以絲瓜絡(luò)為碳源的固相反硝化系統(tǒng)性能

高書偉， 張 凱， 李志斐， 謝 駿， 王廣軍， 郁二蒙，李紅燕， 夏 耘， 田晶晶， 龔?fù)麑?

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2. 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

近年來，我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)展迅猛，水產(chǎn)品總產(chǎn)量已超過世界總產(chǎn)量的一半以上[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖在提供大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的同時(shí)，由于大量的飼料投入以及魚蝦排泄物的產(chǎn)生導(dǎo)致養(yǎng)殖水體氮素積累超負(fù)荷，影響了養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全[2]，養(yǎng)殖尾水直接外排也會(huì)引起嚴(yán)重的環(huán)境問題[3]。異養(yǎng)反硝化去除水體硝酸鹽(NO3?-N)最具經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法之一，然而水體碳氮比(C/N)是制約異養(yǎng)反硝化脫氮效果的關(guān)鍵因素[4]。通常養(yǎng)殖尾水的碳氮比在1.0～2.0(質(zhì)量比)，碳源不足嚴(yán)重制約了反硝化進(jìn)程[5]。因此，對(duì)養(yǎng)殖尾水進(jìn)行深度脫氮往往需要外加碳源。

傳統(tǒng)外加碳源多為甲醇、乙醇和乙酸等液體碳源和人工合成聚合物如PCL、PLA等固體碳源，因其存在成本高、難操作、易造成二次污染、運(yùn)輸和儲(chǔ)存復(fù)雜等問題，阻礙了其廣泛應(yīng)用[6-7]。農(nóng)業(yè)廢棄物是一類以纖維素為主的天然材料，由于廉價(jià)易得、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，且具有較大的比表面積適合微生物附著生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[8-9]。然而，水力停留時(shí)間(hydraulic retention time, HRT)和進(jìn)水硝酸鹽濃度(influent nitrate concentration, INC)是影響以農(nóng)業(yè)廢棄物為碳源的固相反硝化系統(tǒng)性能的關(guān)鍵因素[10]。當(dāng)HRT較短時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入反應(yīng)器的氧氣量增加會(huì)抑制反硝化的進(jìn)行，同時(shí)反硝化細(xì)菌和水體接觸時(shí)間較短會(huì)造成脫氮不完全[11]。隨著HRT的增加，脫氮效果隨之也提高，但過長(zhǎng)的HRT也會(huì)降低系統(tǒng)的處理效率[12]。Blackmer等[13]的研究表明，INC會(huì)影響反硝化系統(tǒng)的脫氮性能，高濃度的NO3?-N通過抑制氮?dú)獾纳桑D(zhuǎn)而生成一氧化二氮來影響反硝化。通常INC的升高能增加單位時(shí)間內(nèi)NO3?-N的去除量，隨著INC的降低則會(huì)出現(xiàn)相反的結(jié)果[10]。這主要是因?yàn)楦叩腎NC提供了更多的電子受體，單位時(shí)間內(nèi)減少的NO3?-N質(zhì)量增加[14]。

絲瓜絡(luò)(loofah sponge, LS)作為一種常見的農(nóng)業(yè)廢棄物，富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，能夠持久釋放碳源，且具有多層纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[15]，已被證明是一種理想的固體碳源[8]。然而關(guān)于HRT和INC對(duì)絲瓜絡(luò)反應(yīng)器反硝化性能的影響少有報(bào)道。本研究的主要目的是構(gòu)建以絲瓜絡(luò)為碳源的固相反硝化系統(tǒng)，并探究在不同HRT和INC下該系統(tǒng)的反硝化性能，并通過電子顯微鏡觀察了絲瓜絡(luò)表面結(jié)構(gòu)變化情況，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了反應(yīng)器運(yùn)行初期和末期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。本研究結(jié)果為絲瓜絡(luò)作為反硝化碳源在水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水反硝化工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

