干酪乳桿菌發(fā)酵人參莖葉提取物對錦鯽免疫及抗氧化功能的影響

孟 欣， 于 鵬， 單曉楓， 錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118)

錦鯽(Carassius auratus)又名草金魚，由于其花色似錦而得名，是一種重要的觀賞魚類。飼用促生長抗生素在過去的數(shù)十年間對保障動物健康發(fā)揮了重要作用，但大量使用抗生素會影響魚的生長及代謝，造成腸道菌群的失調(diào)，影響觀賞魚的體色和健康，導致水體耐藥細菌產(chǎn)生[1-2]。因此，替抗產(chǎn)品的研究已引起廣泛關注。

人參(Panax ginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬植物，是中國傳統(tǒng)的名貴中草藥，通常為人們所熟知的是人參的根[3]。人參皂苷作為人參中重要的活性成分，在人參中含量較多且種類豐富，藥理活性表明其普遍具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)腸道微生物功能等作用[4]。我國作為人參栽培大國，此前人參莖葉一般是作為廢料丟棄，但為了使人參的應用更為多元化，人參資源盡可能地有效利用，學者們開始對人參地上部分的化學成分以及相關藥理作用進行研究[5]。稀有皂苷相較于原型人參皂苷而言其生物活性更加多元化，且更易被機體所吸收，但其提取方式相對繁難[6]。在人參的加工品中，其功效最主要通過稀有皂苷的含量來評價，因此，現(xiàn)在已經(jīng)有大量關于稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的研究，且發(fā)現(xiàn)人參莖葉所含皂苷含量是人參各部位中最多的，皂苷結(jié)構(gòu)更具多樣性，可作為人參皂苷提取的重要資源。因此，對于人參莖葉資源的利用不僅可以更好的發(fā)揮人參的地上價值，同時可以減少資源浪費，保護環(huán)境。

微生物發(fā)酵是中藥材的重要炮制手段之一，在發(fā)酵過程中利用微生物將中草藥的有效成分更高效地分解出來，增強或新添功效，擴大治療范圍[7]。與此同時，通過發(fā)酵產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，節(jié)約中藥材資源的同時增加中藥制劑的多元性及安全性[8]。由于大多數(shù)水產(chǎn)動物無法分解組成中藥材細胞壁的纖維素和半纖維素，導致中藥材的有效成分很難被魚體吸收從而產(chǎn)生浪費[9]。通過益生菌發(fā)酵中藥技術(shù)可以有效地破壞中藥材的細胞壁，使活性成分溶解，減少藥物的用量。另外，發(fā)酵所使用的益生菌還可以調(diào)節(jié)胃腸道菌群，改善胃腸道功能，控制腸道內(nèi)腐敗菌生長[10]。因此，益生菌發(fā)酵中藥在魚類養(yǎng)殖中的應用逐漸受到重視。

研究表明，利用益生菌發(fā)酵中藥的抑菌效果要比單獨使用中藥水提液或僅用益生菌的效果顯著。同時有研究表明，微生物可以通過去糖基化作用使人參固有皂苷向稀有皂苷轉(zhuǎn)化，增強人參的藥理活性[11]。隨著人們對人參地上部分研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的人參莖葉中皂苷類成分之間會發(fā)生轉(zhuǎn)化，Rg3、Rh2、Rh1等稀有皂苷的水平有所升高[12]。其中人參皂苷Rg3作為稀有皂苷已被證實可以抑制腫瘤生長，改善心臟功能[13]。目前對于益生菌發(fā)酵人參莖葉以及其有關活性成分作為飼料添加劑多應用于畜牧業(yè)，在水產(chǎn)領域還尚未見報道，對于發(fā)酵人參莖葉應用于水生動物時所使用的適配菌方面的研究還有待探究。因此，本實驗利用不同干酪乳桿菌(Lacticaseibacillus casei)菌液接種量作為發(fā)酵菌種對人參莖葉進行液體發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物與飼料均勻混合后進行動物體內(nèi)實驗，評估其對于錦鯽免疫及抗氧化功能的影響，同時篩選出在本實驗條件下干酪乳桿菌在發(fā)酵人參莖葉提取物時的最佳接種量，以期為益生菌發(fā)酵人參莖葉在水生動物養(yǎng)殖中的應用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用干酪乳桿菌ATCC393、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilaTPS-30)均由吉林農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。人參莖葉提取物，即人參莖葉總皂苷，由吉林農(nóng)業(yè)大學中藥學院提供，測得總皂苷含量≥80%, 采用水提取大孔吸附樹脂富集方式制備。

