大黃魚ATG5基因的分子特征及促進(jìn)病毒增殖的作用

魏祖運(yùn)， 王 珊， 李婉茹， 王勝藍(lán)， 陳玉紅，母尹楠， 陳新華

(福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院，福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

自噬(autophagy)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是細(xì)胞自我保護(hù)、存活、更新、物質(zhì)再利用和維持體內(nèi)平衡的重要機(jī)制[1-2]。自噬的基本過程包括雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體降解[3]。自噬體形成過程受到多種基因的調(diào)控，這些基因被稱為自噬相關(guān)基因(autophagyrelated gene，ATG)[4]。到目前為止，已經(jīng)在酵母中鑒定了30多種自噬特異性調(diào)控基因，其中ATG5作為自噬泛素化過程的調(diào)節(jié)基因，在自噬體形成早期發(fā)揮重要作用[5]。ATG5可以結(jié)合ATG12和多聚蛋白ATG16形成ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物，該復(fù)合物有利于自噬小體的延伸[6-7]。ATG5復(fù)合物還能夠與自噬囊泡膜結(jié)合，促進(jìn)LC3 (ATG8)向自噬囊泡聚集[8]。ATG5蛋白水平的升高或降低直接影響自噬通路，敲低ATG5能特異性地阻斷自噬體的形成[9-10]。

自噬作為細(xì)胞維持自穩(wěn)定的一種自我保護(hù)機(jī)制，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。已有研究報(bào)道，病毒感染會(huì)導(dǎo)致自噬體積累，并利用自噬體的雙層膜狀結(jié)構(gòu)作為“病毒工廠”[11]。受小鼠(Mus musculus)肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)感染的細(xì)胞，自噬體的雙層膜中可以檢測到病毒成分，病毒RNA在雙層膜小泡上完成了復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[12]。目前，關(guān)于自噬在魚類病毒感染中的功能研究仍相對較少。傳染性鮭魚貧血癥病毒(infectious salmon anaemia virus，ISAV)感染會(huì)誘導(dǎo)大西洋鮭(Salmo salar)細(xì)胞發(fā)生自噬，利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬顯著抑制了ISAV的復(fù)制，說明自噬對于ISAV復(fù)制具有促進(jìn)作用[13]。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)感染增強(qiáng)了宿主細(xì)胞的自噬活性，而自噬促進(jìn)了宿主細(xì)胞中SVCV增殖。然而，也有研究報(bào)道自噬發(fā)揮抗病毒作用，例如雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬抑制了鯉上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini，EPC)細(xì)胞內(nèi)傳染性造血器官壞死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)的復(fù)制和細(xì)胞外病毒的產(chǎn)生，而使用抑制劑阻斷自噬過程則加劇了病毒感染效應(yīng)，說明自噬在IHNV感染中發(fā)揮抗病毒作用[15]。

大黃魚(Larimichthys crocea)是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚類，隨著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，由病毒、細(xì)菌和寄生蟲引發(fā)的疾病頻繁暴發(fā)，給大黃魚產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。因此，解析大黃魚應(yīng)對病原感染的免疫應(yīng)答機(jī)制將有助于制定有效的病害防治措施。本研究克隆并鑒定了大黃魚ATG5(LcATG5)基因，研究了LcATG5在正常大黃魚組織和免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平及該蛋白對魚類病毒增殖的影響，本能實(shí)驗(yàn)為闡明ATG5在魚類病毒感染中的功能及其機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用大黃魚體長(21.0 ± 1.8) cm，體重(105.0 ± 13.5) g購自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，將隨機(jī)挑選的大黃魚置于3 t養(yǎng)殖桶中適應(yīng)性養(yǎng)殖10 d，水溫為25 °C左右，使用增氧設(shè)備不間斷曝氣，每天早晚各換水1次。采集健康大黃魚的血液、鰓、腦、頭腎、皮膚、肌肉、脾臟、肝臟、胃、心臟、腸等組織或器官立即置于液氮中速凍，保存于?80 °C超低溫冰箱備用。本研究獲得了福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PZCASFAFU2019019)，實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守福建農(nóng)林大學(xué)倫理規(guī)范，并按照福建農(nóng)林大學(xué)倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 細(xì)胞與病毒

