優(yōu)于滋膵降糖方組、二甲雙胍組（P＜0.05），滋膵降糖方組上述指標改善優(yōu)于二甲雙胍組，上調P-AMPKαT183/T172/AMPKα1水平優(yōu)于二甲雙胍組（P＜0.05），但上調P-ACCs79/ACC水平與二甲雙胍組無差異（P＞0.05）。見表6、

表6 各組小鼠肝臟Fetuin B、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表達比較（）

表6 各組小鼠肝臟Fetuin B、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表達比較（）

注：與空白對照組比較，▲表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.05；與滋膵降糖方組比較，#表示P＜0.05；與二甲雙胍組比較，*表示P＜0.01

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圖1 各組小鼠肝臟FetuinB、P-AMPK/AMPK、P-ACC/ACC蛋白表達電泳圖

3 討論

IR 是肥胖、T2DM 等代謝性疾病發(fā)病的核心機制，肝臟是胰島素作用的主要靶器官之一［2］，由于糖代謝異常往往伴有脂代謝紊亂，IR 又會加重糖脂代謝異常，因此改善肝臟IR 是預防、控制代謝性疾病的有效機制。由于飲食結構的改變，糖尿病等代謝性疾病的臨床特征已經發(fā)生了極大變化，以IR 及糖脂代謝紊亂的患者為主體人群。中醫(yī)傳統(tǒng)意義上的“三消”理論及“陰虛為本、燥熱為標”的基本病機已不能完全概括其病因病機及基本的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。若長期過食、少動，易引起食郁，繼而郁久化熱，耗氣傷陰，加之食郁傷脾，脾運化失司，最終導致氣陰兩虛［15］。故基于前人理論，筆者提出了現代糖尿病代謝性疾病的核心病機為氣陰兩虛為本，郁熱為標。并以晚清醫(yī)家張錫純名方“滋膵飲”為基礎方加減創(chuàng)制效方“滋膵降糖方”。方中以黃芪為主藥，補中益氣；生地黃滋腎清熱，上以潤肺，協(xié)同山萸肉以封固腎關；山藥善治消渴，性甘平，益腎補脾陰，止小便頻數，且潤肺生津止渴，與甘溫偏于補脾陽之黃芪配合，一陰一陽，氣陰兼顧；鬼箭羽活血通絡，推陳致新，并使補益藥補而不壅滯；葛根、黃連清熱滋脾。全方寒溫并用、補瀉兼施、陰陽相濟、氣陰雙補、標本兼治，諸藥并用行健脾益氣，清熱養(yǎng)陰，活血通絡之功。前期研究證實該方除可改善患者高血糖、高血脂和高體質量狀態(tài)外，還可改善IR 及胰島β細胞功能［10-11］。

Fetuin B 被證實是一種影響糖脂代謝的重要新型肝臟細胞因子，基因位于鼠16 號染色體，人3 號染色體，而該位點是糖尿病等代謝疾病的遺傳基因易感位點［16-17］。RUTH等［18］研究發(fā)現，高脂飲食誘導小鼠肝原代細胞胰島素敏感性受損，是因脂肪變性改變肝細胞的蛋白分泌，Fetuin B分泌異常增多所致。一項基于人群的臨床研究發(fā)現T2DM 患者的Fetuin B 水平顯著升高，與FINS、HOMA-IR 呈正相關［19］。這與研究結果一致，提示Fetuin B 在促進IR 中發(fā)揮重要作用。XING 等［6］研究表明，T2DM 小鼠敲除Fetuin B 基因后，心臟Fetuin B 水平降低，胰島素受體底物1、絲氨酸位點磷酸化增強，心肌組織胰島素信號傳導改善，進而心肌缺血再灌注損傷得以緩解。故Fetuin B被認為是T2DMIR中的關鍵因子。

AMPK 是一種高度保守的蛋白激酶，是能量代謝調控中樞，作為調節(jié)糖脂代謝的關鍵酶，參與葡萄糖、脂肪酸的合成和氧化分解，在正常生理狀態(tài)下，AMP/ATP比率上升時，AMPK就被激活，抑制消耗能量的生物合成途徑，激活產生ATP的分解代謝途徑，調節(jié)細胞能量代謝平衡［20］。在高血糖、高血脂的病理環(huán)境下，AMPK下調導致正常生理調節(jié)機制發(fā)生紊亂，信號通路相關蛋白調控發(fā)生改變，反而激活下游靶點ACC的活性，加重T2DM的發(fā)生。如上所述，XING等［6］研究發(fā)現，在T2DM小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中伴隨Fetuin B水平增加，心肌IR加重。而眾所周知，心肌缺血再灌注損傷中，能量代謝AMPK/ACC 通路發(fā)揮關鍵作用。因此推測Fetuin B是調控AMPK/ACC 通路的關鍵上游靶點，影響機體糖脂代謝。體內Fetuin B 含量增加會抑制AMPK 磷酸化，因AMPK活性降低進一步抑制ACC磷酸化，導致ACC活性增強，抑制脂肪酸氧化，刺激脂質沉積，降低胰島素敏感性，加劇IR，加重T2DM的進展。本實驗結果中，高脂飲食誘導肥胖小鼠HDF較Nor組肝臟Fetuin B、ACC在mRNA和蛋白水平均顯著升高，AMPK 則明顯降低，肝臟脂肪變性與葡萄糖代謝紊亂加重，證實了以上推測。同時，肥胖小鼠給予滋膵降糖方干預后，Fetuin B mRNA 和蛋白表達下降，刺激AMPK 活化，抑制ACC 活性，加快脂肪酸氧化和糖酵解，改善IR，我們認為可能與其清熱、助脾運化散精功能密切相關，而這正與糖尿病中醫(yī)發(fā)病機制一致。

本研究初步闡明了滋膵降糖方可能通過介導Fetuin B-AMPK/ACC 通路對肝臟IR 進行調控，但由于時間限制，僅進行了體內表型研究，下一步研究將結合體外細胞研究進一步驗證。