1.2 細菌培養(yǎng)及實驗飼料的制備

干酪乳桿菌的活化及培養(yǎng)將干酪乳桿菌ATCC393于MRS固體培養(yǎng)基劃線，37 °C厭氧條件下過夜培養(yǎng)，接種單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C條件下厭氧培養(yǎng)24 h。將菌懸液5000 r/min離心15 min，棄上清液，并加入等量無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，反復離心3次，用平板計數(shù)的方法確定干酪乳桿菌的菌液濃度，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU/mL，置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥液制備稱取4份中藥人參莖葉提取物(8 g/份)，分別將其置于4個已滅菌50 mL的錐形瓶中，每瓶加入20 mL蒸餾水，保證中藥提取物均溶于水中后，于121 °C下高壓滅菌20 min，置于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥發(fā)酵液的制備在4個已滅菌的250 mL錐形瓶中，分別加入200 mL pH 6.0的MRS液體培養(yǎng)基，隨后按3%、4%、5%、6%(干酪乳桿菌菌液體積/培養(yǎng)體系總體積)的比例接種干酪乳桿菌菌液，37 °C厭氧條件下發(fā)酵24 h后，即得到中藥發(fā)酵液，測得發(fā)酵液pH為3.5。

飼料的制備將4份中藥發(fā)酵液分別與1 kg基礎飼料混合均勻，置于37 °C恒溫箱烘干后，即得到4種實驗飼料，干酪乳桿菌菌液接種量為3%、4%、5%和6%的飼料分別記為L3、L4、L5和L6，對照組飼喂基礎飼料記為L0，置于4 °C下低溫避光保存?；A飼料配方中魚粉35%、菜籽粕20%、大豆18%、小麥粉18%、酵母粉6%、氯化鈉1%、維生素1%、礦物質(zhì)1%。營養(yǎng)成分分別為粗蛋白質(zhì)33%、粗纖維8%、粗灰分12%、粗脂肪3%、水分9%、總磷1%、總賴氨酸1.5%。

1.3 實驗日常管理

實驗用錦鯽購買于長春某魚市，初始平均體重為(25.00±0.05) g，在吉林農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地控溫單循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行飼養(yǎng)。實驗前1周使用高錳酸鉀對魚缸內(nèi)進行全面消毒，并提前3 d向其內(nèi)注水。實驗錦鯽入水前，在3%濃度的鹽水中浸洗消毒10～15 min。在實驗前2周使用基礎飼料飼喂，并觀察健康情況。暫養(yǎng)期結(jié)束后，挑選出健康無病的錦鯽250尾，并隨機平均分配到5個圓柱形玻璃魚缸內(nèi)(r=40 cm，h=110 cm，每缸容水量約為550 L)。分別用上述5組飼料持續(xù)投喂5周，日投餌率為錦鯽平均體重的3%～4%，每日分別在8:00和17:00投喂2次。實驗在循環(huán)水系統(tǒng)中保持24 h持續(xù)供氧，每天更換1/3的水，保持養(yǎng)殖期間的水質(zhì)指標，水溫設定為27～29 °C，溶解氧含量大于5 mg/L，氨氮值小于0.02 mg/L。本研究獲得了吉林農(nóng)業(yè)大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守吉林農(nóng)業(yè)大學倫理規(guī)范，并按照吉林農(nóng)業(yè)大學倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.4 樣品收集與指標檢測