取健康大黃魚的頭腎組織，置于70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)上輕輕研磨，用含1%肝素鈉的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗制成細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液添加到34%/51% Percoll溶液上，4 °C，650 ×g離心30 min。離心后，吸取中間細(xì)胞層，使用L-15培養(yǎng)基洗滌3次，再使用5 mL L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照每孔2.0 × 106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，28 °C 培養(yǎng)2 h，分別收集懸浮的原代淋巴細(xì)胞和貼壁的原代巨噬細(xì)胞。將研磨后制成的細(xì)胞懸液加到51% Percoll溶液上，4 °C，650 ×g離心30 min，收集離心管底部的大黃魚原代粒細(xì)胞。

大黃魚頭腎細(xì)胞系(LYCK)和EPC細(xì)胞保存于本實(shí)驗(yàn)室，使用L-15細(xì)胞培養(yǎng)基(含10% FBS)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 °C[18]。SVCV原液保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.3 LcATG5基因克隆

從大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫中查找到LcATG5基因的編碼序列，根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)cATG5-F和LcATG5-R(表1)，用于擴(kuò)增LcATG5基因的開放閱讀框(ORF)。以大黃魚脾臟總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，使用EasyPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系∶cDNA模板1 μL，EasyPfu 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP Mix 4 μL，10× PCR Buffer 5 μL，無菌水 37 μL；反應(yīng)條件∶95 °C 預(yù)變性5 min；95 °C 變性30 s，56 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)∶72 °C延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收后與載體pMD20-T連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

表1 引物信息Tab. 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索了其他物種ATG5的氨基酸序列(表2)，再使用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行氨基酸序列一致性分析。使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對，并使用BOXSHADE進(jìn)行著色。使用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。使用MEGA6.0軟件的鄰接法(Neighborjoining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 LcATG5在大黃魚組織和免疫細(xì)胞中的表達(dá)分析

提取上述組織、器官或免疫細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用針對LcATG5基因的特異性引物RT-LcATG5-F和RT-LcATG5-R(表1)，并以大黃魚β-actin基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測LcATG5在健康大黃魚組織、器官和免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平。熒光定量PCR反應(yīng)體系∶2×SYBR Green I 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，cDNA模板0.2 μL，無菌水9.6 μL。反應(yīng)條件∶95 °C 預(yù)變性2 min，95 °C 變性15 s，57 °C 退火20 s，72 °C 延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。LcATG5的相對表達(dá)水平采用2?△△CT方法計(jì)算[19]，并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

將分離的大黃魚頭腎原代巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞以及LYCK細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(2.0×106個(gè)/孔)，28 °C培養(yǎng)3 h后，使用終濃度為50 μg/mL的poly(I:C)(Sigma-Aldrich，美國)刺激細(xì)胞，無菌PBS處理的細(xì)胞作為對照，分別于刺激后4、8、12、24和48 h收集細(xì)胞，再利用熒光定量PCR分析LcATG5的表達(dá)變化。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡

將LcATG5的ORF序列插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen，美國)的EcoR I和KpnI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LcATG5。將EPC細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)接種于6孔板后過夜培養(yǎng)，再使用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑(Promega，美國)將2 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LcATG5或?qū)φ召|(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)，中國)裂解細(xì)胞，4 °C，14000×g離心15 min，收集上清液。上清內(nèi)蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下在含有5%(質(zhì)量體積比)脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉1 h，再與小鼠抗6×His標(biāo)簽的單克隆抗體(1∶2000；Thermo Fisher，美國)孵育1 h，使用TBST緩沖液洗滌3次，然后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(1∶4000；Thermo Fisher，美國)孵育1 h，TBST緩沖液洗滌后，最后使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑(NCM Biotech，中國)進(jìn)行顯色。

1.7 病毒感染實(shí)驗(yàn)

將EPC細(xì)胞(1×106個(gè)/孔)接種于6孔板后過夜培養(yǎng)，使用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑將2 μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LcATG5或pcDNA3.1轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，24 h后，每孔加入1 mL 106TCID50/mL SVCV感染細(xì)胞，1 h后移除病毒，加入含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。分別于感染后12和24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，并使用含1%結(jié)晶紫的溶液對細(xì)胞進(jìn)行染色；同時(shí)于感染后24 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測病毒滴度，于感染后12 和24 h收集細(xì)胞提取總RNA，采用熒光定量PCR檢測SVCV糖蛋白基因(SVCV- G)、基質(zhì)蛋白基因(SVCV- M)和磷蛋白基因(SVCV- P)的表達(dá)水平，內(nèi)參為鯉β-actin基因。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚ATG5基因的分子特征與進(jìn)化分析

