草魚腸系膜脂肪沉積量的測(cè)定與分析

姜 鵬， 樊佳佳， 李勝杰， 杜金星， 雷彩霞

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種，年供應(yīng)量超過550萬t[1]，為滿足廣大民眾對(duì)優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的營養(yǎng)需求發(fā)揮著不可替代的作用。近年來，隨著高產(chǎn)高效集約化養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖草魚長(zhǎng)速加快，上市周期縮短，但也常出現(xiàn)體脂過度沉積現(xiàn)象[2]，導(dǎo)致魚體自身健康狀況及食用品質(zhì)下降等問題[3-5]。尤其腹腔內(nèi)的腸系膜脂肪組織，作為草魚貯存能量，蓄積脂肪的主要功能部位[6]，過度沉積不僅造成飼料資源的浪費(fèi)，也直接加劇肥胖體型，影響鮮活產(chǎn)品的銷售[7-8]。

針對(duì)上述產(chǎn)業(yè)問題，科研人員嘗試從營養(yǎng)與飼料、遺傳育種等多方面開展調(diào)控機(jī)理與應(yīng)用技術(shù)研究[2,9-11]。在研發(fā)過程中，通常涉及魚體腸系膜脂肪沉積量的測(cè)定與比較，用于量化評(píng)價(jià)調(diào)控方案實(shí)施效果及優(yōu)化技術(shù)參數(shù)。然而，草魚腹腔內(nèi)脂肪組織緊隨腸管附著延伸，而草食性魚類腸道細(xì)長(zhǎng)，盤旋回折多，導(dǎo)致該性狀難以直接計(jì)量。傳統(tǒng)方法是利用解剖刀等工具將黏連在腸壁周圍的脂肪組織進(jìn)行人工刮取剖離，再集中稱量分析。該方法雖然簡(jiǎn)單直接，但在實(shí)際操作時(shí)，易發(fā)生腸管破裂，使得腸道內(nèi)容物混雜其中而導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大誤差。尤其當(dāng)處理樣品數(shù)量較多或?qū)嶒?yàn)魚規(guī)格較小時(shí)，該方法存在耗時(shí)費(fèi)力，操作失誤率高，量化數(shù)據(jù)粗糙等問題。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬利用脂溶性染料油紅O可特異性著色脂肪的特性[12]，探索開發(fā)一種精確、便捷定量草魚腸系膜脂肪組織含量的新方法，以滿足研究實(shí)踐需要；同時(shí)對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)估度量性狀的基本特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)所用草魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)生物技術(shù)養(yǎng)殖基地。從正常飼養(yǎng)的養(yǎng)殖群體中隨機(jī)挑選健康個(gè)體，體重范圍約為75.0 ～ 95.0 g，數(shù)量200尾。所有實(shí)驗(yàn)魚均出自同一批水花苗種，并在同一個(gè)池塘進(jìn)行培育，以保證飼養(yǎng)環(huán)境條件的一致性。本研究獲得了中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守倫理規(guī)范，并按照中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

油紅O干粉購自Sigma-Aldrich公司；無水乙醇(分析純)購自天津市百世化工有限公司；多聚甲醛固定液(中性)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)Cytation-5)購自美國伯騰儀器有限公司；電子天平采用梅特勒托利多科技(中國)有限公司產(chǎn)品(精度∶1 mg；0.1 mg)。PIT電子芯片標(biāo)記購自安徽瑞佰創(chuàng)物聯(lián)科技有限公司。油紅O染液的配置是按比例將1.0 g油紅O干粉充分溶解于5.0 kg無水乙醇溶劑中，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后，密封備用。

