清腸溫中方聯(lián)合糞菌移植對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜免疫的調(diào)控作用*

孫中美，李軍祥，路瓊瓊，丁龐華，姜 慧，施曉軍，毛堂友△

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100029； 2 天津市南開醫(yī)院，天津 300102

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及黏膜及黏膜下層的結(jié)腸、直腸的慢性非特異性炎癥性疾病。UC 的病因尚不明確，目前亦無治愈方法［1］。糞菌移植是通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療UC 的新興療法，主要是將健康供菌者糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內(nèi)，通過重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到治療目的［2］。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)糞菌移植治療UC 的療效存在局限性，尤其是長期療效不明確。中醫(yī)藥治療UC 歷史悠久，可通過調(diào)節(jié)人體陰陽平衡、達(dá)到五臟調(diào)和。前期研究發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方治療UC 療效確切，且聯(lián)合應(yīng)用糞菌移植可明顯緩解UC 的腸道炎癥及病理損傷，但具體機(jī)制不明［3］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，以腸黏膜免疫為切入點(diǎn)，通過檢測γδT 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）及其相關(guān)因子的表達(dá)，探究清腸溫中方聯(lián)合糞菌移植治療UC 小鼠的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30 只6～8 周的SPF 級健康雌性C57BL/6 小鼠，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院SPF 級動(dòng)物房，12 h 光照/黑夜循環(huán)，溫度25 ℃，濕度60%，自由進(jìn)食飲水飼養(yǎng)。動(dòng)物的飼養(yǎng)及干預(yù)過程，嚴(yán)格遵守北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心操作規(guī)范進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號：201922）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥清腸溫中方（藥物組成：黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，青黛3 g，地榆炭15 g，苦參9 g，木香6 g，炙甘草6 g）配方顆粒購自于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房，藥物制備及質(zhì)控由北京康仁堂藥業(yè)有限公司完成。

1.3 試劑及儀器DSS（MW 36000-50000Da，MP Bio-medical）；便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：B191101）；10%中性福爾馬林固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200917）；HE染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200904）；小鼠sIgA Elisa 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201909）；One Step TB Green?Prime Script?RT-PCR Kit Ⅱ（Takara Bio，批號：AJC1834A）；RPMI1640 培養(yǎng)基（Hyclone，批號：AF2954630）；胎牛血清（Hyclone，批號：DD19362264）。 FITC-CD3，BV605-CD4，BUV395-TCRγδ（BD Pharmingen、Biolegend、eBioscience），UCT 型超薄切片機(jī)（Leica）；LSRFortessaTM型流式細(xì)胞儀（BD Bio-sciences），7300 Real Time PCR System（App-lied Biosystems）；Synergy H1 型多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；BX51 顯微鏡（Olympus）。

1.4 造模及分組將30只雌性C56BL/6小鼠，按1∶4 的比例隨機(jī)分為空白組、干預(yù)組，普通飼料喂養(yǎng)，晝/夜12 h/12 h 交替，溫度25 ℃，濕度60%?？瞻捉M小鼠全程自由進(jìn)食飲水，自第8 天起，每日接受無菌水灌胃（0.1 mL/20 g），并于每天早上10 點(diǎn)采集新鮮糞便，制作糞便濾液；糞便濾液制作方法在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行部分更改［4-5］，具體步驟如下：腹部輕柔按摩或者搔刮法刺激小鼠排便，稱定質(zhì)量后按照1∶5 的比例將糞便溶解并勻漿于無菌水中，在4 ℃，2000 r/min 離心1 min后，分離上清液，保存在4 ℃冰箱保存，按照0.1 mL/20 g 劑量灌胃。干預(yù)組小鼠予2.5% DSS 水溶液自由飲用7天造模后，隨機(jī)分為4組：模型組、清腸溫中方組、糞菌移植組、聯(lián)合組。自第8 天起，模型組小鼠予無菌水灌胃（0.1 mL/20 g），清腸溫中方組予清腸溫中方水溶液（1.8 g/kg，0.1 mL/20 g）灌胃，糞菌移植組予糞菌濾液（0.1 mL/20 g）灌胃，聯(lián)合組予清腸溫中方（1.8 g/kg，0.1 mL/20 g）聯(lián)合糞菌濾液（0.1 mL/20 g）灌胃。各組干預(yù)7天，監(jiān)測小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI），光鏡下觀察HE 染色結(jié)腸組織石蠟切片，評價(jià)病理變化。干預(yù)結(jié)束后，麻醉后處死小鼠，取脾臟置于含有10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基中，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。取1 cm 結(jié)腸置于10%中性福爾馬林固定液中固定，用于制作HE 染色石蠟切片，其余結(jié)腸組織置于液氮中凍存，用于相關(guān)基因及蛋白的檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 小鼠DAI 評價(jià) DAI 的評分［6］=（體質(zhì)量下降指數(shù)+糞便性狀+糞便潛血）/3。見表1。