LcATG5(GenBank登錄號∶XM_027287056.1)的ORF全長為828個(gè)核苷酸，編碼275個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖1)，其預(yù)測分子量為32.32 ku，理論等電點(diǎn)為5.7。與其他物種ATG5氨基酸序列相似，LcATG5含有1個(gè)高度保守的APG5結(jié)構(gòu)域(第79～270位氨基酸)，并具有典型的泛素連接酶特征，包括2個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-like domain)，分別位于第16～105位和第185～273位氨基酸，1個(gè)富螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-rich domain；第121-171位氨基酸)和1個(gè)保守的鈣蛋白酶切割位點(diǎn)(calpain cleavage site；第188～196位氨基酸；圖2)。此外，LcATG5序列中還發(fā)現(xiàn)了與ATG12結(jié)合的位點(diǎn)Lys149(圖2)。序列一致性分析發(fā)現(xiàn)，LcATG5與其他魚類ATG5序列的一致性較高，約為86.18%～98.55%，但是與哺乳類、兩棲類、爬行類和鳥類同源基因的一致性相對較低，為80.43%～81.52%(表2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，魚類ATG5聚成一簇，遠(yuǎn)離兩棲類、鳥類和哺乳類組成的分支，其中LcATG5與棘頭梅童魚ATG5的親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖1 大黃魚ATG5核苷酸與氨基酸序列特征“*”表示終止密碼子，灰色陰影指示保守的APG5結(jié)構(gòu)域。Fig. 1 The nucleotide and amino acid sequence characteristics of LcATG5Terminational codon is indicated by “*” and APG5 domain is shaded by gray.

圖2 大黃魚ATG5與其他物種ATG5氨基酸序列比對序列上方的箭頭指示ATG5保守的結(jié)構(gòu)域，包括2個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-like domain)和1個(gè)富螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-rich domain)。黑色虛線方框指示鈣蛋白酶裂解位點(diǎn)(calpain cleavage)。黑色三角▲標(biāo)出的賴氨酸殘基為ATG12偶聯(lián)位點(diǎn)。Fig. 2 Alignment of ATG5 amino acid sequences from L. crocea and other vertebratesArrows above the sequences represent the conserved domains of ATG5, including two ubiquitin-like domains and a helix-rich domain. The calpain cleavage site is boxed by black dotted line and a lysine residue as the conjugation site for ATG12 is indicated by ▲.

圖3 鄰接法構(gòu)建的ATG5系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed based on ATG5 amino acid sequences

2.2 LcATG5在大黃魚不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)特征

LcATG5在所有檢測的組織或器官中均有表達(dá)，在血液中表達(dá)量最高，在脾臟中表達(dá)量最低(圖4-a)。此外，LcATG5在所檢測的免疫細(xì)胞中也都有表達(dá)，相對表達(dá)水平最高的細(xì)胞是原代粒細(xì)胞，其次是原代淋巴細(xì)胞和LYCK細(xì)胞，最低的是原代巨噬細(xì)胞(圖4-b)。Poly(I:C)刺激后，LcATG5在這4種免疫細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了顯著上調(diào)，在LYCK細(xì)胞和原代淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量都是在處理后12 h達(dá)到峰值，分別是對照組的3.93和1.43倍(圖5-a，c)；LcATG5在原代巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量從刺激后12 h開始上調(diào)，在48 h達(dá)到峰值，是對照組的1.57倍(圖5-b)，而其在原代粒細(xì)胞中的表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，是對照組的2.73倍(圖5-d)。

圖4 LcATG5在大黃魚組織/器官和免疫細(xì)胞中的表達(dá)模式(a) LcATG5在大黃魚組織/器官中的表達(dá)譜。1. 血液，2. 肌肉，3. 腸，4. 鰓，5. 腦，6. 心臟，7. 肝臟，8. 皮膚，9. 胃，10. 頭腎，11. 脾臟；(b) LcATG5在大黃魚免疫細(xì)胞中的表達(dá)譜。1. 原代頭腎粒細(xì)胞，2. 原代頭腎淋巴細(xì)胞，3. 大黃魚頭腎細(xì)胞系(LYCK)，4. 原代頭腎巨噬細(xì)胞。Fig. 4 Expression profiles of LcATG5 in tissues/organs and immune cells(a) Relative expression levels of LcATG5 transcripts in different tissues of L. crocea. 1. blood, 2. muscle, 3. intestine, 4. gills, 5. brain, 6. heart, 7. liver, 8.skin, 9. stomach, 10. head kidney, 11. spleen; (b) relative expression levels of LcATG5 in immune-related cells of L. crocea 1. primary head kidney granulocytes, 2. primary head kidney lymphocytes, 3. L. crocea head kidney cell line (LYCK), 4. primary head kidney macrophages.

