嗜黏蛋白阿克曼菌對鯉糖代謝的調(diào)控機制

王亞娓， 黃真屹， 楊博雅， 游 富， 張新黨,2，楊國坤,2， 常緒路,2， 馮世坤,2， 孟曉林,2*

(1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2. 河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007)

近年來，隨著水產(chǎn)品的需求量不斷增加，優(yōu)質(zhì)蛋白資源短缺已成為限制水產(chǎn)養(yǎng)殖快速發(fā)展的因素[1]。因此，尋找新型蛋白源或使用低廉的非蛋白質(zhì)能量物質(zhì)是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的焦點之一[2]。糖類作為三大能源物質(zhì)之一，價格低廉、來源廣泛，研究表明，在飼料中添加糖類不僅可以滿足機體的能量需求，還能夠發(fā)揮“蛋白質(zhì)節(jié)約”效應(yīng)[3]。有關(guān)糖類在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用早在20世紀(jì)40—50年代就有跡可循，研究發(fā)現(xiàn)，糖類在魚體內(nèi)作為能源物質(zhì)能夠促進(jìn)機體生長發(fā)育，提高魚類的生長效率和蛋白質(zhì)效率[4]。除此之外，在飼料中添加適宜水平的糖類一方面能夠改善飼料的物理性狀，降低飼料成本，另一方面可以進(jìn)行生物氧化產(chǎn)生ATP，有利于機體活化氨基酸，減輕氮排泄造成的養(yǎng)殖水體污染。然而，與哺乳動物相比，魚類對糖類的耐受能力較低，被認(rèn)為是天然的“糖尿病患者”[5]，飼料中添加的糖水平過高會導(dǎo)致魚類發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，降低飼料利用率，葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性下降，血糖水平持續(xù)偏高，且高糖還會導(dǎo)致肝臟腫大、糖原累積，影響魚類正常肝功能[6]。此外，高糖飼料還會改變魚類腸道內(nèi)微生物的菌群組成與結(jié)構(gòu)，造成腸道菌群失調(diào)，從而導(dǎo)致魚類代謝紊亂[7]，有研究分別用含0%、10%、20%、30%和40%糊精的飼料飼喂鯉(Cyprinus carpio)、真鯛 (Pagrus major)、鰤(Seriola) 30 d，發(fā)現(xiàn)當(dāng)糊精水平達(dá)到40%時鯉的生長才受到影響[8]。

研究表明，腸道菌群可通過多種作用機制調(diào)控魚類糖代謝，包括調(diào)節(jié)膽汁酸代謝[9]、產(chǎn)生腸源性短鏈脂肪酸(SCFAs)[10]、促進(jìn)脂多糖(LPS)或肽聚糖的產(chǎn)生[11]等。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，Akk)作為二代益生菌，于2004年首次從人體糞便中分離出來，研究發(fā)現(xiàn)，Akk能夠促進(jìn)機體腸道屏障完整性[12]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[13]、抑制腸道炎癥[14]、減輕肥胖以及防治胰島素抵抗、總膽固醇升高和脂肪組織儲存[15]等代謝性疾病。此外，相對于正常群體，處于糖尿病前期的病人或Ⅰ型糖尿病小鼠(Mus musculus)體內(nèi)Akk豐度顯著降低，表明Akk與糖尿病之間存在聯(lián)系[16-17]。在哺乳動物中，Akk代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合后促進(jìn)腸道L細(xì)胞分泌GLP-1調(diào)控機體糖代謝[18]。人體實驗探究Akk作為補充劑的安全性及相關(guān)參數(shù)(即胰島素抵抗、循環(huán)脂質(zhì)、內(nèi)臟肥胖和體重)，證實Akk的安全性及耐受性[19]。由于Akk是嚴(yán)格厭氧菌，限制了其在水產(chǎn)中的應(yīng)用，巴氏滅活的Akk是安全使用的有效方式之一，研究發(fā)現(xiàn)，Akk產(chǎn)生的有益效果不會隨著巴氏滅活而減少，即巴氏滅活的Akk同樣能夠降低胰島素抵抗，改善血脂異常，且效果相對于活菌更加顯著[20]。綜上所述，目前關(guān)于Akk作用的研究多聚焦在血糖平衡、脂肪堆積、腸道通透性和體重等方面，且大多局限于人類及哺乳動物，有關(guān)Akk在魚類糖代謝調(diào)控中的具體作用機制目前尚不清楚。