1.5.2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分由炎癥程度及病變深度兩個(gè)維度進(jìn)行評價(jià)［7］。見表2。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)的評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測UC小鼠免疫系統(tǒng)指標(biāo) 將小鼠脾臟分別置于含有2 mL 冰RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%FBS）的60 mm 培養(yǎng)皿中，使用注射器膠栓輕輕研碎，使用70 μm 白篩網(wǎng)過濾，經(jīng)過裂紅、洗滌，以2000 r/min 離心5 min 后重懸細(xì)胞。加入CD3、CD4、TCRγδ 流式抗體，4 ℃避光孵育30 min進(jìn)行細(xì)胞膜表面染色，洗滌離心后重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.5.4 RT-qPCR 法檢測UC 小鼠結(jié)腸TLR2、pIgR mRNA 的表達(dá) Trizol 法提取小鼠結(jié)腸總RNA 后，利用One Step TB Green?PrimeScript?RTPCR Kit Ⅱ按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參，以2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究中所用的引物序列見表3，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表3 引物序列

1.6 ELISA 法檢測UC 小鼠結(jié)腸sIgA 的表達(dá)稱取結(jié)腸組織質(zhì)量，以冰生理鹽水制成10%的組織勻漿，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書，在450 nm波長下測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算sIgA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad prism 8 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪圖。計(jì)量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況除聯(lián)合組2 號小鼠在實(shí)驗(yàn)第12 天不明原因死亡，其余小鼠均對造模及藥物干預(yù)較為耐受。造模期間，各干預(yù)組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的糞便潛血陽性，并最終出現(xiàn)肉眼血便，伴隨毛發(fā)光澤減退，反應(yīng)遲緩、懶動(dòng)、大便稀溏、體質(zhì)量增加趨勢放緩，且自第5 日起體質(zhì)量明顯下降。而停用DSS 水溶液后，小鼠臨床表征均開始緩解，且各干預(yù)組小鼠呈現(xiàn)相對快速地恢復(fù)過程。

2.2 小鼠DAI指數(shù)DAI由體質(zhì)量、糞便性狀、糞便潛血三個(gè)維度構(gòu)成。造模成功后各自干預(yù)7天，與空白組比較，模型組小鼠DAI明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，糞菌移植組、清腸溫中方組以及聯(lián)合組小鼠DAI指數(shù)均明顯下降（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠DAI評分、病理評分、γδT細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、TLR2 mRNAp、IgR mRNA及sIgA比較（）

表4 各組大鼠DAI評分、病理評分、γδT細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、TLR2 mRNAp、IgR mRNA及sIgA比較（）

注：與空白組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

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2.3 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)模型組小鼠結(jié)腸黏膜隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，伴中性粒細(xì)胞浸潤，結(jié)腸黏膜連續(xù)性破壞，病理評分顯著升高（P＜0.01）。清腸溫中方組、糞菌移植組、聯(lián)合組小鼠結(jié)腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤等均有不同程度的減輕，黏膜連續(xù)性破壞明顯減少，且聯(lián)合組小鼠結(jié)腸病理評分較模型組明顯降低（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，×20）

2.4 小鼠γδT 細(xì)胞含量運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟γδT細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，模型組γδT細(xì)胞含量較空白組明顯升高（P＜0.01），而各治療組與模型組相比明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4、圖2。

圖2 各組小鼠γδT細(xì)胞比較

2.5 小鼠CD4+T 細(xì)胞表達(dá)量與空白組相比，模型組小鼠CD4+T 細(xì)胞比例及TLR2 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01），經(jīng)過清腸溫中方、糞菌移植干預(yù)后，與模型組相比，干預(yù)組小鼠CD4+T 細(xì)胞及TLR2 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 各組小鼠CD4+T細(xì)胞分化比較

