基于Nrf 2/HO-1啟動(dòng)子篩選抗水生病毒藥物的方法

王靖雯， 吳苗苗， 李莉娟,2， 顧澤茂,2， 袁軍法,2*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，水生動(dòng)物疫病專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

水生動(dòng)物病毒病種類(lèi)多、流行廣、傳播快、死亡率高，是限制水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的重要因素[1-2]。因抗病毒藥物缺失、疫苗種類(lèi)有限，水生動(dòng)物病毒病的防控始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的難點(diǎn)，篩選綠色、廣譜的抗病毒藥物，建立高效防控技術(shù)體系是水生動(dòng)物病毒研究的核心目標(biāo)[3-4]。氧化應(yīng)激是鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、草魚(yú)呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)等多種病毒感染的主要病理機(jī)制之一[5-6]?？寡趸纷鳛橐环N內(nèi)源性的防御機(jī)制，除維持機(jī)體氧化-還原平衡穩(wěn)態(tài)外，還可拮抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和SVCV等多種病毒，而蘿卜硫素、雷公藤紅素等作為藥食同源的抗氧化劑，也被證實(shí)具有較好的抗病毒作用[7-8]。因此，靶向抗氧化通路，篩選具有抗病毒作用的抗氧化劑，可為開(kāi)發(fā)綠色、廣譜的抗水生病毒藥物提供新思路[9]。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細(xì)胞中氧化應(yīng)激的主要傳感器，可啟動(dòng)下游包括血紅素加氧酶1(HO-1)在內(nèi)的抗氧化及解毒基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[10]。HO-1是將血紅素分解為膽綠素、Fe2+和CO的關(guān)鍵酶，在維持機(jī)體氧化還原平衡方面起關(guān)鍵作用[11-12]。此外Nrf2/HO-1信號(hào)通路還廣泛參與到機(jī)體的生長(zhǎng)、分化、代謝、免疫等多種生命過(guò)程中，通過(guò)其下游醌氧化還原酶1(NQO-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化/二相解毒酶維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[13-14]。Nrf2/HO-1信號(hào)通路是機(jī)體最重要的抗氧化防御系統(tǒng)，姜黃素、蘿卜硫素、雷公藤紅素等藥物可通過(guò)激活Nrf2介導(dǎo)的HO-1表達(dá)來(lái)緩解病毒感染引起的氧化應(yīng)激并抑制病毒復(fù)制[7-8,15-16]。靶向Nrf2/HO-1信號(hào)通路的抗病毒藥物，通過(guò)激活抗氧化和抗炎癥等內(nèi)源性防御通路發(fā)揮作用，具有廣譜性。這些藥物不直接作用于病毒本身，減少了耐藥性的產(chǎn)生，為開(kāi)發(fā)綠色高效的抗病毒藥物提供了靶標(biāo)。

胖頭鱥上皮細(xì)胞(FHM)對(duì)SVCV、RGV、大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus，MSRV)、傳染性胰臟壞死病毒 (infectious ancreatic necrosis virus，IPNV) 等多種水生動(dòng)物病毒敏感，是病毒診斷、致病機(jī)制與病毒復(fù)制規(guī)律研究的重要材料[17-19]。本實(shí)驗(yàn)利用胖頭鱥(Pimephales promelas)基因組數(shù)據(jù)，分析并構(gòu)建了Nrf2、HO-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，建立靶向其啟動(dòng)子活性的藥物篩選方法，為抗水生動(dòng)物病毒的藥物篩選提供了基礎(chǔ)工具和新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用FHM細(xì)胞系、SVCV、RGV均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥物與主要試劑