因此，本實驗以鯉為研究對象，探究Akk及GLP-1對飼料中不同糖水平的時空響應(yīng)及其反饋調(diào)節(jié)，闡明P-Akk介導(dǎo)GLP-1調(diào)控鯉葡萄糖代謝的分子作用機制。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識腸道益生菌Akk在鯉糖代謝調(diào)控過程中的作用，從腸道菌群-內(nèi)分泌激素軸的角度完善雜食性魚類糖代謝的內(nèi)分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為Akk應(yīng)用于飼料添加劑奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料及養(yǎng)殖管理

不同葡萄糖水平實驗(實驗1) 以酪蛋白和明膠作為蛋白源，魚油和豆油作為脂肪源，分別添加20%、30%、40%、50%的葡萄糖，共配制4種飼料，飼料配方見表1。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)%)Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets ( dry matter %)

配制飼料前，所有原料必需經(jīng)過粉碎機粉碎，且全部過60目篩。將所有粉碎好的飼料原料按配方混勻后加入魚油和豆油，手工將油脂微粒搓散、混勻，最后再加入適宜蒸餾水使粉狀飼料成團(tuán)，用飼料顆粒機制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后置于?20 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗鯉購買自延津縣漁場(新鄉(xiāng)，河南)。實驗開始前禁食24 h，選擇初始體重為(10.5±1.0) g、體格健壯的鯉幼苗360尾，隨機分為4組∶C組(20%葡萄糖)、L組(30%葡萄糖)、M組(40%葡萄糖)、H組(50%葡萄糖)，每組3個養(yǎng)殖桶，每桶30尾，養(yǎng)殖實驗在河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地進(jìn)行，養(yǎng)殖期間每3天換水量為總體積的1/3，光照∶黑暗=1∶1，水溫維持在(25±1) °C，pH為6.5～7.8，每日3次定時、定量(體重的3%)投喂。

在養(yǎng)殖4周(4W)、8周(8W)時分別進(jìn)行取樣，取血清、腸道和腸道內(nèi)容物置于離心管中，－80 °C冰箱保存。本研究獲得了河南師范大學(xué)實驗動物管理和使用倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中操作人員嚴(yán)格遵守倫理規(guī)范，并按照河南師范大學(xué)倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

添加P-Akk實驗(實驗2) Akk的培養(yǎng)。嗜黏蛋白阿克曼菌購自德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)DSM 22959。首先配制BHI黏蛋白培養(yǎng)基，用99.999%的氮氣除氧，121 °C滅菌30 min，放入?yún)捬跸渲欣鋮s備用，將Akk接種在厭氧培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度為37 °C，厭氧培養(yǎng)36 h，通過稀釋涂布平板法計算活菌數(shù)，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，以平板計數(shù)濃度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)曲。P-Akk∶Akk在70 °C滅菌30 min。

根據(jù)實驗1的結(jié)果，將葡萄糖添加水平為40%組作為基礎(chǔ)飼料，選擇大小為(16.78±0.39) g、體格健壯的黃河鯉240尾，隨機分為NC組(40%葡萄糖)、LP組(40%葡萄糖+108CFU/g P-Akk)、MP組(40%葡萄糖+109CFU/g P-Akk)、HP組(40%葡萄糖+1010CFU/g P-Akk)組，每組3個重復(fù)，每桶20尾，養(yǎng)殖4周。接種Akk，測OD值，計算每天添加到飼料中3個濃度P-Akk所需的量，每次投喂前1 h，對P-Akk進(jìn)行離心，無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸后噴灑至基礎(chǔ)飼料上，晾干后進(jìn)行飼喂，養(yǎng)殖實驗管理同實驗1。

1.2 樣品采集

不同葡萄糖水平實驗開展4 W時，每桶隨機選4尾鯉，每組總共12尾鯉用MS-222麻醉，測定其體長、體高、體寬和終末重量，其后尾靜脈取血置于2 mL離心管中，室溫靜置4 h后7500×g離心10 min，將血清分裝后于?20 °C保藏備用。解剖分離內(nèi)臟團(tuán)，取出腸道用PBS沖洗干凈，剪取1 cm左右前腸分別放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，另取腸道內(nèi)容物、肝臟和腸道(前腸、中腸)置于離心管中，?80 °C保存；剩余的魚繼續(xù)養(yǎng)殖，第8 W時按照上述操作取樣。添加PAkk實驗開展4 W取樣操作亦同上。