1.3 性狀測(cè)量與樣品處理

麻醉后稱量草魚體重(BW)，并利用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)(BL)、軀干長(zhǎng)(TRL)、體高(BH)、尾柄高(CPH)和體寬(BWD)等體尺性狀，然后解剖取出整個(gè)內(nèi)臟團(tuán)(不含魚鰾、性腺)稱取重量(VW)，摘除膽囊器官；將PIT 電子芯片塞入魚腸道內(nèi)，記錄樣品編碼等信息，再把已標(biāo)記的內(nèi)臟團(tuán)樣品放入多聚甲醛固定液進(jìn)行集中保存。待全部樣品(內(nèi)臟團(tuán))采集完畢，統(tǒng)一固定6 h；然后將固定樣取出集中，加入適量無水乙醇試劑進(jìn)行快速脫水操作，試劑需浸沒全部樣品，時(shí)長(zhǎng)15 min；倒掉脫水廢液，樣品瀝干2 min后，加入提前配置好的油紅O染液進(jìn)行染色處理，染液需浸沒全部樣品，時(shí)長(zhǎng)9 min；倒掉染色廢液，終止染色，樣品瀝干2 min后，加入適量無水乙醇進(jìn)行快速漂洗，時(shí)長(zhǎng)30 s；倒掉漂洗廢液，樣品瀝干5 min后，將染色樣品分別放入提前備好的加蓋密封萃取瓶(含80.0 g無水乙醇試劑，其質(zhì)量計(jì)為we)，進(jìn)行28 h靜置萃??；當(dāng)萃取完畢，吸取1.6 ml萃取液至離心管，100000 r/min，離心1 min；再從中吸取200 μL上清液至酶標(biāo)板，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度OD值，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)遵守本實(shí)驗(yàn)室的物倫理規(guī)范。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱量25.0 mg (精確到0.1 mg，下同)油紅O固體粉末，充分溶解于約100.0 g的無水乙醇試劑中，配成油紅O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為250 μg/g的標(biāo)準(zhǔn)母液。定量吸取標(biāo)準(zhǔn)母液稀釋于無水乙醇溶劑中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5 μg/g(以油紅O質(zhì)量計(jì))的工作液，此標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于上述80.0 g萃取液中含有油紅O質(zhì)量分別為0、40、80、120、160、200、240、280、320、360、400和440 μg。工作液梯度范圍需包含所要檢測(cè)樣品萃取液的濃度極值。取200 μL各梯度工作液置于酶標(biāo)板，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以油紅O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

在本研究中，草魚個(gè)體腸系膜脂肪沉積量是以樣品吸附并萃取出的油紅O質(zhì)量來表示，計(jì)算公式∶wo= ω ×we，式中，ω為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的樣品萃取液油紅O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)；we為萃取所用無水乙醇的質(zhì)量(g)，本研究所有樣品的萃取液用量統(tǒng)一設(shè)置為80.0 g；wo為樣品萃取出的油紅O質(zhì)量(μg)。另外，為了進(jìn)一步判斷萃取量化結(jié)果的可靠性，隨機(jī)取少量萃取后內(nèi)臟團(tuán)樣品，將尚存的腸系膜組織剝離稱重，檢驗(yàn)其與傳統(tǒng)刮取法定量數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)程度。

使用SPSS 19.0軟件對(duì)觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、Pearson相關(guān)分析、系統(tǒng)聚類以及多元逐步回歸分析。其中，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)正態(tài)性。采用R型聚類對(duì)觀測(cè)變量進(jìn)行分析，聚類方法選擇最遠(yuǎn)鄰元素法結(jié)合Pearson相關(guān)性。多元回歸分析采用雙向逐步回歸方法，設(shè)定自變量引入或剔出方程的概率值分別為0.05和0.10。

2 結(jié)果

2.1 樣品的染色與萃取效果

草魚內(nèi)臟團(tuán)解剖、固定、脫水、染色等操作對(duì)腸系膜脂肪組織的結(jié)構(gòu)完整性影響較小，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)物質(zhì)得到較好保留。如圖版-5所示，內(nèi)臟團(tuán)樣品經(jīng)9 min定時(shí)浸染，油紅O染料可對(duì)草魚腸系膜脂肪組織特異性、均一化染色，染料滲透性強(qiáng)，勻染性好；脂肪組織得以充分著色，而腸道、肝胰臟等臟器組織則著色輕微。從圖版-6可見，染色樣品經(jīng)無水乙醇萃取后，吸附在脂肪組織內(nèi)的油紅O染料被完全抽提。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用油紅O脂溶性染料的固有特性，可實(shí)現(xiàn)草魚腸系膜脂肪組織的定向充分染色；良好的抽提效果則為后續(xù)精確定量提供了必要條件。