DNA提取試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye) 、膠回收試劑盒購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；DNA Marker、DH5α菌株購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；低內(nèi)毒素真核質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Magen公司；胎牛血清、M199培養(yǎng)基、0.25%EDTA胰酶以及OPTI-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；FishTrans轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自武漢美森特生物科技有限公司；姜黃素[95%(HPLC)，S19245]、白藜蘆醇(BR, 98%，S30630)、穿心蓮內(nèi)酯(98%，S24818)、水飛薊賓[98%(HPLC)，Y53945]購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自Biosharp公司；pGL3- Basic、pRLTK1、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；pTOPO001 Simple Cloning Kit載體試劑盒購(gòu)自北京金沙生物科技有限公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄及定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成與測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 FHM Nrf2、HO-1基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)[National Center for Biotechnology Information (nih.gov)]獲取FHMNrf2(Gene ID: 120459756、NCBI Reference Sequence:XM_039647189.1)和HO-1(Gene ID: 120467971、NCBI Reference Sequence: XM_039656609.1)的基因組DNA序列及mRNA序列，利用AnimalTFDB3.0[AnimalTFDB3 (hust.edu.cn)]、JASPAR(JASPAR -A database of transcription factor binding profiles(genereg.net))在線軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用MethPrimer軟件[MethPrimer | Tools and Databases | The Li Lab (urogene.org)]預(yù)測(cè)CpG島。

1.4 質(zhì)粒載體的構(gòu)建

根據(jù)胖頭鱥基因組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)，上下游引物的酶切位點(diǎn)以下劃線表示。提取FHM細(xì)胞的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR體系共20 μL∶2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye)10 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL 。反應(yīng)程序∶95 °C預(yù)變性3 min，94°C變性 25 s，根據(jù)引物Tm值設(shè)置退火溫度，退火25 s，72 °C延伸(10～15 s / kb )，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有明亮單一條帶后切膠回收。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGL3-basic 載體進(jìn)行雙酶切處理?；厥占兓蟮膯?dòng)子片段和載體按物質(zhì)的量 3∶1 混合，T4 DNA 連接酶 16 °C連接 12 h，轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐西林(Amp)抗性的平板，37 °C倒置培養(yǎng)12 h。對(duì)單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性菌送測(cè)序，驗(yàn)證序列是否正確。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

FHM細(xì)胞用含有10% FBS的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 °C，待細(xì)胞平鋪長(zhǎng)滿孔板的80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒的配比及操作步驟按FishTrans轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 啟動(dòng)子活性分析

為評(píng)價(jià)藥物的細(xì)胞毒性，使用含不同濃度藥物的培養(yǎng)基(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)對(duì)FHM進(jìn)行藥物處理，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照 (negative control, NC) 和二甲基亞砜 (DMSO)組，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，28 °C繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2.5 h，酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力。

轉(zhuǎn)染重組啟動(dòng)子質(zhì)粒及pRL-TK質(zhì)粒24 h后，將白藜蘆醇、水飛薊賓、穿心蓮內(nèi)酯和姜黃素4種藥物以10.0 μg/mL的濃度同細(xì)胞孵育，28 °C作用24 h后，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。再次轉(zhuǎn)染重組啟動(dòng)子質(zhì)粒及pRL-TK質(zhì)粒，24 h后將上述初步篩選有效的藥物—水飛薊賓、穿心蓮內(nèi)酯、姜黃素，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取基于藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定的6個(gè)藥物濃度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0 μg/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，28 °C作用24 h后，檢測(cè)藥物濃度梯度對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。

1.7 抗病毒實(shí)驗(yàn)

以6.3 μg/mL的姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯分別預(yù)處理細(xì)胞6 h，再分別以0.1感染復(fù)數(shù) (multiplicity of infection，MOI)的SVCV和RGV進(jìn)行感染，28 °C孵育1 h后更換為含相應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收取細(xì)胞上清液及細(xì)胞樣，測(cè)定病毒滴度及病毒復(fù)制水平，驗(yàn)證基于啟動(dòng)子活性的藥物篩選策略。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清連續(xù)10倍稀釋(10?1～10?10)，每個(gè)梯度6個(gè)重復(fù)，加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，同時(shí)用稀釋液做陰性對(duì)照，培養(yǎng)7 d后觀察并記錄全部孔的細(xì)胞病變，再根據(jù)Reed-Muench兩氏法計(jì)算出病毒滴度。