1.3 生長指標(biāo)測定

在養(yǎng)殖8 W后，每組選取12尾鯉測量體重、體長、內(nèi)臟團(tuán)及肝臟的重量，以此計算如下生長指標(biāo)∶

存活率(SR，%)=(終末魚數(shù)/初始魚數(shù))×100%；

增重率(WGR，%)=(末重?初重)/初重×100%；

特定生長率(SGR，%)=Ln(末重/初重)/天×100%；

飼料系數(shù)(FCR，%)=總飼料消耗量/(終末總重?初始總重)×100%；

肝體比(HIS，%)=(肝臟重/全魚重)×100%；

臟體比(VSI，%)=(內(nèi)臟重/全魚重)×100%；

肥滿度(CF，g/cm3)=(體重/體長3)×100。

1.4 腸道組織形態(tài)分析

將腸道組織進(jìn)行脫水、透明之后用自動包埋機進(jìn)行包埋，使用切片機進(jìn)行切片，厚度為7 μm。按照試劑盒說明書染色，封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察腸道絨毛高度及肌層厚度。

將腸道組織從戊二醛溶液中取出，使用乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，加入叔丁醇沒過組織，4 °C放置至叔丁醇凝固，真空干燥，噴金處理后在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.5 GLP-1含量測定

將GLP-1a、GLP-1b蛋白用CBS梯度稀釋后4 °C過夜，加入封閉液37 °C孵育2 h；PBST清洗5次，拍干后分別加入GLP-1a、GLP-1b抗體稀釋液，37 °C放置2 h；PBST清洗后拍干，加入抗體稀釋液于37 °C放置1 h；用PBST清洗5次后拍干，TMB顯色后37 °C放置30 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將血清或者腸道蛋白用CBS進(jìn)行稀釋，其余操作同上。

1.6 糖代謝相關(guān)基因的檢測

將收集好的樣品加入TRIzol后進(jìn)行破碎，并按照試劑盒說明書提取肝臟、腸道組織RNA，提取的RNA調(diào)節(jié)好濃度后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA作為模板，18SrRNA基因作為內(nèi)參進(jìn)行實時熒光定量PCR。所用引物如表2所示，用公式2?△△CT計算基因的mRNA相對表達(dá)水平。

表2 實時熒光定量PCR引物Tab. 2 Real-time PCR primers

1.7 腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸及Akk豐度檢測

短鏈脂肪酸(SCFAs)的檢測 稱取腸道內(nèi)容物置于離心管中，加入飽和氯化鈉溶液混合均勻，酸化后用渦旋儀處理使樣品充分溶解，加入乙醚振蕩30 s，4 °C、12000 r/min離心10 min，取上清液，加入無水硫酸鈉，振蕩30 s后4 °C、4500 r/min離心3 min，用0.22 μm濾膜過濾后將樣品加入到進(jìn)樣瓶中，使用氣相色譜儀檢測腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量。

Akk定量分析 Akk厭氧培養(yǎng)36 h后使用稀釋涂布平板法計算活菌數(shù)。根據(jù)已有研究[21]確定Akk引物序列如表3，并驗證其具有特異性。通過構(gòu)建含Akk 16SrRNA部分片段的重組質(zhì)粒，確定Akk實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp，德國)說明書提取鯉腸道內(nèi)容物DNA，檢測DNA濃度后－80 °C冰箱保存。根據(jù)預(yù)實驗確定每孔100 ng DNA的加樣量，按照反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定Akk豐度。

表3 不同糖水平飼喂對鯉生長指標(biāo)的影響Tab. 3 Effects of different sugar levels on C. carpio growth indexes