圖版 草魚腸系膜脂肪組織的油紅O染色與萃取效果1. 草魚解剖；2. 內(nèi)臟團(tuán)初始樣品；3. 樣品固定；4. 樣品脫水；5. 樣品油紅O染色；6. 萃取后樣品；a. 腸系膜脂肪組織；b. 腸；c. 肝胰臟。Plate Oil red O staining and extraction of mesenteric adipose tissue of C. idella1. dissected C. idella; 2. original visceral mass; 3. sample fixation; 4. sample dehydration; 5. oil red O staining; 6. Sample after extraction; a. Mesenteric adipose tissue. b. Intestine; c. Hepatopancreas.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過酶標(biāo)儀測(cè)定12個(gè)不同濃度油紅O標(biāo)準(zhǔn)液在510 nm波長(zhǎng)下吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示，油紅O濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))與吸光度值之間呈現(xiàn)近乎直線的線性關(guān)系，求得擬合回歸方程∶y= 0.0276x+ 0.0403,R2= 0.9997。當(dāng)油紅O質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0 ～ 5.5 μg/g范圍內(nèi)時(shí)，可以依據(jù)此方程進(jìn)行樣品定量分析。

圖1 油紅O的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of oil red O

2.3 腸系膜脂肪沉積量的測(cè)定

依據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將萃取液吸光度值換算為油紅O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)；在已知萃取液質(zhì)量(80.0 g)的前提下，通過簡(jiǎn)單的乘法運(yùn)算即可獲得溶液中油紅O的質(zhì)量。由整個(gè)操作流程可知，萃取的油紅O源于樣品起始階段所吸附的油紅O，而吸附量與樣品腸脂組織總量密切相關(guān)，因此，腸系膜脂肪沉積量可由萃取出的油紅O質(zhì)量來表示。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)油紅O萃取法，將20尾個(gè)體萃取后樣品的腸脂組織直接刮取稱量，與萃取量化結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。由圖2散點(diǎn)圖可知，傳統(tǒng)刮取稱重與萃取量化數(shù)據(jù)具有較高的相關(guān)性(r=0.80，P＜ 0.01)，這也一定程度表明本研究染色-萃取測(cè)定方法的可靠性。

2.4 度量性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

對(duì)采集的200尾草魚性狀表型值進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。在度量的8個(gè)數(shù)量性狀中，體重、內(nèi)臟質(zhì)量和腸系膜脂肪沉積量的變異系數(shù)(8.93% ～ 24.49%)整體要高于體長(zhǎng)等體尺性狀(3.17% ～ 4.25%)。尤其是，在體重變異系數(shù)為8.93%的草魚群體中，腸系膜脂沉積量的變異系數(shù)達(dá)到24.49%，表明該性狀具有豐富變異特征及遺傳改良潛力。另外，所有性狀表型值經(jīng)過K-S檢測(cè)，P值均大于0.05顯著性水平，表明符合正態(tài)分布。

表1 草魚8個(gè)數(shù)量性狀的描述性統(tǒng)計(jì)(n=200)Tab. 1 Descriptive statistics of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

2.5 相關(guān)與聚類分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，體重與觀測(cè)的各體尺性狀間呈高度正相關(guān)(r= 0.73 ～ 0.92，P＜0.01)，其中與體長(zhǎng)相關(guān)性最高；內(nèi)臟質(zhì)量與各體尺性狀呈中等正相關(guān)(r= 0.51 ～ 0.70，P＜ 0.01)，其中與體高相關(guān)性最高；腸系膜脂肪沉積量則與各體尺性狀呈低度正相關(guān)(r= 0.33 ～ 0.42，P＜0.01)(表2)。上述各性狀間的相關(guān)關(guān)系反映出草魚的形態(tài)學(xué)特征。此外，在腸系膜脂肪沉積量與其他各性狀間，腸系膜脂肪沉積量與內(nèi)臟質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)最大(r= 0.60，P＜ 0.01)。