2.6 小鼠結(jié)腸sIgA 及其受體表達(dá)量與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸sIgA、pIgR mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），經(jīng)過清腸溫中方聯(lián)合糞菌移植干預(yù)7天后，干預(yù)組小鼠結(jié)腸sIgA、pIgR mRNA 較模型組表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見表4。

3 討論

UC 因病程長，炎癥反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因此早發(fā)現(xiàn)早治療是UC 的重要策略［7-8］。目前UC 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，越來越多的證據(jù)表明本病與腸黏膜免疫紊亂密切相關(guān)［9］。

γδT細(xì)胞是一類特殊的T細(xì)胞，是腸道上皮間淋巴細(xì)胞的重要組成部分，構(gòu)成宿主抵抗腸道病原菌及外來抗原入侵的天然屏障［10］。作為腸黏膜免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)有病原微生物入侵時(shí)，γδT 細(xì)胞不受MHC 限制，無需經(jīng)過抗原提成細(xì)胞處理，即可迅速活化和增殖，直接識(shí)別入侵微生物的表面抗原，從而發(fā)揮殺傷性T 細(xì)胞的作用，介導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)［11］。但若免疫應(yīng)答過強(qiáng)，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子在腸道局部積聚，則會(huì)造成結(jié)腸黏膜損傷，誘發(fā)腸道炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸黏膜中γδT細(xì)胞的表達(dá)量較正常人群明顯升高，且其細(xì)胞數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，UC小鼠γδT細(xì)胞明顯升高，而聯(lián)合組治療1 周后，γδT 細(xì)胞明顯降低，提示其治療UC 的作用機(jī)制可能與γδT細(xì)胞介導(dǎo)的腸黏膜免疫應(yīng)答有關(guān)。

CD4+T 細(xì)胞是人體內(nèi)主要的T 細(xì)胞之一，根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子及介導(dǎo)的功能，又可分為Th1、Th2、Th17、Treg等亞群。CD4+T細(xì)胞與炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者腸道CD4+T細(xì)胞浸潤明顯，且分泌大量的促炎因子IFN-γ［13］，從而促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生。γδT細(xì)胞是固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，γδT 細(xì)胞具有抗原提呈細(xì)胞的功能，如Vδ2γδT 細(xì)胞激活后能夠?qū)⒖乖蔬f給CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)兩者的增殖分化［14］。CD4+T 細(xì)胞的增殖活化同時(shí)受到Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）調(diào)節(jié)，TLR 主要參與病原微生物產(chǎn)物的識(shí)別［15］，其中TLR2 主要識(shí)別革蘭氏陽性菌的膚聚糖，是溝通腸道菌群與機(jī)體免疫的主要媒介。研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者腸黏膜的TLR2較正常組明顯增強(qiáng)，而當(dāng)TLR2被激活后，CD4+T 細(xì)胞增殖加快，誘導(dǎo)IL-6 及IL-17等促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠CD4+T 細(xì)胞含量及結(jié)腸TLR2 mRNA表達(dá)明顯升高；經(jīng)過1周的治療后，聯(lián)合組小鼠CD4+T 細(xì)胞、結(jié)腸TLR2 mRNA 表達(dá)明顯降低。

sIgA 是腸黏膜上的主要免疫球蛋白，腸道黏膜上的第一道防線，對各種內(nèi)源共生菌及外源入侵的病原體都有抵抗作用。CD4+T 輔助細(xì)胞可調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育為成熟漿細(xì)胞，從而產(chǎn)生sIgA，并由聚合免疫球蛋白受體（pIgR）從黏膜上皮細(xì)胞的基底表面轉(zhuǎn)移到頂端表面，進(jìn)而與腸道菌群形成串?dāng)_，維持腸道穩(wěn)態(tài)。而當(dāng)sIgA 產(chǎn)生減少或分泌障礙時(shí)，腸黏膜免疫屏障受損，促進(jìn)炎癥性腸病的發(fā)展。本研究采用清腸溫中方聯(lián)合應(yīng)用糞菌移植作為協(xié)同干預(yù)手段，可使結(jié)腸pIgR mRNA、結(jié)腸sIgA表達(dá)較模型組明顯升高。

綜上所述，清腸溫中方聯(lián)合糞菌移植能夠有效抑制UC 小鼠腸道炎癥，促進(jìn)黏膜修復(fù)，其機(jī)制可能與調(diào)控γδT 細(xì)胞及其介導(dǎo)的腸黏膜免疫應(yīng)答有關(guān)，本次研究為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療UC 提供了新的科學(xué)依據(jù)。