1.8 原代肝臟、腸細(xì)胞孵育實驗

將鯉麻醉后用75%乙醇擦拭魚體表面，冰上解剖后取出肝臟、腸道組織放入預(yù)冷的含有HBSS的50 mL離心管中，在超凈臺中將組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿，挑出血塊及結(jié)締組織并將其剪碎后反復(fù)沖洗3～4次。向30 mL HBSS中加入60 μL EDTA(0.5 mol/L)，輕搖2～3 min至肝臟組織蓬松。棄去上清液，使用HBSS清洗肝臟碎片，每次3 min，共3次。向30 mL HBSS中加入150 ng膠原酶Ⅳ和400 U Dnase Ⅱ(腸道組織用膠原酶Ⅰ、Ⅳ處理)，密封后于28 °C水浴鍋中均勻搖晃25 min。消化完畢后，用巴氏吸管反復(fù)吹打組織30～40次，使用細(xì)胞篩(200目)過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心后棄去上層HBSS。加入預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基，密封后離心。棄去上層液體，用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸細(xì)胞，取等量臺盼藍(lán)及細(xì)胞懸液進(jìn)行混合，于倒置顯微鏡下計算細(xì)胞數(shù)量，每孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種約105個細(xì)胞，28 °C生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第2天將培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基，1 h后進(jìn)行后續(xù)處理。

使用不同濃度的P-Akk (0、108、109、1010個/mL，分別記為P0、P8、P9、P10)孵育原代細(xì)胞(n=6)。1、3 h和6 h后吸棄培養(yǎng)基，更換為TRIzol或RIPA以便收集細(xì)胞裂解液，?80 °C冰箱保存直至提取RNA，方法同“糖代謝相關(guān)基因的檢測”。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗中所有數(shù)據(jù)均使用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行，組間差異的計算采用單因素方差分析(ANOVA)。相關(guān)基因的表達(dá)用2?△△CT方法計算。使用GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad Software Inc., 美國)作圖，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SEM)表示，P＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同糖水平對鯉生長性能的影響

不同葡萄糖水平飼喂8周后鯉的末重相對于C組均顯著升高，但各組間增重率、特定生長率及飼料轉(zhuǎn)化率無顯著性差異(P＞ 0.05)。與C組相比，L組、M組的肥滿度顯著升高，H組有升高的趨勢，但未達(dá)到顯著水平(P＞ 0.05)。高糖飼喂后鯉的肝體比、臟體比相對于C組有所增加，但僅在M組中達(dá)到顯著水平(P＜ 0.05)(表3)。

2.2 飼料中不同葡萄糖水平對GLP-1含量、Akk豐度的影響

與20%葡萄糖添加組相比，高糖飼料顯著降低鯉血清中GLP-1b含量，GLP-1a無顯著性變化(P＞ 0.05)。4W時，高糖飼料顯著降低鯉腸道中GLP-1a含量，GLP-1b在L組、M組顯著降低(P＜ 0.05)。8W時，L組中GLP-1a的含量顯著降低，GLP-1b在各組間無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖1)。

圖1 不同糖水平對鯉血清(a) (b)和腸道(c) (d)GLP-1含量的影響C. 20% 葡萄糖組，L. 30% 葡萄糖組，M. 40% 葡萄糖組，H. 50% 葡萄糖組，下同。Fig. 1 Effects of different glucose levels on GLP-1 content in serum (a) (b) and intestine( c) (d) of C. carpioC. 20% glucose group, L. 30% glucose, M. 40% glucose, H. 50% glucose, the same below.

隨著葡萄糖添加水平升高，4 W時腸道內(nèi)容物中Akk豐度逐漸降低，并在M組及H組達(dá)到顯著水平，但8 W后各組之間已無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖2)。

圖2 不同糖水平對鯉腸道內(nèi)容物中Akk豐度的影響Fig. 2 Effects of different glucose levels on the abundance of Akk in intestinal contents of C. carpio

2.3 P-Akk對鯉血清生化指標(biāo)及腸道組織形態(tài)的影響

添加P-Akk后檢測鯉血清中葡萄糖、TG、ALT及AST含量，結(jié)果顯示，相較于對照組，添加P-Akk后血清中葡萄糖濃度顯著降低(P＜ 0.05)，TG含量在LP組、MP組顯著降低(P＜ 0.05)，ALT、AST相較于NC組無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度P-Akk對鯉血清生化指標(biāo)的影響NC. 40%葡萄糖，LP. 40%葡萄糖+108 CFU/g P-Akk，MP. 40%葡萄糖+109 CFU/g P-Akk，HP. 40%葡萄糖+1010 CFU/g P-Akk，下同。Fig. 3 Effects of different P-Akk levels on serum biochemical indexes of Cyprinus carpioNC. 40% glucose, LP. 40% glucose + 108 CFU/g P-Akk, MP. 40% glucose + 109 CFU/g P-Akk, HP. 40% glucose + 1010 CFU/g P-Akk, the same below.