表2 草魚8個(gè)數(shù)量性狀的相關(guān)分析(n=200)Tab. 2 Correlation analysis of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

R型變量聚類更為直觀的展現(xiàn)各觀測(cè)性狀間的關(guān)系結(jié)構(gòu) (圖3)。其中，腸系膜脂肪沉積量與內(nèi)臟質(zhì)量單獨(dú)聚為一支，反映了二者緊密聯(lián)系，說明采用新方法獲得的腸系膜脂肪量化數(shù)據(jù)屬于臟器關(guān)聯(lián)指標(biāo)，同實(shí)際情況相符。

圖3 草魚8個(gè)數(shù)量性狀的R型聚類圖Fig. 3 Dendrogram of R-cluster analysis of 8 quantitative traits in C. idella

2.6 逐步回歸分析

以腸系膜脂肪沉積量為因變量，以體重、體長(zhǎng)等6個(gè)形態(tài)指標(biāo)為自變量，開展多元逐步回歸分析(表3)。結(jié)果顯示，只有體高、體寬2個(gè)顯著性自變量得以保留，剩余指標(biāo)變量因無顯著性而被剔除，但建立的二元回歸方程決定系數(shù)R2僅有0.20，意味著簡(jiǎn)單易測(cè)的形態(tài)指標(biāo)只能解釋腸系膜脂肪沉積量變異的20%，表明基于形態(tài)指標(biāo)的回歸模型預(yù)測(cè)腸系膜脂肪沉積量的效果不佳。

表3 草魚腸系膜脂肪沉積量與各形態(tài)指標(biāo)的逐步回歸分析(n = 200)Tab. 3 Stepwise regression analysis between mesenteric fat weight and various morphological indexes in C. idella (n = 200)

3 討論

3.1 油紅O染料的特性與應(yīng)用研究

油紅O是一種脂溶性偶氮染料，可高度溶解于脂類物質(zhì)，并能夠使其特異性著色，因此常被用于細(xì)胞內(nèi)脂滴的定位與指示變化，涉及冰凍組織切片[13]、細(xì)胞鑒定[14-15]、大體染色[16-17]等技術(shù)內(nèi)容，用以揭示脂質(zhì)代謝與機(jī)體生理、病理過程的聯(lián)系。本研究利用油紅O有色溶液可量化的另一特性[18]，基于朗伯-比爾定律，通過萃取液吸光度檢測(cè)，首次將其拓展應(yīng)用于魚類腸系膜脂肪沉積量的定量分析。

3.2 染色-萃取定量方法的操作要點(diǎn)

與傳統(tǒng)刮取稱量方法相比，本研究開發(fā)的草魚腸系膜脂肪定量方法，具有取樣完整，操作便捷，量化精準(zhǔn)的特點(diǎn)，尤其適用于批量、小規(guī)格實(shí)驗(yàn)魚采樣需求。簡(jiǎn)要操作流程∶魚體麻醉解剖、內(nèi)臟團(tuán)采集、個(gè)體標(biāo)記、樣品固定、脫水、染色、漂洗、萃取和定量分析。具體實(shí)施步驟中，需要說明的∶(1)內(nèi)臟團(tuán)中膽囊的摘除，是防止有色膽汁可能對(duì)染色過程、萃取液吸光度檢測(cè)造成干擾。(2)實(shí)施芯片標(biāo)記操作，不僅用于識(shí)別區(qū)分個(gè)體，也為后續(xù)共同染色提供必要條件，以達(dá)到樣品處理時(shí)間、處理環(huán)境的一致性。(3)實(shí)施組織固定操作，主要是防止取樣時(shí)間較長(zhǎng)引發(fā)的組織自溶，避免細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流失，為大批量采樣提供寬松的時(shí)間。(4)染色前實(shí)施脫水操作，是先期讓樣品快速大幅脫水，顯著緩解后續(xù)無水乙醇操作環(huán)境中樣品自行脫水可能引起的干擾。(5)選擇無水乙醇作為染色、萃取過程的溶劑，主要是乙醇與油紅O具有良好的相溶性，而且乙醇相比其他醇類易于獲得，價(jià)格低廉、低毒性、刺鼻氣味輕微。(6)實(shí)施漂洗步驟，是去除樣品表面殘留的工作液，防止殘液影響定量分析。(7)通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將測(cè)定的萃取液吸光度值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的油紅O濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，而擬合的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線決定系數(shù)R2達(dá)到0.9997，充分表明樣品檢測(cè)過程可靠，量化數(shù)據(jù)精準(zhǔn)。(8)該定量方法可拓展應(yīng)用于不同規(guī)格實(shí)驗(yàn)草魚或其他魚類，而樣品染色時(shí)間、萃取乙醇用量等參數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制也應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況作出相應(yīng)調(diào)整。例如，樣品染色時(shí)間，既要保證魚體脂肪組織獲得充分染色，又要防止染色時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致非脂肪組織被動(dòng)著色問題；萃取乙醇用量則以能夠?qū)⑷緲永锏挠图tO萃取完全為準(zhǔn)。