絲瓜絡(luò)采自廣州市某農(nóng)村，將絲瓜絡(luò)剪切為約1 cm3大小，用超純水洗滌2遍，之后60 °C烘干放于密封袋中備用。反硝化污泥采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所多年未清理的池塘底泥，用紗布(16目)過濾去除雜質(zhì)。合成水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水(synthetic aquaculture wastewater，SAW)按照Li等[16]的方法用純水配制，每升SAW中氮磷化合物含量如表1所示，NO3?-N濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，亞硝酸鹽(NO2?-N)為2.5 mg/L，氨氮(NH4+-N)為5.5 mg/L，總磷(TP)為23.88 mg/L，其中每升SAW中微量元素體積占比2 ‰(2 mL)，實(shí)驗(yàn)所需化學(xué)藥品(分析純)購于上海麥克林生化科技股份有限公司。

表1 人工合成養(yǎng)殖廢水組成Tab. 1 Composition of synthetic aquaculture wastewater

實(shí)驗(yàn)用儀器為YSI Professional Plus系統(tǒng)(YSI Incorporated，美國(guó))，蠕動(dòng)泵 (WT-600CAS/353Y型，北京)，COD測(cè)定儀 (DRB200/DR900，美國(guó))，TN測(cè)定儀 (LH-25A/LH-3BN，北京)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC，上海)。

1.2 反應(yīng)器建立及運(yùn)行

如圖1所示，以圓柱形有機(jī)玻璃容器作為反硝化反應(yīng)器 (denitrification reactor，DR；直徑10 cm，高55 cm)，進(jìn)水方式為下進(jìn)上出式，進(jìn)水口位于底部向上5 cm處，出水口位于頂部向下5 cm處。用廢舊毛巾(100×40 cm)包裹40 g絲瓜絡(luò)和200 mL反硝化污泥置入反應(yīng)器內(nèi)，有效容積為(2800±100) mL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，蠕動(dòng)泵控制進(jìn)水流速來調(diào)整HRT。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性及反應(yīng)器的規(guī)模化運(yùn)行，本研究在室內(nèi)進(jìn)行，溫度為(22±2) °C，光照強(qiáng)度為(355 ± 31) Lux。LS-DR0表示絲瓜絡(luò)反應(yīng)器運(yùn)行初期，LS-DR14表示反應(yīng)器運(yùn)行末期(INC為50 mg/L，HRT為24 h)。

圖1 反硝化系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of denitrification system

HRT對(duì)LS-DR反硝化性能的影響向LS-DR中加滿SAW (NO3?-N=50 mg/L)，靜置，當(dāng)NO3?-N完全去除，且無NO2?-N積累，認(rèn)為馴化成功。之后維持INC為50 mg/L，分別在4個(gè)HRT(16、20、24和28 h)下運(yùn)行14 d，每2天定時(shí)測(cè)定出水NO3?-N、NO2?-N、NH4+-N、TN、TP、COD和溶解氧(DO)濃度以及pH值。

INC對(duì)LS-DR反硝化性能的影響馴化方法同上，在最佳HRT的基礎(chǔ)上，分別在3個(gè)INC(75、100和125 mg/L)下運(yùn)行14 d，每2天測(cè)定出水NO3?-N、NO2?-N、NH4+-N、TN、TP、COD和溶解氧(DO)濃度以及pH值。

LS-DR微生物群落結(jié)構(gòu)分析HRT實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別收集LS-DR0和LS-DR14的污泥樣品進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性分析。提取DNA后，以“CC TACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”為上游引物，“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列為下游引物對(duì)原核生物16SrDNA的V3及V4高度可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，包括上下游引物各1 μL、dNTPs 2 μL、TransStart Buffer 2.5 μL、TransStartTaqDNA 0.5 μL和模板DNA 20 ng，之后用dd H2O補(bǔ)充體系。高通量測(cè)序文庫的構(gòu)建和基于Illumina MiSeq平臺(tái)的測(cè)序由蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

絲瓜絡(luò)表面結(jié)構(gòu)分析分別收集LS-DR0和LS-DR14的絲瓜絡(luò)在烘箱中烘干(60 °C)。利用掃描電子顯微鏡(SEM)(QUANTA 250, Servicebio Co.,中國(guó))觀察其表面結(jié)構(gòu)變化。