以RGV9506 (GenBank: JQ654586.1)的MCP序列(ORF97R)設(shè)計(jì)引物，建立RGV的絕對(duì)定量方法，評(píng)價(jià)藥物對(duì)RGV感染的影響。提取細(xì)胞樣DNA，以RGV感染組DNA樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收后按pTOPO001 Simple Cloning Kit載體試劑盒說(shuō)明進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定。提取標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒并測(cè)量濃度，然后依據(jù)公式計(jì)算每微升樣品中質(zhì)粒拷貝數(shù)∶每微升質(zhì)?？截悢?shù)( 拷貝 / μL) = 質(zhì)?？傎|(zhì)量( μg / μL) /質(zhì)粒分子量；質(zhì)粒分子量 = 2 × 330 × nt(其中 nt 為質(zhì)粒的堿基數(shù)) 。標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍的梯度稀釋后定量檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取細(xì)胞樣的DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 實(shí)驗(yàn)對(duì) RGV進(jìn)行定量，RGV定量引物如表1所示。定量檢測(cè)SVCV-G的轉(zhuǎn)錄水平，評(píng)價(jià)藥物對(duì)SVCV復(fù)制的影響。提取細(xì)胞樣的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR，對(duì)SVCV G蛋白的mRNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)，SVCV-G定量引物如表1所示。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用雙樣本等方差t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，*，P＜ 0.05； **，P＜ 0.01 或 ***，P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2、HO-1基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取Nrf2和HO-1的DNA序列，分別選取編碼區(qū)(CDS區(qū))起始密碼子ATG前后2482和2104 bp作為Nrf2和HO-1基因啟動(dòng)子候選區(qū)，利用Animal TFDB3.0、JASPAR等軟件分別對(duì)Nrf2和HO-1啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，Nrf2和HO-1啟動(dòng)子區(qū)存分別存在FOXO、ATF、IRF、AP-1、FOS和Nrf2、Bach1、SP-1、STAT等多種潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。利用MethPrimer預(yù)測(cè)到Nrf2啟動(dòng)子中存在一個(gè)CpG島，位于2125～2243 bp，而HO-1啟動(dòng)子中存在3個(gè)CpG島，分別位于53～156 bp、704～852 bp、1156～1276 bp(圖2)。

圖1 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig. 1 Predicted transcription factor binding sites in the promoter region of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

圖2 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因啟動(dòng)子序列CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果Fig. 2 Predicted results of CpG islands of promoter sequences of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

2.2 Nrf2和HO-1基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增和報(bào)告載體的構(gòu)建

構(gòu)建FHMNrf2、HO-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒(圖3-a)。PCR擴(kuò)增Nrf2和HO-1基因啟動(dòng)子片段，回收后分別使用KpnⅠ、XhoⅠ和XhoⅠ、Hind III限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增片段及pGL3-Basic進(jìn)行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖3-b)。結(jié)果顯示，在2000 bp附近及2000～3000 bp存在單一明亮的特異性條帶，與預(yù)期的大小一致，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性單克隆菌液PCR及測(cè)序后確認(rèn)獲得pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1重組雙熒光素酶質(zhì)粒。

圖3 FHM Nrf2、HO-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建(a) Nrf2、HO-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建流程圖，(b) Nrf2基因啟動(dòng)子片段及pGL3-Basic質(zhì)粒的雙酶切，(c) HO-1基因啟動(dòng)子片段及pGL3-Basic質(zhì)粒的雙酶切；1. pGL3-Basic質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，2. Nrf2基因啟動(dòng)子片段雙酶切產(chǎn)物，3. pGL3-Basic質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，4. HO-1基因啟動(dòng)子片段雙酶切產(chǎn)物，M. 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000。Fig. 3 Construction of FHM Nrf2 and HO-1 promoter reporter plasmids(a) flow chart for the construction of FHM Nrf2, HO-1 promoter reporter plasmid, (b) double digestion of Nrf2 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid, (c)double digestion of HO-1 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid; 1. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 2. Nrf2 gene promoter fragment double digestion product, 3. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 4. HO-1 gene promoter fragment double digestion product, M. molecular quality standard DL5000.

