大黃魚C型凝集素受體Clec4e的分子鑒定及凝集特性

張?chǎng)温澹?王永陽(yáng)， 吳子良， 黃小紅,，陳新華， 張偉妮,*

(1. 海水養(yǎng)殖生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)，中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

大黃魚(Larimichthys crocea)俗稱黃花魚，屬鱸形目(Perciforms)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys)，主要分布在黃海南部、東海南部及南海北部海域。據(jù)《2021年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，2020年我國(guó)大黃魚產(chǎn)量達(dá)25.4萬(wàn)t，占海水魚類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的14.51%，穩(wěn)居養(yǎng)殖海水魚類之首[1]。然而，大黃魚也是病害極其多發(fā)的魚類，長(zhǎng)期遭受溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[2]、變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)[3]、刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)[4]和虹彩病毒(Iridovirus)[5]等病原的感染，遭受了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，探究大黃魚抗病原感染的分子機(jī)制，制定有效的免疫防治方案，是其產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要策略。

魚類作為低等脊椎動(dòng)物，具有發(fā)達(dá)的先天性免疫和相對(duì)完善的獲得性免疫。當(dāng)外界病原體入侵時(shí)，先天免疫作為第一道防線發(fā)揮著重要作用[6-8]。而先天性免疫的激活依賴于模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)、RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene-Ilike receptors，RLRs)以及凝集素受體等，它們識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白、核酸等，從而激活免疫系統(tǒng)來(lái)清除病原或維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[9]。凝集素受體是一種以非共價(jià)可逆地結(jié)合碳水化合物的非酶蛋白或糖蛋白，最早在植物提取物中發(fā)現(xiàn)，具有血凝活性，現(xiàn)已證實(shí)廣泛存在于各種生物體中[10]。動(dòng)物凝集素受體通常被分為五大類∶C型(Ca2+依賴型)、S型(又稱半乳糖凝集素)、I型、P型以及正五聚體蛋白[11]。其中，C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CTLR)是最早發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物凝集素之一，也是凝集素家族中種類和數(shù)量最多的一個(gè)家族，主要通過(guò)識(shí)別和結(jié)合病原微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖類結(jié)構(gòu)的PAMPs激活宿主先天性免疫[6]。部分CTLR含有跨膜結(jié)構(gòu)域，作為膜受體發(fā)揮作用，部分CTLR也可作為分泌蛋白發(fā)揮作用。在功能上，CTLR被證實(shí)可參與多種免疫過(guò)程，包括病原體識(shí)別[12]、細(xì)胞黏附[13]、吞噬[14]、抗原遞呈細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用[15]、T淋巴細(xì)胞的活化與調(diào)控[16-17]等，甘露糖結(jié)合凝集素還具有激活補(bǔ)體的功能[13]。

目前，已經(jīng)在硬骨魚中鑒定出大量的CTLR，并證實(shí)其參與了宿主抗細(xì)菌感染的防御。如香魚(Plecoglossus altivelis)CTLR—PaCD209L能夠結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌，用抗體阻斷PaCD209L后，單核/巨噬細(xì)胞的吞噬作用和殺菌活性顯著降低[18]；半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的CTLR (CsCD94)與細(xì)菌孵育后降低了該菌的體外存活率[19]；許氏平鲉(Sebastes schlegelii)SsLec1具有抑制細(xì)菌感染的作用[20]；嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后草魚(Ctenopharyngodon idella)甘露糖受體gcMR在肝臟、脾臟、頭腎和腸道中的表達(dá)均顯著上調(diào)[21]。在大黃魚中已被鑒定的CTLR有LcNTC和LcDC-SIGN，前者是一種具有廣譜細(xì)菌凝集活性的分泌型CTLR，在肝臟、脾臟和頭腎中的表達(dá)量經(jīng)副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)刺激后均顯著升高[22]；后者為膜型CTLR，具有紅細(xì)胞凝集活性和對(duì)半乳糖的偏好性，對(duì)2種食源性致病菌大腸桿菌(Escherichia coli)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)具有凝集作用[23]。在大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的CTLR家族成員達(dá)20多種[24]，因而有必要對(duì)大黃魚CTLR的分子特征及功能進(jìn)行深入研究。

我們前期從溶藻弧菌感染的大黃魚頭腎組織轉(zhuǎn)錄組[25]及頭腎巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，均發(fā)現(xiàn)一個(gè)CTLR基因—C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員E基因(C-type lectin domain family 4 member E gene，Clec4e)的表達(dá)顯著上調(diào)。Clec4e又稱巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(the macrophage-inducible C-type lectin，Mincle)，主要分布在單核/巨噬細(xì)胞表面[26-27]。哺乳類Clec4e已被證實(shí)能夠識(shí)別細(xì)菌、真菌等病原[28-30]，而在魚類中鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)以大黃魚Clec4e為研究對(duì)象，分析其分子特征，探究其在不同組織與免疫細(xì)胞中的表達(dá)分布、細(xì)菌感染后表達(dá)模式的變化，及其凝集活性和糖結(jié)合特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步揭示硬骨魚CTLR在先天免疫中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用大黃魚購(gòu)自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，體長(zhǎng)(15±3) cm，體重(50±10) g；小鼠(Mus musculus)、新西蘭白兔(Oryctolagus cuniculus)購(gòu)自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司；無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和坎氏弧菌(V.campbellii)均為實(shí)驗(yàn)室保藏水產(chǎn)病原菌。本研究獲得了福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范，并按照福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

