馬里苷對(duì)糖尿病小鼠肝臟和胰腺組織形態(tài)及自噬的影響*

張 芳，祖力皮亞·阿布拉，克迪熱亞·卡迪爾，宋志鵬，張博翔，張雁潮，彭小雨，李 甜

新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830011

糖尿病是以體內(nèi)血糖調(diào)節(jié)失衡為特征的代謝紊亂性疾病。根據(jù)胰島素的相對(duì)或絕對(duì)性缺乏，糖尿病分為1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）。T1DM 是由胰腺β細(xì)胞受損導(dǎo)致的胰島素缺乏的自身免疫性疾??；T2DM 的特征是由于胰島素分泌的逐漸性減少而導(dǎo)致胰島素相對(duì)不足，亦或是目標(biāo)組織如肝臟、骨骼肌、脂肪組織中的胰島素受體作用降低，也稱(chēng)為胰島素抵抗［1］。高血糖是兩種類(lèi)型糖尿病的共同特征。慢性高血糖不僅損害相關(guān)臟器以及外周靶組織，也會(huì)造成機(jī)體代謝紊亂，累積形成嚴(yán)重的各種并發(fā)癥［2-4］。

馬里苷是一種黃酮類(lèi)化合物，提取自稀有高寒、功效獨(dú)特的野生植物兩色金雞菊。已有研究證實(shí)兩色金雞菊具有抗氧化、降血壓、降血糖、降血脂、抗腫瘤的生物學(xué)功效［5-6］。馬里苷是兩色金雞菊中重要的黃酮類(lèi)化合物，能夠改善胰島素抵抗、抑制糖異生并促進(jìn)糖原合成，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究［7-8］。本研究通過(guò)研究馬里苷對(duì)糖尿病小鼠肝臟和胰腺的組織形態(tài)的影響進(jìn)而對(duì)其調(diào)節(jié)自噬的功能進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇因瘦素受體基因缺陷造成自發(fā)形成糖尿病的10 只db/db 小鼠和30 只db/m小鼠為研究對(duì)象。小鼠購(gòu)自江蘇常州卡文思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：IACUC-20190226-20。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)小鼠單籠、單只飼養(yǎng)，自由飲水，每隔兩天更換墊料，SPF 動(dòng)物飼養(yǎng)室模擬自然晝夜條件，日間相對(duì)溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度（45±5）%，每日日照時(shí)間為12 h。本實(shí)驗(yàn)按照《新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-20190226-20）。

1.2 試劑及儀器馬里苷（法國(guó)Extrasynthese公司，貨號(hào)：C00007893）；二甲雙胍（上海施寶制藥有限公司，批號(hào)：H20023370）；GAPDH 抗體（北京國(guó)鼎昌盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GA003-R）；二抗IgG H&L/HRP（Bioss，批號(hào)：Bs-0295G-HRP）；兔抗LC3 Ⅱ/I、P62、ATG、Beclin（Cell Signaling Technology，批號(hào)：12741，39749，12994，3495）；HE染色試劑盒（Biosharp，批號(hào)：BL700B-1）；山羊血清、羊抗兔二抗、DAB 顯色試劑（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9065，2010D1217，ZLI-9018）。043BR39035 型垂直型電泳槽、BIO-RAD 型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；DM3000 型拍照顯微鏡（Leica公司）。

1.3 分組及處理10 只雄性db/m 小鼠為對(duì)照組，30只雄性db/db小鼠分為模型組、二甲雙胍陽(yáng)性藥組、馬里苷給藥組，每組10 只。小鼠飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。各組小鼠均喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因敲除小鼠飼料和基礎(chǔ)飼料，二甲雙胍陽(yáng)性藥組給予二甲雙胍溶液灌胃，劑量為280 mg/kg，馬里苷給藥組給予馬里苷溶液灌胃，劑量為50 mg/kg。各組灌胃體積0.02 mL/g，持續(xù)8周。8周后處死小鼠，收集各組小鼠胰腺和肝臟組織樣本，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 標(biāo)本采集用10%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死小鼠后，小心摘取肝臟和胰腺，注意不要破壞其結(jié)構(gòu)?？v向?qū)⒏闻K和胰腺剖成兩半，用4%多聚甲醛在4 ℃冰箱固定一夜，經(jīng)石蠟包埋固定成型。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 小鼠肝臟和胰腺病理學(xué)觀(guān)察 標(biāo)本進(jìn)行脫蠟后，100%、90%、80%酒精處理各5 min，并分別用自來(lái)水沖洗5 min；蘇木精染色5 min，流水沖洗；5%乙酸分化1 min，組織變色呈現(xiàn)藍(lán)色；伊紅染色1 min，流水沖洗；70%、80%、90%、100%酒精脫水各10 s，再用二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ10 min透明化處理，晾干切片后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片。每組隨機(jī)選取4 只小鼠的組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察小鼠肝臟和胰腺的組織形態(tài)。