圖5 Poly (I:C) 刺激后免疫細(xì)胞中LcATG5的表達(dá)水平變化使用終濃度為50 μg/mL poly (I:C) 分別刺激大黃魚頭腎細(xì)胞系(a)、原代巨噬細(xì)胞(b)、原代淋巴細(xì)胞(c)和原代粒細(xì)胞(d)；*. P＜ 0.05，**. P ＜0.01。Fig. 5 Expression changes of LcATG5 in immune cells after stimulation with poly (I:C)L. crocea head kidney cell line (a), primary macrophages (b), primary lymphocytes (c), and primary granulocytes (d) were treated with poly (I:C) at a final concentration of 50; *. P ＜ 0.05, **. P ＜ 0.01.

2.3 LcATG5過表達(dá)促進(jìn)SVCV病毒的復(fù)制

為了確定LcATG5在病毒感染過程中的作用，我們在EPC細(xì)胞中過表達(dá)LcATG5，然后使用SVCV感染EPC細(xì)胞，檢測LcATG5過表達(dá)對SVCV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，在EPC細(xì)胞中能夠檢測到LcATG5蛋白表達(dá) (圖6-a)，SVCV感染12和24 h 后，LcATG5的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖6-b)；過表達(dá)LcATG5的EPC細(xì)胞中的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)明顯多于對照組(圖7-a)，并且細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后也顯示出相似的結(jié)果(圖7-b)；同時(shí)過表達(dá)LcATG5的EPC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SVCV滴度為1013.82TCID50/mL，顯著高于對照組109.27TCID50/mL(圖7-c)，細(xì)胞內(nèi)SVCV標(biāo)志基因SVCV-G、SVCVM和SVCV-P的表達(dá)水平也顯著高于對照組，在24 h時(shí)分別是對照組的13.83、15.72和11.39倍(圖7-d～f)。上述結(jié)果表明，LcATG5促進(jìn)了EPC細(xì)胞中SVCV的復(fù)制。

圖6 LcATG5在EPC細(xì)胞中表達(dá)水平分析(a)蛋白免疫印跡分析LcATG5在EPC細(xì)胞中表達(dá)情況，1. 對照，2. LcATG5，下同；(b)熒光定量PCR檢測SVCV感染EPC細(xì)胞12和24 h后 LcATG5的轉(zhuǎn)錄水平。Fig. 6 Expression level of LcATG5 in EPC cells(a) Western blotting was used to detect the overexpression of LcATG5 in EPC cells, 1. control, 2. LcATG5, the same below; (b) the expression level of LcATG5 genes was detected in EPC cells at 12 and 24 h post-infection by real-time PCR.