腸道組織掃描電鏡及AB-PAS染色結(jié)果顯示，絨毛上黏蛋白被染成紫色。NC組腸絨毛破裂，微絨毛稀釋，腸道損傷嚴(yán)重，添加P-Akk恢復(fù)高糖飼料誘導(dǎo)的腸道損傷，且MP組腸絨毛較為完整，破裂情況明顯減少，腸絨毛上黏蛋白大量增多；此外，LP組和HP組絨毛高度顯著高于NC組，MP組和HP組肌層厚度顯著變厚(P＜ 0.05)(圖4)。

圖4 不同濃度P-Akk對鯉前腸組織形態(tài)的影響(a) 1～4. 掃描電鏡觀察，5～8. AB-PAS染色；SH. 實驗損傷，V. 腸絨毛，M. 肌層。Fig. 4 Effects of different P-Akk levels on the intestine morphology of C. carpio(a) 1-4. scanning electron microscope observation; 5-8. AB-PAS staining; SH. experimental damage, V. villus, M. muscularis.

2.4 P-Akk對鯉GLP-1及糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

飼喂P-Akk后相較于對照組，鯉血清中GLP-1a無顯著性變化，GLP-1b含量顯著降低(P＜ 0.05)。P-Akk顯著降低腸道組織中GLP-1a、GLP-1b的含量(P＜ 0.05)。不同濃度的P-Akk處理原代腸細(xì)胞1 h后GLP-1a含量無顯著性差異，GLP-1b在P10組顯著降低(P＜ 0.05)。3 h后，GLP-1a、GLP-1b在P9組、P10組顯著降低(P＜ 0.05)。P-Akk處理6 h后，GLP-1a含量無顯著變化，GLP-1b含量相對于P0組顯著降低(P＜ 0.05)(圖5)。

P-Akk處理顯著升高pi3k的mRNA表達(dá)量，pfk、ampk1的mRNA表達(dá)水平在MP組顯著升高，gk的mRNA表達(dá)量在MP組、HP組顯著升高，pepckmRNA表達(dá)水平在MP組顯著降低(P＜ 0.05)(圖6)。

圖6 不同濃度P-Akk對鯉肝臟糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in liver of C. carpio1. gk, 2. pfk, 3. gys, 4. g6pase, 5. pepck, 6. pygl, 7. ampk1, 8. ampk2, 9. akt, 10. pi3k.

原代肝細(xì)胞孵育結(jié)果顯示，P-Akk處理后gk、pfk、gysmRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜ 0.05)。P-Akk處理3 h后，pi3k的mRNA表達(dá)量在高濃度組顯著升高，6 h時，ampk2在P8組、P9組顯著升高，其他基因無顯著變化(P＞ 0.05)(圖7)。

圖7 不同濃度P-Akk對鯉原代肝細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in primary hepatocytes cells of C. carpio(a) gk, (b) pfk, (c) pepck, (d) gys, (e) ampk1,(f) ampk2, (g) pi3k, (h) akt.

添加P-Akk后muc2 mRNA表達(dá)水平逐漸升高，并在MP組、HP組達(dá)到顯著水平(P＜ 0.05)。腸細(xì)胞孵育實驗結(jié)果顯示，P-Akk顯著升高黏蛋白muc2 mRNA表達(dá)水平，但6 h時各組間已無顯著差異(P＞ 0.05)(圖8)。

圖8 不同濃度P-Akk對鯉腸道(a)和腸細(xì)胞(b) muc2 mRNA表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of different P-Akk levels on the muc2 mRNA expression in intestine (a) and intestinal cells (b) of C. carpio

2.5 P-Akk對鯉SCFAs及其受體的影響

P-Akk處理后腸道內(nèi)容物中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸及總SCFAs含量相較于對照組都升高，并在MP組達(dá)到顯著水平(P＜0.05)(圖9)。

圖9 不同濃度P-Akk對鯉腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量的影響Fig. 9 Effects of different P-Akk levels on the content of short chain fatty acids in the intestine of C. carpio