1.3 分析方法

水樣經(jīng)0.45 μm濾膜[Pall 頗爾 ( 中國(guó) )有限公司]過濾后測(cè)定NO3?-N、NO2?-N和NH4+-N。采用YSI Professional Plus系統(tǒng)測(cè)定DO和pH，使用重鉻酸鉀法測(cè)定COD濃度；采用過硫酸鉀消解法測(cè)定TN和TP；NO3?-N的測(cè)定采用麝香草酚分光光度法；NO2?-N的測(cè)定采用N-(1-萘基)乙二胺光度法；NH4+-N的測(cè)定采用水楊酸分光光度法。

所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，采用SPSS 26.0對(duì)COD、TN、TP和NO3?-N等指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P＜ 0.05時(shí)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用GraphPad棱鏡8.0.2和Excel 2010作圖。

2 結(jié)果

2.1 絲瓜絡(luò)表面結(jié)構(gòu)變化

運(yùn)行初期，通過100倍SEM觀察絲瓜絡(luò)運(yùn)行結(jié)果如圖版-1所示，發(fā)現(xiàn)其表面呈褶皺狀，具有較大的比表面積和粗糙度，適合微生物的生長(zhǎng)附著。在500倍下，絲瓜絡(luò)表面則相對(duì)平整(圖版-3)。經(jīng)過14 d運(yùn)行后，從圖版-4 可以看出其表面結(jié)構(gòu)被水解，顯露出不規(guī)則的片狀突起。此外，表面附著一些細(xì)菌和雜質(zhì)，說明絲瓜絡(luò)是良好的生物載體，附著細(xì)菌也能促進(jìn)碳源的釋放及反硝化的進(jìn)行。

2.2 HRT對(duì)NO3?-N、NO2?-N、NH4+-N、TN、TP和COD的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，LS-DR的DO均低于1 mg/L，pH在6.50～7.20。如圖2-a所示，INC為50 mg/L時(shí)，不同HRT下，出水硝酸鹽濃度(effluent nitrate concentration，ENC)均大幅度降低。HRT為16、20、24和28 h時(shí)，NO3?-N去除率分別為69.19%±4.59%、82.65%±3.62%、98.97%±0.52%和98.62%±1.33%。單因素方差分析顯示，HRT在16～24 h，NO3?-N去除率隨HRT的延長(zhǎng)而顯著升高 (P＜0.05)。當(dāng)HRT從24 h增加到28 h時(shí)，NO3?-N去除率維持穩(wěn)定(P=0.80)，說明HRT在24 h時(shí)，LS-DR已能達(dá)到最佳的NO3?-N去除效果。NO2?-N的變化與ENC有相似趨勢(shì)，說明NO2?-N積累量與ENC呈正相關(guān)，當(dāng)HRT為16和20 h時(shí)，NO2?-N分別為(5.19±1.52)和(1.39±0.49) mg/L(圖2-a)，當(dāng)增加至24和28 h時(shí)，NO2—N低于0.5 mg/L，說明可以實(shí)現(xiàn)完全反硝化。在進(jìn)水NH4+-N濃度為5.50 mg/L的情況下， LS-DR均能夠?qū)⑵渫耆コN的去除過程與NO3?-N有相似的規(guī)律 (圖2-b)，當(dāng)HRT為16和20 h時(shí)，TN去除率分別為73.30%±7.21%和70.67%±6.30%，延長(zhǎng)至24 h后，TN去除率達(dá)到最高(97.84%±0.94%)，顯著高于其他HRT (P＜0.05)。綜合以上分析， 本研究中LS-DR的最佳HRT為24 h。

圖版 實(shí)驗(yàn)前(1、2)后(3、4)絲瓜絡(luò)表面結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察結(jié)果1，3. LS-DR0；(2)(4) LS-DR14.Plate SEM observation results of surface structure of LS before (1, 2) and after (3, 4) the experiment

圖2 不同HRT下LS-DR對(duì)含氮磷污染物的去除性能Fig. 2 Removal performance of LS-DR for nitrogen and phosphorus pollutants at different HRT

TP隨HRT的變化曲線如圖2-b所示，HRT在16～28 h時(shí)，TP 去除率為88%～89%，無顯著差異(P＞0.05)。如圖2-c所示，COD隨HRT的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，分別為(77.42±16.66) mg/L(HRT=16 h)、(32.25±9.33) mg/L (HRT=20 h)、(26.52±10.52) mg/L (HRT=24 h)和(44.24±10.88) mg/L(HRT=28 h)，其中HRT為16 h時(shí)，COD的利用率較低，出水COD顯著高于其他HRT (P＜0.05)，但HRT在20 、24 和28 h時(shí)出水COD無顯著差異 (P＞0.05)。