樣品收集分別在養(yǎng)殖第0、7、14、21、28和35天進行取樣，每次取樣前空腹24 h，每組隨機抽取3尾魚，尾部靜脈抽血，將血液置于37 °C溫箱0.5 h后，4 °C冰箱過夜，4 °C、5500 r/min離心15 min后，提取血清，分裝置于?80 °C冰箱中保存。無菌條件下采集臟器(肝胰臟、脾臟、中腎、全腸)，液氮速凍后，置?80 °C冰箱保存，用于后續(xù)相關免疫指標的測定。

血清學指標檢測溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、免疫球蛋白M(IgM)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及丙二醛(MDA)均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行檢測，具體檢測方法依照試劑盒說明書進行操作。

細胞因子表達量的測定通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測錦鯽各臟器組織中IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ和IL-1β的相關表達量。所需研缽均在烘干箱170 °C干熱4 h后使用，操作臺為提RNA專用操作臺，槍頭、離心管均為無RNA-free。按BioFlux總RNA提取試劑盒說明書，提取各臟器組織總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于?80 °C保存。以各組織的cDNA作為模板，進行qRT-PCR操作，反應體系20 μL∶2×Taqmix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，無菌水補充至20 μL。反應條件∶95 °C預變性30 s；95 °C變性5 s，55～61 °C退火30 s (不同引物退火溫度不同)，40個循環(huán)。對照組樣品作為參照，每個樣品設定3個重復，內(nèi)參基因選擇β-actin(表1)。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.5 攻毒保護性實驗

飼喂實驗結(jié)束后，選擇嗜水氣單胞菌TPS進行攻毒實驗。每組選擇20尾規(guī)格相近的魚，每尾腹腔注射1×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌0.1 mL后恢復投餌，并記錄攻毒后14 d內(nèi)各組錦鯽的發(fā)病癥狀以及死亡情況，初步檢測不同干酪乳桿菌菌液接種量的發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽嗜水氣單胞菌攻毒的保護效果。

1.6 數(shù)據(jù)分析

除攻毒保護性實驗外，其余結(jié)果均采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，若方差分析顯著，進一步利用Duncan氏進行多重比較，顯著水平設定為0.05。

2 結(jié)果

飼喂實驗結(jié)束時，各組體重均有增加，平均體重為(30.16±0.07)g。4個飼喂發(fā)酵液組別存活率均為100%，體表健康，活力正常，攝食情況均較好，每天2次投食可在5～10 min吃完。

2.1 不同發(fā)酵液對錦鯽血清生化指標的影響

與L0組相比，L4、L5和L6組AKP活性均在整個實驗期間有明顯的上升趨勢，并顯著高于L0組(P＜0.05)；其中L5組在第35天時達到AKP活性的最高值(圖1)。L5組LZM活性在第28天時LZM活性達到最高，顯著高于L0組(P＜0.05)，其他組別的上升趨勢并不顯著(P＞0.05)。各發(fā)酵液組間相比較，L5組SOD活性上升最為明顯，從第21天開始呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，并在第35天時達到最高，顯著高于L0組(P＜0.05)，其余3個發(fā)酵液組別的SOD活性在整個實驗期間上升趨勢并不顯著(P＞0.05)。四個發(fā)酵液處理組的CAT活性均表現(xiàn)上升趨勢，其中L5組上升趨勢最為顯著，在第28天時活性顯著升高并達到最高值(P＜0.05)。4組發(fā)酵液處理組別GSH-Px活性在整個實驗期間均表現(xiàn)出不同程度的上升，其中L5組上升最為明顯，并在第28天時達到最高值，與L0組相比有顯著差異(P＜0.05)。與L0組相比，4個發(fā)酵液處理組MDA含量均呈下降趨勢，但各組下降趨勢并不顯著(P＞0.05)，其中L5組在第35天時達到最低。各發(fā)酵液處理組的IgM活性均有上升趨勢，但并不明顯(P＞0.05)，但L5組在第28天時IgM活性最高。

圖1 不同發(fā)酵液對錦鯽血清生化指標的影響L0. 對照組，L3. 干酪乳桿菌接種量3%的發(fā)酵液，L4. 干酪乳桿菌接種量4%的發(fā)酵液，L5. 干酪乳桿菌接種量5%的發(fā)酵液，L6. 干酪乳桿菌接種量6%的發(fā)酵液；下同。Fig. 1 Effects of different fermentation products on serum biochemical parameters of C. auratusL0. control group, L3. fermentation broth group with 3% inoculation amount of L. casei, L4. fermentation broth group with 4% inoculation amount of L.casei, L5. fermentation broth group with 5% inoculation amount of L. casei, L6. fermentation broth group with 6% inoculation amount of L. casei; the same below.