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。自噬在病毒感染過程中也發(fā)揮著重要作用，可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的病毒顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，利用溶酶體清除病毒，也可以將病毒轉(zhuǎn)運(yùn)給細(xì)胞內(nèi)感受器或MHCⅡ類分子激活先天性或適應(yīng)性免疫應(yīng)答[20]。自噬在病毒感染中的作用具有雙重性，一方面自噬能夠降解入侵的病毒，另一方面有些病毒能夠利用自噬的過程進(jìn)行復(fù)制、增殖[21]，這取決于病毒和細(xì)胞的類型以及細(xì)胞所處環(huán)境[11,22]。目前關(guān)于自噬和自噬相關(guān)基因(ATG)在魚類病毒感染過程中報(bào)道還相對較少。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚自噬相關(guān)基因Beclin-1通過誘導(dǎo)自噬或負(fù)調(diào)控I型干擾素反應(yīng)促進(jìn)病毒復(fù)制[23]。本研究從大黃魚中克隆了ATG5基因(LcATG5)，其ORF全長為828個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)含有275個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有1個(gè)保守的APG5結(jié)構(gòu)域和典型的泛素連接酶特征，包括2個(gè)泛素類結(jié)構(gòu)域和1個(gè)富螺旋結(jié)構(gòu)域，這三個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用形成凹槽，再與ATG16氨基端的螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合[6]。LcATG5序列中還包含1個(gè)calpain切割位點(diǎn)，其基序與草魚和斑馬魚的相同，該位點(diǎn)經(jīng)過calpain選擇性剪切，ATG5可在該位點(diǎn)分割成兩種形式，分別作為分子開關(guān)引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入自噬或凋亡[24]。此外，與黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)ATG5結(jié)構(gòu)類似，LcATG5存在保守的Lys-149，能夠與ATG12的Gly-186偶聯(lián)，這是自噬小體形成的關(guān)鍵步驟[25]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，LcATG5與其他魚類ATG5處于硬骨魚類分支中，表明本研究克隆得到的LcATG5確實(shí)為ATG5的同源基因，并且LcATG5與棘頭梅童魚ATG5的序列一致性最高，為98.55%。綜上結(jié)果表明LcATG5在進(jìn)化過程中保留了保守的結(jié)構(gòu)特征，也預(yù)示了其功能的保守性。

LcATG5在所有檢測的組織或器官中呈組成型表達(dá)，這種組成型表達(dá)模式在其他魚類，如石斑魚、黃顙魚和草魚中都有報(bào)道，說明自噬是在魚體內(nèi)是一個(gè)普遍的過程，可能與各個(gè)組織的生理功能密切相關(guān)。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)，LcATG5在大黃魚血液中的表達(dá)量最高，在脾臟中的表達(dá)量最低，這與石斑魚、黃顙魚和草魚中報(bào)道的結(jié)果明顯不同，石斑魚和黃顙魚ATG5都是在腦組織中的表達(dá)量相對較高[26-27]，而草魚ATG5的表達(dá)量在鰓組織中相對較高，在中腎部位表達(dá)量較低[28]，上述結(jié)果表明，不同魚類中ATG5的組織分布模式存在明顯差異，可能是由于魚種差異或生存環(huán)境不同導(dǎo)致的。此外，LcATG5基因在原代巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞以及LYCK細(xì)胞中也均有表達(dá)，提示LcATG5可能參與大黃魚免疫應(yīng)答過程。

ATG5啟動(dòng)雙膜囊泡形成是自噬過程的重要步驟，ATG5在病毒復(fù)制過程中的功能在哺乳類中已經(jīng)被證實(shí)[29]。目前在魚類中的研究相對較少，赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)和石斑魚虹彩病毒(SGIV)感染后，石斑魚ATG5的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[26]；病毒類似物poly (I:C) 刺激24 h，草魚CIK細(xì)胞中ATG5的表達(dá)水平也顯著上調(diào)[28]。在本研究中，poly (I:C) 處理后，LcATG5在大黃魚4種免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著上升，表明魚類ATG5可能在病毒感染過程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LcATG5可顯著增加了SVCV感染引起的CPE現(xiàn)象，同時(shí)感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SVCV滴度和細(xì)胞內(nèi)SVCV標(biāo)志基因的表達(dá)水平均顯著升高，表明LcATG5促進(jìn)了SVCV病毒在EPC細(xì)胞中復(fù)制。已有研究報(bào)道，過表達(dá)石斑魚ATG5促進(jìn)RGNNV和SGIV復(fù)制，草魚ATG5顯著抑制草魚呼腸孤病毒(GCRV)感染后IFN-I的表達(dá)。因此，實(shí)驗(yàn)推測魚類病毒可能利用ATG5參與形成的雙膜囊泡進(jìn)行復(fù)制，并且ATG5通過抑制I型干擾素反應(yīng)影響魚類的抗病毒免疫應(yīng)答。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從大黃魚中鑒定出一個(gè)ATG5基因，其在所有檢測的組織、器官和免疫細(xì)胞中呈組成型表達(dá)，同時(shí)poly(I:C) 刺激顯著上調(diào)了免疫細(xì)胞中LcATG5的表達(dá)水平。功能研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LcATG5能夠促進(jìn)EPC細(xì)胞中SVCV增殖，但是具體機(jī)制有待明確。這些研究結(jié)果將為深入研究自噬和自噬相關(guān)基因在魚類病毒感染過程中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）