2.3 INC對(duì)NO3?-N、NO2?-N、TN、TP和COD的影響

在最佳HRT(24 h)的基礎(chǔ)上，當(dāng) INC為75、100和125 mg/L 時(shí)，ENC隨INC的增加而增加(圖3-a)，分別為(24.89±2.91)、(26.91±0.94)和(27.55±2.78) mg/L，無顯著差異 (P＞0.05)。NO3?-N去除率隨INC增加而大幅度增加，當(dāng)INC為125 mg/L時(shí)，NO3?-N去除率(77.96%±2.22%)顯著高于INC為75 mg/L (66.81%±3.88%)和100 mg/L(73.09%±0.94%)時(shí)的去除率 (P＜0.05)。同樣，NO3?-N去除速率(nitrate removal rate, NRR)也隨INC提高而顯著增加 (P＜0.05)，當(dāng)INC為75、100和125 mg/L時(shí)，NRR分別為(50.11±2.91)、(73.09±0.94)和(97.45±2.78) mg/(L·d)，說明INC能夠顯著影響LS-DR的NO3?-N去除率和NRR。如圖3-a所示，NO2?-N與NO3?-N有相似的變化趨勢(shì)，然而，INC為75、100和125 mg/L時(shí)，NO2?-N均出現(xiàn)積累，分別為3.80±1.22、5.37±0.75和5.67±0.07 mg/L，說明INC在75至125mg/L范圍內(nèi)，LS-DR均不能實(shí)現(xiàn)完全反硝化。不同INC下，TN的變化曲線如圖3-b所示，分別為(29.65±3.16) mg/L (INC=75 mg/L)、(37.77±3.56) mg/L (INC=100 mg/L)和(40.27±7.12) mg/L (INC=125 mg/L)，對(duì)應(yīng)去除率分別為64.28%±3.81%、65.03%±3.29%和69.72%±5.35%，各組之間無顯著差異 (P＞0.05)。結(jié)合上述結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為在最佳HRT(24 h)的基礎(chǔ)上，當(dāng)INC為50 mg/L時(shí)，LS-DR的NO3?-N處理能力達(dá)到飽和。

圖3 不同INC下LS-DR 對(duì)含氮磷污染物的去除性能Fig. 3 Removal performance of LS-DR for nitrogen and phosphorus pollutants at different INC

TP的變化曲線如圖3-b所示，不同INC下，TP去除率在81%～82%，各組之間無顯著差異(P＞0.05)，說明INC對(duì)TP的去除效果影響不大。如圖3-c所示，COD隨INC的增加出現(xiàn)降低，INC為75 mg/L時(shí)，出水COD為(55.05±15.90) mg/L，顯著高于INC為100 mg/L [(33.14±12.58) mg/L]和125 mg/L [(26.67±15.66) mg/L]時(shí)，說明INC對(duì)出水COD也有明顯影響。

2.4 LS-DR微生物群落結(jié)構(gòu)分析

LS-DR運(yùn)行前后微生物多樣性指數(shù)變化對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控后，分別獲得49881和52389個(gè)高質(zhì)量序列，共歸入5202和4247個(gè)OTU。所有樣本Coverage指數(shù)大于0.98，說明測(cè)序序列幾乎覆蓋所有的細(xì)菌，測(cè)序結(jié)果具有可靠性和代表性 (表2)。LS-DR經(jīng)過14天運(yùn)行后，其Observed-species、Chao1、Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)均降低，說明細(xì)菌群落多樣性和均勻性改變，其物種數(shù)目、豐富度和均勻度降低，部分細(xì)菌被富集。

表2 細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)Tab. 2 The α diversity index of bacterial community