在本研究中，草魚個(gè)體腸系膜脂肪沉積量是以樣品吸附并萃取出的油紅O質(zhì)量來表示。由于所有草魚測(cè)試樣品是在同一環(huán)境條件下處理，染液濃度、染色時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)一致，所以測(cè)定結(jié)果能夠較為精準(zhǔn)的展示出樣品間脂質(zhì)沉積的差異程度。需要說明的是，雖然染色-萃取量化結(jié)果與傳統(tǒng)刮取稱重保持了較好的相關(guān)性，但新測(cè)定方法屬于相對(duì)定量范疇，所獲數(shù)據(jù)代表個(gè)體腸系膜脂肪沉積的相對(duì)含量，僅適用于同批次或相同處理?xiàng)l件下樣品的比較分析。

3.3 草魚腸系膜脂肪沉積量的特征

采集同一養(yǎng)殖環(huán)境的200尾草魚性狀表型值，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，利用染色-萃取方法測(cè)量草魚腸系膜脂肪沉積量范圍為92.66 ～ 318.07 μg，變異系數(shù)達(dá)到24.49%，對(duì)比體重等其他表型性狀3.17% ～8.93%的變異系數(shù)，顯示出較為豐富的變異特征，為遺傳改良奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)際上有文獻(xiàn)顯示，采用傳統(tǒng)刮取定量方法，在體重變異系數(shù)10.13%的商品規(guī)格草魚群體中，腸系膜脂肪性狀的變異系數(shù)也達(dá)到21.30%，同樣預(yù)示草魚體脂性狀具有較大選育潛力[2]。

進(jìn)一步的相關(guān)與聚類分析表明，腸系膜脂肪沉積量與內(nèi)臟質(zhì)量相關(guān)性最高，并且聚為一類，符合預(yù)期的臟器關(guān)聯(lián)因子，但與各體尺性狀的相關(guān)性較低，而且多元線性回歸分析顯示，簡(jiǎn)單易測(cè)的表型指標(biāo)對(duì)腸系膜脂肪沉積量的變異解釋程度較低，說明通過間接預(yù)測(cè)途徑獲取性狀表型值的可信度不高，這也意味著該性狀的精確測(cè)量可能無法避免宰殺活體。另一方面，雖然有研究報(bào)道腹腔內(nèi)脂肪組織可以實(shí)現(xiàn)無損定量檢測(cè)，如核磁共振成像技術(shù)對(duì)魚類脂肪組織的可視化研究[19]，但該技術(shù)依賴昂貴的大型儀器以及較復(fù)雜的軟件程序，限制了其應(yīng)用范圍。

綜上所述，本研究利用脂溶性染料油紅O可特異性著色脂肪的特性，開發(fā)出一種精確、便捷定量草魚腸系膜脂肪組織含量的新方法?；诓僮鞑襟E論述及采樣數(shù)據(jù)分析，顯示出本定量方法的可靠性及適用范圍，也為草魚體脂性狀改良提供了技術(shù)參考。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）