2.3 基于啟動(dòng)子活性的藥物篩選

選取白藜蘆醇、水飛薊賓、穿心蓮內(nèi)酯和姜黃素4種中草藥有效成分來(lái)探究藥物對(duì)Nrf2和HO-1啟動(dòng)子活性的影響，驗(yàn)證啟動(dòng)子的活性。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，4種藥物的濃度在25.0 μg/mL以下時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性(圖4)，當(dāng)濃度升至50.0 μg/mL時(shí)，除姜黃素外，其他3種藥物的細(xì)胞存活率均大于70%。

以10.0 μg/mL的藥物濃度進(jìn)行初步篩選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，水飛薊賓和姜黃素可顯著上調(diào)Nrf2的啟動(dòng)子活性，而穿心蓮內(nèi)酯和姜黃素則可顯著上調(diào)HO-1的啟動(dòng)子活性(圖5)。選取以上3種有效藥物，對(duì)不同濃度藥物刺激下的啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，6.3 μg/mL的水飛薊賓可有效上調(diào)Nrf2和HO-1的啟動(dòng)子活性；穿心蓮內(nèi)酯各濃度均未能顯著激活Nrf2的啟動(dòng)子，相反，3.1～50.0 μg/mL的穿心蓮內(nèi)酯均可顯著激活HO-1啟動(dòng)子，其中6.3 μg/mL的效果最為顯著；姜黃素中除因藥物毒性導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡的50.0 μg/mL，其他濃度均可顯著上調(diào)Nrf2的啟動(dòng)子活性，但只有6.3 μg/mL的姜黃素濃度可顯著上調(diào)HO-1的啟動(dòng)子活性(圖6)。

圖5 四種藥物對(duì)Nrf2 (a)、HO-1 (b) 啟動(dòng)子活性的影響1. 對(duì)照，2. 白藜蘆醇，3. 水飛薊賓，4. 穿心蓮內(nèi)酯，5. 姜黃素；*.表示差異顯著(P＜0.05)；下同。Fig. 5 Effects of four drugs on Nrf2 (a) and HO-1 (b)promoter activity1. control, 2. resveratrol, 3. silybin, 4. andrographolide, 5. curcumin; *.means the difference is significant (P＜0.05); the same below.

圖6 不同藥物濃度對(duì)Nrf2、HO-1啟動(dòng)子活性的影響(a)～(c)分別表示不同濃度的水飛薊賓、穿心蓮內(nèi)酯和姜黃素對(duì)Nrf2啟動(dòng)子活性的影響，(d)～(f)分別表示不同濃度的水飛薊賓、穿心蓮內(nèi)酯和姜黃素對(duì)HO-1啟動(dòng)子活性的影響；1. NC，2. 3.1 μg/mL，3. 6.3 μg/mL，4. 12.5 μg/mL，5. 25.0 μg/mL，6. 50.0 μg/mL。Fig. 6 Effect of different drug concentrations on the activity of Nrf2 and HO-1 promoters(a)-(c)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on Nrf2 promoter activity, (d)-(f)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on HO-1 promoter activity; 1. NC，2. 3.1 μg/mL, 3. 6.3 μg/mL, 4. 12.5 μg/mL, 5. 25.0 μg/mL, 6.50.0 μg/mL.