添加P-Akk后相較對照組，gpr40的mRNA表達(dá)量升高，其中g(shù)32在MP組、HP組顯著升高，g34、g48-1、g48-4的mRNA表達(dá)量在MP組顯著升高(P＜ 0.05)。原代腸細(xì)胞再次證明P-Akk顯著升高g34、g48-1、g13的mRNA表達(dá)水平(P＜ 0.05)(圖10)。

圖10 不同濃度P-Akk對鯉腸道(a)和腸細(xì)胞(b) (c) (d) (e)gpr40 mRNA表達(dá)的影響Fig. 10 Effects of different P-Akk levels on the gpr40 mRNA expression in the intestine (a) and intestinal cells (b) (c) (d) (e) of C. carpio(a) 1. gpr40-g32, 2. gpr40-g34, 3. gpr40-g48-1, 4. gpr40-g48-4; (b) gpr40-g31; (c) gpr40-g34; (d) gpr40-g48-1; (e) gpr40-g13-1.

3 討論

碳水化合物作為自然界常見的能源物質(zhì)添加到飼料中可以起到節(jié)約蛋白質(zhì)、降低成本的作用，但不同環(huán)境、食性的魚類對碳水化合物的利用能力不同，飼料中糖類過高或過低均會導(dǎo)致腸道菌群紊亂，對魚體產(chǎn)生不利影響，如降低生長性能[22]、誘導(dǎo)肝臟和腸道損傷等。鯉作為雜食性魚類對糖類物質(zhì)的耐受能力相對于其他食性的魚類較高，但是這種能力不足以使鯉完全消化飼料中的糖類物質(zhì)。攝入高糖后魚體血糖含量隨飼料中糖水平的升高而持續(xù)上升[23]，誘導(dǎo)肝臟、腸道損傷，腸道菌群紊亂[24]，長期高糖毒性使得活性氧及炎性介質(zhì)增加，進(jìn)而損傷腸道L細(xì)胞，導(dǎo)致GLP-1分泌缺陷，具體表現(xiàn)為GLP-1分泌減少、腸道炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)、胰島素抵抗等[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖飼料顯著增加鯉的末重、肝體比、臟體比和肥滿度，且40%的葡萄糖添加組效果較為顯著，與大黃魚(Larimichthys crocea)和點帶石斑魚(Epinephelus coioides)的研究結(jié)果類似[26]。此外，隨著葡萄糖添加水平升高，血清及腸道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，表明高糖飼料抑制腸道組織中GLP-1分泌，推測GLP-1具有升血糖的作用，但具體作用機制尚不清楚。

腸道微生物與宿主之間相互影響，具有營養(yǎng)、防御和免疫調(diào)節(jié)等生理功能，能夠促進(jìn)機體生長發(fā)育[27]。Akk作為二代益生菌，其豐度與機體代謝疾病相關(guān)，在各種肥胖或其他代謝紊亂的小鼠模型中顯著減少，具體表現(xiàn)為瘦素缺陷型[18]、高脂飼料飼喂[28]、T2DM小鼠等，添加Akk或巴氏滅活的Akk能夠改善肥胖、胰島素抵抗、肝臟脂肪變性等代謝綜合征[15]，調(diào)節(jié)高脂、高糖飲食引起的代謝紊亂，且109CFU/mL的Akk滅活后效果相對更好[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖飼料顯著降低鯉腸道內(nèi)容物中厭氧菌Akk豐度，用P-Akk處理后鯉血清中葡萄糖、TG含量顯著降低，肝臟糖酵解基因mRNA表達(dá)水平顯著升高、糖異生基因mRNA表達(dá)量顯著降低，表明P-Akk通過調(diào)控糖代謝相關(guān)酶活力及基因表達(dá)調(diào)控機體糖代謝過程，降低血糖含量，即P-Akk同Akk一樣能夠調(diào)節(jié)糖、脂代謝，緩解高糖飼料引起的代謝紊亂[31]。Dan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，腸絨毛密度、高度和肌層厚度對增加食糜接觸面積、促進(jìn)消化吸收至關(guān)重要，隨飼料中碳水化合物水平的升高而降低，目前，關(guān)于不同糖類及糖水平對魚類腸道健康的影響已有報道，對高體大鱗鲆(Tarphops oligolepis)的研究發(fā)現(xiàn)，添加適宜水平的水蘇糖使得遠(yuǎn)端小腸褶皺增多，絨毛高度增加，表明適宜的水蘇糖促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，維護(hù)腸道健康[33]。腸道組織形態(tài)觀察結(jié)果顯示高糖飼料導(dǎo)致鯉腸絨毛破裂，微絨毛稀疏，肌層厚度顯著變薄，表明高糖飼料破壞鯉腸道黏膜屏障，降低腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，導(dǎo)致腸道損傷，而P-Akk處理后腸絨毛高度和肌層厚度顯著增加，腸道損傷情況明顯改善，表明P-Akk緩解高糖飼料誘導(dǎo)的腸道損傷，促進(jìn)糖類物質(zhì)消化吸收。腸絨毛之間分布大量杯狀細(xì)胞，能夠合成并分泌黏蛋白，使黏液層增厚，增強腸道屏障功能，保護(hù)腸道健康[34]。黏蛋白具有聚糖、結(jié)合水的能力，能夠孵育黏液保持潮濕和潤滑，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免于脫水和機械應(yīng)力，形成腸道黏膜保護(hù)屏障[35]。同時，黏蛋白還能夠為Akk等細(xì)菌的生長供能，促使其在腸道中定植。Akk是一種能夠分解利用黏蛋白作為營養(yǎng)物質(zhì)的黏液降解菌，Akk分解黏蛋白產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，又可以誘導(dǎo)黏蛋白的分泌[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，P-Akk處理后黏蛋白數(shù)量增多，muc2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，SCFAs含量增加，gpr40 mRNA表達(dá)量升高，推測P-Akk促進(jìn)包括Akk在內(nèi)的產(chǎn)SCFAs菌在腸道中的定植，且109CFU/g效果較為顯著。