1.5.2 免疫組化染色對(duì)肝臟組織P62 的定位、定量分析 光鏡下觀(guān)察不同組小鼠肝臟P62 的表達(dá)，HE 染色后將小鼠肝臟組織制成石蠟塊。經(jīng)脫蠟、復(fù)水、蒸餾水洗滌切片后，將其浸泡于10 mol/L濃度的檸檬酸鹽溶液中。進(jìn)行抗原修復(fù)后，緩沖液洗3 min/2 次，之后將切片浸泡于3%過(guò)氧化氫溶液10 min。用PBS 溶液進(jìn)行洗滌切片后，0.5%Triton X-100 溶液浸泡切片10 min。最后封閉（5%BSA 溶液）切片45 min，將配置好的一抗溶液在37 ℃孵育1～2 h。孵育結(jié)束后，用PBS溶液清洗切片3 次，加酶標(biāo)二抗在室溫中孵育30 min，再次用PBS 溶液洗滌切片3 次后，用DAB 顯色液顯色5 min，之后用自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明化處理，最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察和取圖。

1.5.3 Western Blotting 檢測(cè)小鼠肝臟組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 小鼠斷頸處死后，取其肝組織，提取目的蛋白并采用蛋白免疫印跡檢測(cè)。將小鼠肝臟組織剪碎，與生理鹽水混合離心，反復(fù)此步驟，直至離心上清液無(wú)色透明；吸去離心上清液，加入裂解液，之后將裂解產(chǎn)物在冰浴中用超聲機(jī)，超聲后離心吸去上清，獲取肝組織蛋白質(zhì)。電泳前進(jìn)行溶液配置、制膠，將提取的蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，進(jìn)行一抗、酶標(biāo)二抗孵育，最后加入酶底物，化學(xué)顯色。用Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像，用Image-lab 軟件對(duì)Western-blotting結(jié)果進(jìn)行帶密度測(cè)定分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇SPSS 26.0 軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphdPadPrism 8.0 軟件輔助作圖，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織病理學(xué)改變對(duì)照組小鼠肝臟組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞板排列整齊，肝細(xì)胞呈多邊形，1～2 個(gè)細(xì)胞核居中，胞漿豐富；門(mén)管區(qū)將相鄰肝小葉分隔開(kāi)，較易識(shí)別。模型組小鼠肝臟組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索紊亂，部分部位索狀結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞體積變大呈圓形，伴有氣球樣變，胞核移向胞膜，胞膜完整結(jié)構(gòu)破壞，界限不清，部分可見(jiàn)細(xì)胞彌漫性脂肪空泡變性。門(mén)管區(qū)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，相對(duì)于模型組小鼠，二甲雙胍陽(yáng)性組與馬里苷給藥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞排列成索狀，部分肝細(xì)胞體積較大，呈圓形，胞膜結(jié)構(gòu)不清晰，門(mén)管區(qū)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)觀(guān)察（HE，×200）

2.2 小鼠胰腺組織病理學(xué)改變對(duì)照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)飽滿(mǎn)，胰島在胰腺腺泡間散在分布，形態(tài)呈圓形或卵圓形，與周?chē)M織分界清晰，未見(jiàn)明顯異常；胰島內(nèi)胰島細(xì)胞排列整齊，胞核呈圓形居中，胞漿豐富；模型組小鼠的胰腺組織出現(xiàn)明顯肥大，胰島萎縮，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，與周?chē)M織界限不清晰，并有纖維組織增長(zhǎng)，胰島細(xì)胞排列紊亂，并且部分胰島細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀甚至出現(xiàn)核固縮和核溶解現(xiàn)象。相對(duì)于模型組，二甲雙胍陽(yáng)性藥組和馬里苷給藥組小鼠胰島形態(tài)較正常，邊界比較清晰，胰島細(xì)胞排列有明顯改善，胰島細(xì)胞空泡狀變性減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠胰腺組織病理學(xué)改變（HE，×200）