2.4 抗病毒活性

為驗(yàn)證姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯激活Nrf2和HO-1的啟動(dòng)子是否與抗病毒活性關(guān)聯(lián)，分別以姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯對(duì)FHM細(xì)胞進(jìn)行孵育，再分別以RGV和SVCV感染FHM，以含相應(yīng)濃度藥物的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，SVCV和RGV感染可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的CPE，姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯的處理可顯著緩解病毒感染引起的細(xì)胞病變(圖版)。

構(gòu)建的RGV熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-3.413x+40.60)具有較好的線性關(guān)系(圖7)。姜黃素處理組和穿心蓮內(nèi)酯處理組可分別減少約40%和60%的RGV拷貝量；姜黃素處理組和穿心蓮內(nèi)酯處理組較對(duì)照組分別下調(diào)約20%和60%的SVCVG水平。滴度結(jié)果也證實(shí)，藥物處理可減少培養(yǎng)基上清中的病毒粒子含量，其中穿心蓮內(nèi)酯的效果更為顯著，RGV和SVCV的病毒滴度分別下降了25%和23%(圖8)。

圖7 靶向MCP基因的RGV定量標(biāo)曲Fig. 7 Quantitative standard curve of RGV targeting MCP gene

圖8 藥物的抗病毒活性檢測(cè)(a) 絕對(duì)/相對(duì)定量檢測(cè)病毒的復(fù)制水平，(b) 藥物處理后病毒的滴度檢測(cè)；1. 病毒感染組，2. 姜黃素組，3. 穿心蓮內(nèi)酯組。Fig. 8 Detection of antiviral activity of drugs(a) absolute/relative quantification of viral replication levels, (b) titer detection of viruses after drug treatment; 1. virus infection group, 2. curcumin group, 3. andrographolide group.

3 討論

啟動(dòng)子是基因的開(kāi)關(guān)，位于結(jié)構(gòu)基因5‘端的上游，與轉(zhuǎn)錄因子一起，從起始時(shí)間和表達(dá)程度上對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Nrf2、HO-1啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及CpG島進(jìn)行了預(yù)測(cè)。Nrf2啟動(dòng)子序列中預(yù)測(cè)到的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)較為分散，其中存在與細(xì)胞增殖、凋亡、分化和炎癥相關(guān)的ATF家族，涉及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及代謝周期調(diào)控的FOX家族，以及IRF 家族的結(jié)合位點(diǎn)。HO-1啟動(dòng)子序列中的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)較為集中，其中FOS、JUN、MAF、BACH1、AP-1、Nrf2等HO-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控中常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子集中在1240～1260 bp。在人(Homo sapiens)的HO-1啟動(dòng)子序列中同樣預(yù)測(cè)到IRF-1、AP-1和STAT的結(jié)合位點(diǎn)[21]。CpG島主要分布在啟動(dòng)子區(qū)，CpG島的甲基化可影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[22]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)的Nrf2啟動(dòng)子中存在2個(gè)CpG島，且急性缺氧可顯著降低CpG島的甲基化，促進(jìn)Nrf2的表達(dá)。與牙鲆不同，胖頭鱥的Nrf2啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到1個(gè)CpG島[10]。 人類(lèi)的HO-1啟動(dòng)子區(qū)中存在一個(gè)長(zhǎng)307 bp的CpG島，而胖頭鱥的HO-1啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到3個(gè)預(yù)測(cè)的CpG島[21]。此外研究表明，Nrf2啟動(dòng)子區(qū)域rs13005431位點(diǎn)的多態(tài)性變化會(huì)改變Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，影響對(duì)結(jié)核病的易感性；哺乳動(dòng)物的HO-1啟動(dòng)子的多態(tài)性也被證明與肺部和心腦血管等疾病密切相關(guān)[23-24]。但水生動(dòng)物鮮有啟動(dòng)子多態(tài)性與疾病聯(lián)系的相關(guān)研究，相關(guān)研究的展開(kāi)將對(duì)抗病育種具有積極意義。