2.2 不同發(fā)酵液對錦鯽免疫相關基因表達的影響

發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽各臟器組織中不同免疫相關基因的表達量影響顯著(圖2)。在肝胰臟組織中，與L0組相比，IL-10和TNF-α基因表達水平整體隨干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，L5組均在第35天達到最高值，表達量與L0組均有顯著的差異(P＜0.05)。IFN-γ基因表達量在L6組第28天時最高，與L0組有顯著的差異(P＜0.05)。四個經(jīng)發(fā)酵液處理的組別中，TGFβ基因表達水平均隨時間的增加呈先上升后下降的趨勢，其中L5組在第14天時表達量達到最高值，與L0組有顯著差異(P＜0.05)。IL-1β基因的表達量在第21天時L5組表達量最高，顯著高于L0組(P＜0.05)。

在脾臟組織中，IL-10基因從第21天開始，L4組、L5組、L6組有了顯著的上升趨勢(P＜0.05)，其中在第28天時L5組的基因表達量最高(圖3)。TNF-α、IFN-γ的基因表達量均隨飼喂時間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，并在第35天時達到最高值，其中L5組的TNF-α和IFN-γ基因表達水平均最高，與L0組有顯著的差異(P＜0.05)。IFN-γ的基因表達水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈先上升后下降的趨勢，在濃度達到5%時表達量達到最高值，同時在第35天時L4組、L5組、L6組均顯著高于L0組(P＜0.05)，其中L5組表達量最高。4個發(fā)酵液處理組TGF-β的基因表達水平整體隨飼喂時間的增加呈先上升后下降的趨勢，均在第21天時達到最高，其中L5組的表達量最高并于L0組有顯著差異(P＜0.05)。與L0組相比，各組IL-1β基因表達水平隨飼喂時間的增加呈先上升后下降的趨勢，其中L5組表達量與L0組有顯著差異(P＜0.05)。

在中腎組織中，IL-10基因的表達量上升趨勢最為敏感，在第35天時4個發(fā)酵產(chǎn)物處理組均有顯著的提高(P＜0.05)，同時L5組IL-10基因的表達量最高(圖4)。TNF-α的基因表達水平均隨時間增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在第35天時L4組、L5組、L6組均有明顯的升高，均顯著的高于L0組(P＜0.05)，其中L6組TNF-α的水平最高。IFNγ基因的表達水平在整個飼喂時間中呈先升高后下降的趨勢，并從第21天開始L5組、L6組的表達量均有明顯上升，與L0組有顯著差異(P＜0.05)。TGF-β基因表達量在第21天時達到最高，其中L5組、L6組均和L0組有顯著差異(P＜0.05)。IL-1β基因在第21天時L6組與有顯著的上升(P＜0.05)，L5組在第28天時顯著的高于L0組(P＜0.05)，其他組別并無顯著升高趨勢(P＞0.05)。

圖4 不同發(fā)酵液對錦鯽中腎免疫炎癥因子的mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in mesonephridium of C. auratus

在全腸組織中，與對照組相比，發(fā)酵產(chǎn)物處理組IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的升高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，L5組表達量最高，顯著高于L0組(P＜0.05)；并且均在第21天有了顯著的升高，L5組均在第35天時達到最高值，但其中IL-10的水平升高最為敏感。TGF-β基因的表達水平在在整個飼喂時間內(nèi)呈先上升后下降的趨勢，L5組第21天時達到最高水平，與對照組有顯著的差異(P＜0.05)。IL-1β基因的表達水平隨著干酪乳桿菌菌液接種量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，L5組表達量最高，從第21天開始便顯著的高于L0組(P＜0.05(圖5)。