2.3 小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白P62 表達(dá)模型組與對(duì)照組小鼠相比，肝臟組織細(xì)胞P62 表達(dá)顯著增高，而二甲雙胍和馬里苷干預(yù)可緩解逆轉(zhuǎn)糖尿病引起的P62表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肝臟組織P62免疫組化圖（免疫組化染色，×200）

2.4 小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/I、P62、ATG5和Beclin1 表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組小鼠P62水平顯著增高（P＜0.01），LC3Ⅱ/I 比值、Beclin1和ATG5 水平均下降（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍和馬里苷干預(yù)后均能降低糖尿病小鼠P62的表達(dá)，增加LC3Ⅱ/I、Beclin1 及ATG5 的表達(dá)水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖4—5。

圖4 各組小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白P62、LC3Ⅱ/I含量水平比較

圖5 各組小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1含量水平比較

3 討論

慢性高血糖造成機(jī)體代謝紊亂，同時(shí)損害相關(guān)臟器以及外周靶組織。肝臟作為物質(zhì)代謝的中間場(chǎng)所，從一開(kāi)始就處于糖尿病發(fā)展過(guò)程中代謝網(wǎng)絡(luò)的核心位置，并直接或間接地參與整個(gè)機(jī)體物質(zhì)代謝過(guò)程［9-10］。糖尿病會(huì)造成肝臟病理性損害，表現(xiàn)為肝小葉和肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變［11］。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)觀(guān)察對(duì)比db/db 糖尿病小鼠組與馬里苷藥物組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞板圍繞中央靜脈形態(tài)和肝細(xì)胞形態(tài)的不同，發(fā)現(xiàn)馬里苷對(duì)于糖尿病小鼠肝臟損傷具有緩解及糾正作用。

胰腺內(nèi)的胰島細(xì)胞可產(chǎn)生胰島素、胰高血糖素，它們可以調(diào)節(jié)機(jī)體血糖的變化，對(duì)于糖尿病疾病的轉(zhuǎn)化發(fā)展具有非常重要的作用［12］。實(shí)驗(yàn)證明馬里苷可顯著改善db/db 小鼠胰腺體積增大及胰島細(xì)胞排列紊亂，同時(shí)能增加其胰島素分泌量并升高血漿胰島素水平，因此馬里苷對(duì)于糖尿病小鼠胰腺損傷的也有著明顯的治療作用［13］。

細(xì)胞自噬與人類(lèi)健康和疾病防治有著密切的關(guān)系。自噬過(guò)度還是自噬不足都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生［14］。在胰島素抵抗的情況下，器官和組織的自噬被明顯抑制。自噬對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)代謝平衡，調(diào)控細(xì)胞各種活動(dòng)，保護(hù)細(xì)胞完整性，維持細(xì)胞自穩(wěn)具有重要作用［15］。自噬體在形成過(guò)程中有兩種自噬有關(guān)蛋白質(zhì)是必須參與的，即ATG5 和Beclin-1（酵母ATG6 同源物），二者除了促進(jìn)自噬體的形成，還被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡的分子開(kāi)關(guān)蛋白［16］。LC3 是自噬的重要標(biāo)志物，當(dāng)自噬被激活時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ/I 比值的大小可以估計(jì)自噬水平的高低。P62蛋白稱(chēng)作SQSTMI，因其與LC3 的相互作用表達(dá)在自噬體上，在正常生理情況下易被自噬降解，P62表達(dá)量的升高意味著自噬的缺陷，是與自噬強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)的標(biāo)志分子［17-18］。實(shí)驗(yàn)表明馬里苷可以顯著增加糖尿病小鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/I、ATG5 和Beclin1 的表達(dá)，降低P62 的表達(dá)，促進(jìn)糖尿病小鼠肝臟自噬表達(dá)。

綜上所述，自噬參與調(diào)控機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性及其應(yīng)答，并影響肝臟組織胰島素信號(hào)的傳遞，調(diào)控肝臟胰島素抵抗的發(fā)生［19］。肝臟胰島素抵抗的發(fā)生，影響機(jī)體糖代謝，破壞肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能，會(huì)進(jìn)一步加重糖尿病［20］。從本實(shí)驗(yàn)可以得出，馬里苷通過(guò)誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)肝臟胰島素抵抗，起到治療糖尿病的作用。