近年來(lái)，關(guān)于Nrf2/HO-1信號(hào)通路參與病毒復(fù)制及病理機(jī)制的研究逐漸深入。Nrf2和HO-1具有廣譜的抗病毒活性，HO-1可誘導(dǎo)IFN-1表達(dá)并抑制HCV的NS3/4A蛋白酶活性；Nrf2介導(dǎo)的HO-1表達(dá)還可抑制寨卡病毒(Zika virus，Zika)及單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)等病毒的增殖[7,25-26]。研究已證實(shí)多種藥物可靶向Nrf2和HO-1信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用∶青蒿的類(lèi)黃酮衍生物DMO-CAP處理可誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、JNK/MAPK和ERK/MAPK磷酸化，激活Nrf2/HO-1，抑制甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的增殖[27]；青蒿琥酯通過(guò)激活A(yù)MPK依賴的Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的復(fù)制[28]。魚(yú)類(lèi)中也有研究表明，蘿卜硫素、香豆素衍生物BBC和α-脂質(zhì)酸可靶向于Nrf2/HO-1通路抑制SVCV和病毒性出血敗血癥病毒(viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)[8,29-30]。靶向內(nèi)源性防御通路Nrf-2/HO-1的抗病毒策略為廣譜抗病毒藥物的篩選提供了新的思路，基于此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Nrf2、HO-1的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，評(píng)價(jià)了靶向Nrf2/HO-1啟動(dòng)子活性的抗病毒藥物篩選方法。該方法利用靈敏度高、檢測(cè)線性范圍廣的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，以熒光信號(hào)強(qiáng)度定量表示啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱。與靶向病毒基因的藥物篩選方式相比，該方法不受病毒種類(lèi)的限制，適用于所有可引起氧化應(yīng)激的水生生物病毒，具有廣譜性，也不易產(chǎn)生耐藥性[31]。與基于活體實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞病變程度的傳統(tǒng)藥物篩選方法相比，該方法篩選周期短，易于操作與重復(fù)，可用于抗水生病毒藥物初篩[32]。

姜黃素可通過(guò)PKC的磷酸化激活Nrf2；穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)p38/MAPK的磷酸化促使Nrf2入核介導(dǎo)HO-1的表達(dá)，以發(fā)揮其抑制HCV、COVID-19等多種病毒的抗病毒作用[15,33-35]。本研究也證實(shí)姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯可激活FHMNrf2、HO-1的啟動(dòng)子活性，抑制RGV和SVCV的增殖。白藜蘆醇是常見(jiàn)的多酚之一，被普遍認(rèn)為具有抗氧化、抗癌癥等功能。研究表明白藜蘆醇在3.1～100.0 μmol/L時(shí)均可顯著激活HEK293T細(xì)胞中抗氧化元件(ARE)的啟動(dòng)子活性，在50.0 μmol/L時(shí)可激活PI3K/Akt介導(dǎo)的Nrf2信號(hào)通路以減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腸道屏障損傷。本實(shí)驗(yàn)以10.0 μg/mL的濃度進(jìn)行藥物初篩時(shí)，白藜蘆醇并未激活FHMNrf2、HO-1的啟動(dòng)子活性[36-38]。隨著對(duì)白藜蘆醇研究的逐漸深入，其保護(hù)作用開(kāi)始出現(xiàn)爭(zhēng)議∶白藜蘆醇可增強(qiáng)HCV的復(fù)制，不適用于慢性丙型肝炎的抗氧化治療；存在雙相刺激劑量依賴性反應(yīng)及晝夜節(jié)律，即在低劑量下及暗期為抗氧化劑，存在保護(hù)作用，高劑量下及光照期作為促氧化劑，通過(guò)下調(diào)PKB/Akt的磷酸化增加氧化應(yīng)激[36,39-41]。這些均表明白藜蘆醇的抗氧化效應(yīng)在不同細(xì)胞、濃度、狀態(tài)下不同。

本實(shí)驗(yàn)分析并構(gòu)建了胖頭鱥Nrf2、HO-1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上建立了基于抗氧化信號(hào)通路的抗病毒藥物篩選方式，分別以DNA病毒RGV和RNA病毒SVCV驗(yàn)證了該藥物篩選方式的有效性，為魚(yú)類(lèi)抗病毒藥物的高效快速篩選提供了新方法。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）