門水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行門水平上的分類，如圖4-a所示。LSDR運(yùn)行初期及末期的優(yōu)勢(shì)菌在結(jié)構(gòu)組成上有一定的相似性，包括變形菌門 (Proteobacteria)、鹽桿菌門 (Halobacterota)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、脫硫細(xì)菌門 (Desulfobacterota)、彎曲桿菌門 (Campilobacterota)、厚壁菌門 (Firmicutes)、Sva0485、綠彎菌門 (Chloroflexi)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)等，但其相對(duì)豐度具有差異，運(yùn)行初期，它們的相對(duì)豐度分別為15.53%、14.68%、4.61%、8.35%、0.13%、1.69%、4.99%、4.19%和2.27%。運(yùn)行14 d后，變形菌門、擬桿菌門、彎曲桿菌門、厚壁菌門和疣微菌門分別增至33.46%、10.66%、0.34%、2.74%和2.40%，相反，鹽桿菌門、脫硫細(xì)菌門、Sva0485、綠彎菌門分別降至7.58%、6.10%、3.65%和1.97%。整體來說，碳源的持續(xù)釋放以及硝酸鹽的注入導(dǎo)致LS-DR內(nèi)的部分細(xì)菌被富集。

圖4 LS-DR0和LS-DR14在門 (a)和綱 (b)水平上的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative bacteria abundance ofLS-DR0 and LS-DR14 at phylum (a) and class (b) levels

綱水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4-b所示，LS-DR14的優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria，31.69%)、擬桿菌綱 (Bacteroidia，10.41%)、Methanosarcinia (9.27%)、Thermodesulfovibrionia(5.38%)、彎曲菌綱 (Campylobacteria，0.34%)、甲烷微菌綱 (Methanomicrobia，3.05%)、梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia，1.97%)、Desulfobacteria (3.15%)、α-變形菌綱 (Alphaproteobacteria，1.76%)等。相比LS-DR0，γ-變形菌綱、擬桿菌綱、彎曲菌綱、梭狀芽孢桿菌綱和α-變形菌綱的相對(duì)豐度增加，Methanosarcinia、Thermodesulfovibrionia、甲烷微菌綱和Desulfobacteria則降低。

屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平上進(jìn)一步對(duì)OTU進(jìn)行分類，可以觀察到細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更詳細(xì)的差異 (圖5)。LS-DR運(yùn)行初期的優(yōu)勢(shì)菌屬為鬃毛甲烷菌屬 (Methanosaeta，9.26%)、甲烷繩菌屬 (Methanolinea，3.19%)、Desulfatiglans(2.90%)、Candidatus_Competibacter(2.27%)、Methanoregula(2.07%)、Sva0081_sediment_group (1.54%)、Geothermobacter(1.43%)、unidentified_Thermodesulfovibrionia(1.00%)、ADurb.Bin063-1 (0.86%)和莫拉菌屬 (Moraxella，0.72%)。然而，LS-DR運(yùn)行14 d后，優(yōu)勢(shì)菌屬出現(xiàn)明顯改變，為熱單胞菌屬 (Thermomonas，1.46%)、陶厄氏菌屬 (Thauera，0.55%)、固氮螺菌屬 (Azospira，3.32%)、Simpli-cispira(1.01%)、草螺菌屬 (Herbaspirillum，3.02%)、Cloacibacterium(2.69%)、假黃色單胞菌屬 (Pseudoxanthomonas，0.39%)、Uliginosibacterium(0.9%)、Lacunisphaera(1.02%)、Cytophaga xylanolytica(1.61%)、黃桿菌屬 (Flavobacterium，1.17%)、Diaphorobacter(0.64%)和Macellibacteroides(1.59%)。

圖5 基于屬水平上LS-DR0和LS-DR14的物種豐度聚類熱圖Fig. 5 Heat map of species abundance clustering of LS-DR0 and LS-DR14 based on genus level