圖5 不同發(fā)酵液對錦鯽全腸免疫炎癥因子的mRNA表達水平的影響Fig. 5 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in intestine of C. auratus

2.3 攻毒實驗結(jié)果

攻毒實驗結(jié)果顯示，L0組在9 d內(nèi)全部死亡，并且腹部出現(xiàn)腫脹，體表出血，解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)多臟器出現(xiàn)出血或化為血水等現(xiàn)象(圖6)。L3組在13 d內(nèi)全部死亡，L5組的存活率相較于其他組而言最高，達到30%，L6和L4組存活率分別為20%和10%。

圖6 不同發(fā)酵液對錦鯽攻毒后存活率的影響Fig. 6 Effects of different fermentation products on survival rate of C. auratus after challenge

3 討論

3.1 不同發(fā)酵液對于錦鯽血清生化指標的影響

體液免疫指標對于魚生理和健康情況起著非常重要指示作用，反映了機體營養(yǎng)和環(huán)境的變化。AKP、IgM和LZM均在機體的非特異免疫防御中發(fā)揮著重要的作用，在機體受到病毒侵害時可迅速分泌從而起到抵御病原的作用[14]。AKP是一種胞外金屬酶類，可加快吞噬細胞的吞噬，提高水生動物機體免疫力[15]。IgM作為體液免疫重要組成部分，是介導體液免疫的重要效應分子，可與相應抗原特異性結(jié)合，發(fā)揮體液免疫功能。LZM是單核巨噬細胞的分泌酶，可水解細胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解，破壞侵入機體的有害細菌，從而幫助機體達到防御的目的[16]。有研究表明，乳酸菌作為飼料添加劑可以增加黏膜特異性免疫反應，從而提高機體血清中 LZM及IgM活性[17-18]。Mohammadian等[19]研究中還發(fā)現(xiàn)飼料中添加干酪乳桿菌可以使鯉(Cyprinus carpio)血清AKP和LZM活性升高。有學者發(fā)現(xiàn)，利用益生菌對于中藥進行發(fā)酵同樣可以提高鯉魚抗感染能力以及非特異性免疫能力[20]。本實驗選擇干酪乳桿菌對人參莖葉提取物進行發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物可以提高錦鯽血清中AKP、IgM、LZM活性，在干酪乳桿菌接種量為5%時活性達到最高值。進一步說明該發(fā)酵產(chǎn)物能夠激活鯽非特異性免疫應答，分泌免疫相關酶類。

氧化應激是水產(chǎn)動物發(fā)生疾病的主要原因之一， SOD、CAT和GSH-Px作為機體抗氧化酶，其活性的高低可以直接反映出機體的抗氧化水平[21]。SOD主要作用是將超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，從而降低氧化毒性，以阻止氧自由基對細胞造成傷害[22]。GSH-Px作為可以在機體分解的酶，可以催化GSH和H2O2的反應，將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整的作用[23]。CAT則可以將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，可以清除對機體有害的超氧自由基，降低機體氧化應激反應[24]。MDA是用于反映氧化損傷的典型參數(shù)，具有細胞毒性，會加劇細胞脂膜氧化，其含量的高低間接的反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[25]。有研究表明，魚類腸道定植的乳酸菌具有抗氧化活性，蔡紅丹等[26]在對點帶石斑魚(Epinephelus coioides)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加益生菌可以顯著的提高魚血清中SOD的活性。發(fā)酵人參莖葉在畜牧業(yè)的應用相對較多，牟柏德[27]在實驗中添加酵母菌混合菌種發(fā)酵人參莖葉藥渣，發(fā)現(xiàn)蛋雞產(chǎn)蛋的蛋黃中SOD和GSH-Px含量顯著高于對照組，MDA含量顯著低于對照組。李艷嬌等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加發(fā)酵人參莖葉的飼料可提高小鼠(Mus musculus)血清中SOD的含量，降低MDA的含量，說明發(fā)酵人參莖葉可對機體的抗氧化能力有所提高。這也證實了人參莖葉在發(fā)酵后其產(chǎn)物中所包含的活性物質(zhì)以及其藥理作用更為豐富。本研究結(jié)果顯示，在飼料中添加干酪乳桿菌發(fā)酵人參莖葉產(chǎn)物可提高錦鯽血清中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA的含量。呂戰(zhàn)旗等[29]研究發(fā)現(xiàn)，利用黃體菌發(fā)酵丹參可顯著提高丹參的抗氧化活性。屈青松等[30]研究發(fā)現(xiàn)，利用發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參，發(fā)酵產(chǎn)物中皂苷含量均有一定升高，可對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化，人參勻漿SOD 活性也較發(fā)酵前有所提高。在本研究也顯示發(fā)酵后的人參莖葉對于錦鯽機體抗氧化能力有一定的促進作用，猜測是發(fā)酵使人參莖葉中的皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化，稀有皂苷的含量升高，發(fā)酵產(chǎn)物中多物質(zhì)共同作用所致。因為技術(shù)手段的限制，本研究中未能對發(fā)酵前后的人參莖葉進行稀有皂苷的定量分析。