Akk代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，進(jìn)而通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPR)影響腸道上皮L細(xì)胞分泌GLP-1，GLP-1是一種強效腸促激素，能夠調(diào)控胰島β細(xì)胞分泌胰島素，在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[37]。哺乳動物和硬骨魚類由不同的代謝途徑調(diào)控，其中幾種主要激素的功能存在差異，尤其是胰島素和GLP-1[38]。在哺乳動物中，GLP-1通過抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素，同時刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，以達(dá)到降低血糖的目的[39]。在魚類中，GLP-1對葡萄糖的調(diào)控作用類似胰高血糖素，促進(jìn)糖質(zhì)新生和肝糖原降解[40]，升高血糖含量。本研究發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖添加水平升高，血清及腸道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，GLP-1a、GLP-1b與受體結(jié)合后激活A(yù)MPK、PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶活力及基因表達(dá)，促進(jìn)肝臟糖異生、抑制糖酵解，升高鯉血糖含量。養(yǎng)殖實驗及細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)PAkk處理后GLP-1a、GLP-1b含量減少，同時伴隨血糖含量的降低，結(jié)合糖代謝基因檢測結(jié)果，推測P-Akk影響GLP-1分泌，激活下游信號通路，如AMPK、PI3K/AKT，調(diào)控機體糖代謝，與Everard等[18]的研究結(jié)果一致。

目前，添加益生菌已經(jīng)成為促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的重要戰(zhàn)略手段，Akk作為二代益生菌具有良好發(fā)展前景。近年來，關(guān)于Akk的研究多集中在人類及哺乳動物上，Akk在魚類中的作用機制研究還需要不懈努力。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Akk能夠調(diào)控腸道中GLP-1分泌，本研究進(jìn)一步證實飼料中添加P-Akk的確可以通過介導(dǎo)GLP-1分泌調(diào)控鯉糖代謝。這一結(jié)果可為P-Akk調(diào)控鯉糖代謝提供理論依據(jù)，解決了活菌添加不易的難題，且安全性有保障，更有希望廣泛使用。

4 結(jié)論

綜上，鯉自身具有一定糖代謝調(diào)節(jié)能力，通過肝臟糖酵解及糖異生途徑抵抗高糖飼料引起的血糖升高，但糖類水平過高會誘導(dǎo)鯉血糖升高，造成肝臟、腸道損傷。外源添加P-Akk能夠增加鯉腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量，抑制腸道分泌GLP-1，緩解高糖飼料引起的血糖升高，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)。該研究結(jié)果可為Akk作為益生菌在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）