3 討論

3.1 LS-DR的反硝化性能

厭氧和弱酸性條件有利于反硝化的進(jìn)行[17-18]，實(shí)驗(yàn)期間，LS-DR內(nèi)環(huán)境條件均達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，HRT為24 h時(shí)，LS-DR的反硝化性能最佳，這一結(jié)果與欒曉男等[19]的研究結(jié)果一致，以絲瓜絡(luò)作為反硝化濾池填料，水力停留時(shí)間為24 h時(shí)，對(duì)生活污水中各污染指標(biāo)去除效果達(dá)到最好。鐘華等[20]報(bào)道玉米芯固相反硝化系統(tǒng)的最佳水力停留時(shí)間為16 h，而腐朽木作為緩釋碳源外加到硝化濾池，在初始階段HRT為12 h的脫氮效果最佳[21]。碳源的種類及添加量、反應(yīng)器的理化狀態(tài)、進(jìn)水特性以及溫度等因素均能影響添加碳源的反硝化系統(tǒng)的反硝化性能[22-24]。本研究中，當(dāng)HRT達(dá)到24 h后，系統(tǒng)反硝化性能并未隨著HRT的增加而顯著增加，在以廢活性污泥的熱水解液和產(chǎn)酸液為反硝化碳源時(shí)也有相似的發(fā)現(xiàn)[25]。這是因?yàn)檫^長(zhǎng)的HRT導(dǎo)致NO3?-N的相對(duì)流入量減少，抑制了反硝化細(xì)菌的活性，導(dǎo)致NO3?-N去除率并未顯著增加[26-27]。同時(shí)過長(zhǎng)的HRT促進(jìn)了有機(jī)底物的進(jìn)一步發(fā)酵和水體中較小的膠體和可溶性有機(jī)物 (粒徑＜0.45 μm)的釋放[27]，導(dǎo)致出水COD濃度也出現(xiàn)一定量的回升。

本研究在最佳HRT條件下，當(dāng)INC為50 mg/L時(shí)，LS-DR的反硝化性能最佳。HRT是影響反硝化系統(tǒng)最佳INC的關(guān)鍵因素。以玉米芯為碳源的反硝化系統(tǒng)在HRT為16 h時(shí)， INC為50 mg/L時(shí)具有最佳反硝化效果[20]，而以羥基丁酸戊酸共聚酯為碳源的反硝化系統(tǒng)在HRT為7.25 h時(shí)的最佳INC為100 mg/L，并隨著HRT的變化，反硝化系統(tǒng)的最佳INC發(fā)生改變[28]。董全宇等[29]報(bào)道木屑-硫磺填充床反硝化生物濾池在HRT為10 h條件下，INC為30 mg/L時(shí)的反硝化性能最好。LS-DR的NRR隨著INC的增加而增加，這一結(jié)果與Hoover等[30]的研究結(jié)果相似，以木片為反硝化系統(tǒng)外加碳源，INC從10增至50 mg/L后，出水NO3?-N逐漸增加，單位時(shí)間內(nèi)NO3?-N去除量從7.5增加到12.9 mg/L。這主要因?yàn)殡S著INC的提高，反應(yīng)器單位體積內(nèi)電子受體增加，有效反硝化的NO3?-N質(zhì)量也隨之增加，單位時(shí)間內(nèi)減少的NO3?-N質(zhì)量也增加[10]，同樣的，有機(jī)物作為反硝化的電子供體，其消耗量也會(huì)增加，因此出水COD呈下降趨勢(shì)。

3.2 LS-DR的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

LS-DR運(yùn)行14 d后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。其中變形菌門普遍存在環(huán)境中，是反硝化細(xì)菌的主要來源[31]，其在制藥、煉油、食品等工業(yè)廢水和城市污水[32]以及水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水[5]中均是促進(jìn)反硝化的優(yōu)勢(shì)類群。隸屬變形菌門的γ-變形菌綱和α-變形菌綱包含豐富的硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌和NO2?-N氧化細(xì)菌[33]，是LS-DR脫氮的主要參與者，在麥秸稈、棉花、廢報(bào)紙和聚丁二酸丁二醇酯為碳源的人工濕地中均是優(yōu)勢(shì)綱[34]。擬桿菌門也普遍存在生態(tài)系統(tǒng)中參與氮循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換[35]，其中擬桿菌綱有反硝化功能[36]。此外，擬桿菌門中還存在分解蛋白質(zhì)、纖維素和脂質(zhì)等大分子有機(jī)物的細(xì)菌[27]，促進(jìn)了絲瓜絡(luò)的分解。以絲瓜絡(luò)為填料的反硝化濾池中也發(fā)現(xiàn)擬桿菌門大量存在[37]。厚壁菌門中也存在參與反硝化和纖維素降解的細(xì)菌，曾在生活污水處理系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[38]。綠彎菌門在反硝化過程中的具體作用并沒有報(bào)道，但亞硝酸鹽氧化菌已經(jīng)從綠彎菌門中分離出來[39]，具有一定參考性。疣微菌門中存在具有較高木質(zhì)素降解能力的細(xì)菌[40]，主要促進(jìn)絲瓜絡(luò)降解。