3.2 不同發(fā)酵液對于錦鯽免疫基因表達的影響

細胞因子具有調(diào)節(jié)先天性免疫、適應性免疫以及受損組織修復等作用，可迅速響應病原體感染和激活免疫細胞以應對細菌的攻擊[31]。IL-10作為機體的重要抗炎因子之一，具有促使B細胞增殖分化及抗體分泌的效應，是與免疫應答密切相關的調(diào)節(jié)因子[32]。IL-10和IFN-γ對于激活巨噬細胞活性和促進淋巴細胞增殖均具有調(diào)節(jié)作用，是天然免疫系統(tǒng)的重要刺激因子，常被用作免疫調(diào)節(jié)研究中的參考基因[33]。TNF-α能夠提高中性粒細胞的吞噬能力，誘導正常細胞增殖與分化，在機體受到病毒和細菌的侵襲時能增加抗感染作用[34]。IL-1β在機體損傷以及病原入侵時被活化，能夠獨立殺菌或誘導細胞凋亡，進而達到清除病原的功能[35]。TGF-β是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的活性多肽類物質(zhì), 對細胞的生長、分化和多種生理、病理過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[36]。本實驗中各組織IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-1β的表達水平均有不同程度升高，其中IL-10的表達水平升高更敏感。不同組織對于基因表達量響應的先后時間也有一定的不同，在本實驗條件下，全腸組織對于各基因的響應均較快速，除了IFNγ基因外，全腸組織中其他各基因的表達水平均在第14天時表現(xiàn)出顯著的上升(P＜0.05)。肝胰臟組織中對于IL-10水平的表達與其他組織相比更為快速，從第7天開始干酪乳桿菌菌液接種量較高的組別便表現(xiàn)出顯著的升高(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，人參莖葉發(fā)酵液對機體的免疫調(diào)節(jié)可能存在時空差異。中藥有效成分通常是經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化之后發(fā)揮腸道消炎的作用，但考慮到魚類個體腸道菌群的差異性以及腸道微生物的復雜性，通過益生菌體外發(fā)酵后服用效果會更好[37-38]。人參也具有調(diào)節(jié)腸道微生物的作用，與益生菌發(fā)酵可以促進益生菌的生長，抑制有害菌的生長[39]。Jang等[40]給予患有結(jié)腸炎的小鼠口服乳酸菌發(fā)酵紅參，發(fā)現(xiàn)其TNF-α以及相關炎癥基因的表達有升高，提高其藥效的同時可以防治腸道炎癥類疾病。魚類與畜禽類動物相比，消化道短，消化能力弱，腸道壁結(jié)構(gòu)薄且簡單，更容易受到損傷，所以對于魚類腸道的健康應該受到重視[41]。孔雨昕等[42]利用3種乳酸菌飼喂烏鱧 (Channa argus)發(fā)現(xiàn)其各組織中IL-1β、IL-10和TNF-α基因表達水平均有不同程度升高，在腸道組織中均有促進作用。Kong等[43]研究發(fā)現(xiàn)，重組干酪乳桿菌經(jīng)鯽口服后，鯽肝臟、脾臟、腎臟和腸中IL-10、IL-1β、IFN-γ和TNF-α水平在組織中顯著上調(diào)，提示重組干酪乳桿菌具有誘導細胞因子表達、增強先天免疫應答的能力，與本研究結(jié)果相似。王雨珊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參后可以提高其中Rg3和Rh2等稀有人參皂苷的含量，其中Rg3可顯著改善肝癌細胞SMMC-7721凋亡形態(tài)，Rh2可抑制肝臟纖維化，口服給藥可以緩解小鼠酒精性肝損傷，抑制肝胰臟炎癥反應。說明發(fā)酵后的人參可以對肝胰臟有一定的保護作用。對于益生菌發(fā)酵中藥在魚類養(yǎng)殖中對于免疫相關因子的作用機制還有待進一步探究。

3.3 不同發(fā)酵液對于錦鯽攻毒后存活率的影響

研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌是引起淡水魚類絕大多數(shù)細菌性疾病的病原菌，因此，采用嗜水氣單胞菌作為攻毒實驗的感染菌株，能較好地評價該發(fā)酵產(chǎn)物對于錦鯽抗病力的影響[44]。通過攻毒保護性實驗評價發(fā)酵產(chǎn)物的保護性，結(jié)果顯示，發(fā)酵產(chǎn)物處理的組別存活率高于對照組的存活率，其中L5組的存活率最高。表明干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對錦鯽具有保護作用，可以一定程度抵抗病原菌感染，當干酪乳桿菌的接種量為5%時發(fā)酵產(chǎn)物的保護效果最好。Harikrishnan等[44]在金魚(C. auratus)的研究中發(fā)現(xiàn)，在攝食中草藥后其對于嗜水氣單胞菌的抵抗能力有所升高，死亡率降低，證實了中草藥對于魚體的免疫保護作用。覃初斌[45]在研究干酪乳桿菌對斑馬魚(Danio rerio)抵御氣單胞菌感染的實驗中發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌可以顯著提高維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)攻毒后斑馬魚的存活率，說明益生菌作為飼料添加劑可以增強魚體的免疫，從而提高存活率。謝全喜等[46]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)發(fā)酵的中草藥后，能有效抵抗肉雞對于大腸桿菌(Escherichia coli)感染。Gu等[18]發(fā)現(xiàn)，利用乳酸桿菌發(fā)酵復方中藥的抑菌效果要比單獨使用中藥水提液或僅用益生菌的效果顯著，并可以顯著緩解大腸桿菌所引起的仔豬腹瀉，這也表明通過益生菌發(fā)酵中藥可以提高其抗菌抗病毒作用。本研究中，發(fā)酵液組對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的抗感染能力增強，推測由干酪乳桿菌、人參莖葉提取物中活性成分以及發(fā)酵所產(chǎn)生的新物質(zhì)共同作用所致。研究表明人，參莖葉皂苷即是免疫增強劑又是免疫調(diào)節(jié)劑，能明顯提高抗感染的能力[47]。田豐群等[48]發(fā)現(xiàn)，人參莖葉皂苷體內(nèi)治療可使感染后的創(chuàng)傷小鼠死亡率明顯降低，表明其可以促進創(chuàng)傷后細胞的免疫功能，進而增強機體對傷后感染的抵抗力。這也證實了人參莖葉對于機體的免疫保護作用具有一定的貢獻。

4 結(jié)論

綜上所述，利用干酪乳桿菌發(fā)酵人參莖葉，其發(fā)酵產(chǎn)物可以提升錦鯽抗氧化以及先天免疫應答的能力，并證實了該發(fā)酵產(chǎn)物可有助于魚體較好的預防并降低嗜水氣單胞菌的感染。本實驗條件下5%為最佳干酪乳桿菌接種量。有關益生菌發(fā)酵中藥的相互作用機理還需進一步挖掘。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）