在被鑒定的優(yōu)勢(shì)屬中假黃色單胞菌能夠還原NO2?-N，但不能還原NO3?-N[41]，Diaphorobacter和黃桿菌均能降解絲瓜絡(luò)并進(jìn)行反硝化，以往研究發(fā)現(xiàn)，上述三類菌屬在聚羥基丁酸戊酸共聚酯支撐的養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)運(yùn)行中后期成為優(yōu)勢(shì)菌屬[42]，這與本研究相似；Cytophaga xylanolytica能在嚴(yán)格厭氧下分解木聚糖等多糖[43]，對(duì)絲瓜絡(luò)的降解有重要作用；熱單胞菌屬和陶厄氏菌屬是常見的反硝化菌屬[44]，在以豬糞為碳源處理養(yǎng)豬尾水的過程中被富集[45]。有趣的是，有研究發(fā)現(xiàn)陶厄氏菌在以纖維素類材料為碳源的人工濕地中被富集，而在可降解聚合物為碳源的人工濕地中減少[34]，說明絲瓜絡(luò)對(duì)反硝化菌有選擇性。Simplicispira在玉米芯支撐的人工濕地中是優(yōu)勢(shì)反硝化菌屬[46]，在本研究中同樣被發(fā)現(xiàn)。草螺菌屬和Uliginosibacterium均為好氧反硝化菌[47]，曾在城市污水處理廠中發(fā)現(xiàn)[48]，可能導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)低溶氧條件。Cloacibacterium主要參與絲瓜絡(luò)的降解，其對(duì)玉米芯[49]、羥基丁酸和羥基戊酸共聚物[50]也有降解作用。綜合來看，這些富集菌屬共同促進(jìn)了絲瓜絡(luò)的降解和反硝化的進(jìn)行。添加CH3COONa[51]、小麥秸稈、棉花、聚琥珀酸丁二烯和報(bào)紙[34]的反硝化系統(tǒng)中均富集了反硝化功能屬。相反，甲烷鬃菌屬、甲烷繩菌屬和Methanoregula等一些產(chǎn)甲烷古細(xì)菌在LS-DR內(nèi)豐度降低，這可能是有機(jī)物濃度的增加對(duì)它們的生長(zhǎng)代謝有抑制作用[52]，在同步反硝化產(chǎn)甲烷系統(tǒng)中也有類似現(xiàn)象發(fā)生[53]。

4 結(jié)論

INC為50 mg/L，HRT為24 h時(shí)，LS-DR的反硝化性能最佳，NO3?-N去除率達(dá)到98.97%±0.52%，TN去除率達(dá)到97.84%±0.94%，NO2?-N處于較低水平(＜0.5 mg/L)，能夠?qū)崿F(xiàn)完全反硝化。在HRT為24 h的基礎(chǔ)上，當(dāng)INC分別增加至75、100和125 mg/L時(shí)，LS-DR的NO3?-N去除率和NRR均隨INC的增加而增加，出水COD隨INC的增加而降低，但均未實(shí)現(xiàn)完全反硝化。

在HRT為24 h，INC為50 mg/L條件下運(yùn)行14 d后，LS-DR內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，優(yōu)勢(shì)菌門包括變形菌門、擬桿菌門、彎曲桿菌門、厚壁菌門和疣微菌門。被鑒定的優(yōu)勢(shì)菌屬中熱單胞菌屬、陶厄氏菌屬、固氮螺菌屬、Simplicispira、假黃色單胞菌屬、草螺菌屬和Uliginosibacterium能夠進(jìn)行反硝化，Cytophaga xylanolytica和Cloacibacterium主要參與了絲瓜絡(luò)的降解，Diaphorobacter和黃桿菌既能進(jìn)行反硝化，也能降解絲瓜絡(luò)。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）