Pfu DNA 聚合酶、Trans1-T1 Phage Resistan感受態(tài)細(xì)胞、Trans BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、pEASY?-Basic Seamless Cloning and ASSembly Kit同源重組試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；表達(dá)載體pET-32a購(gòu)自德國(guó)默克集團(tuán)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA Marker、Protein Marker購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑2×SYBR Green Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖親和層析介質(zhì)(Ni)購(gòu)自GE公司；限制性內(nèi)切酶及其緩沖液購(gòu)自ThermoFisher公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、重組凝血酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；培養(yǎng)基BHI、TSB、2216E均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物

本實(shí)驗(yàn)所用基因LcClec4e(登錄號(hào)∶ON241310.1)和Lcβ-actin(登錄號(hào)∶XP_027140724.1)的引物均由福州博尚生物技術(shù)公司合成，具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab. 1 Primers information

1.3 LcClec4e基因克隆及生物信息學(xué)分析

前期通過(guò)對(duì)溶藻弧菌感染的大黃魚頭腎組織及頭腎巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Clec4e基因表達(dá)上調(diào)，因此，基于大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Clec4e基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物L(fēng)cClec4e-F/R (表1)。以大黃魚頭腎總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，以LcClec4e-F/R為引物，使用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系參考Pfu DNA聚合酶說(shuō)明書。PCR程序∶95 °C預(yù)變性5 min；95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min。PCR產(chǎn)物回收后與Blunt simple克隆載體連接后，轉(zhuǎn)化T-1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

通過(guò)BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi) 進(jìn)行序列同源性比對(duì)；利用ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)，SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；利用TMHMMServerv.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)；利用DNAMAN8.0進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)；利用MEGA 7.0中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所用物種氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表2。

表2 大黃魚與其他魚類Clec4e氨基酸序列Tab. 2 The amino acid sequences of L. crocea and other fish Clec4e

1.4 LcClec4e在大黃魚組織與免疫細(xì)胞中的表達(dá)分析

取健康的大黃魚3尾，丁香酚麻醉后，使用真空采血管(抗凝)進(jìn)行尾靜脈采血，剖取各組織(頭腎、脾臟、鰓、肝臟、頭腎、腸、胃、肌肉、皮膚、腦和心臟)，大黃魚原代頭腎巨噬細(xì)胞(primary head kidney macrophages，PKM)、原代頭腎淋巴細(xì)胞(primary head kidney lymphocytes，PKL)和原代頭腎粒細(xì)胞(primary head kidney granulocytes，PKG)的分離參照本課題組先前的方法[31]。組織和細(xì)胞RNA提取方法均按照試劑盒Promega LS1040操作說(shuō)明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Eastep?RT Master Mix操作說(shuō)明進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，qLcClec4e-F/R為引物，qLcβ-actin為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，反應(yīng)體系∶9.8 μL cDNA(1∶100，體積比)，0.1 μL qLcClec4e-F/qLcβactin-F，0.1 μL qLcClec4e-R/qLcβ-actin-R，10 μL 2×qPCR SYBR Green Master Mix，總體積20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序∶95 °C 15 min；95 °C 10 s，58 °C 20 s，72 °C 32 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

將分離后的PKM、PKL和PKG分別培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)，28 °C培養(yǎng)5 h后，使用終濃度為1×107CFU/mL的滅活溶藻弧菌刺激，分別在1、2、4、8和16 h收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LcClec4e基因表達(dá)水平的變化。

采用2?△△CT法[32]計(jì)算LcClec4e的相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 構(gòu)建LcClec4e胞外域(LcClec4e-ex)的原核表達(dá)載體

LcClec4e-ex基因克隆以LcClec4eORF的克隆載體為模板、LcClec4e-ex-F/R為引物，擴(kuò)增LcClec4e-ex，PCR體系見(jiàn)Pfu DNA聚合酶說(shuō)明書，PCR程序∶95 °C 5 min；95 °C 30 s，62 °C 30 s，72 °C 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

原核表達(dá)載體的線性化使用EcoR I與Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pET-32a進(jìn)行雙酶切線性化操作。酶切體系∶1 μLEcoR I，1 μLHindⅢ，5 μL 10×Fast Digest Buffer，質(zhì)粒5 μg，無(wú)核酸酶水補(bǔ)齊50 μL。酶切反應(yīng)條件∶37 °C 2 h。酶切完畢后使用膠回收試劑盒進(jìn)行DNA純化，操作步驟見(jiàn)OMEGA D2500-02說(shuō)明書。

LcClec4e-ex連接線性化pET-32a連接反應(yīng)體系∶5 μL 2×Basic Assembly Mix，4 μL線性化pET-32a，1 μLLcClec4e-ex，總體積10 μL；程序∶50 °C 15 min。將連接產(chǎn)物加入50 μL剛解凍的T-1感受態(tài)細(xì)胞，輕柔混勻，置于冰上30 min。42 °C熱休克45 s，立即置于冰上2 min。加入250 μL LB培養(yǎng)基，37 °C 200 r/min培養(yǎng)1 h，取200 μL菌液均勻涂抹在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落使用通用引物進(jìn)行菌落PCR，將陽(yáng)性單克隆測(cè)序。

1.6 LcClec4e-ex的重組表達(dá)與純化

重組LcClec4e-ex(rLcClec4e-ex)的表達(dá)將測(cè)序正確的LcClec4e-ex原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至Trans BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性單菌落接種至LB/Amp+液體培養(yǎng)基，200 r/min 37 °C培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，200 r/min 16 °C過(guò)夜誘導(dǎo)。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸洗滌 2次，高壓破碎，4 °C 12000×g離心10 min，將上清和沉淀分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)。

rLcClec4e-ex的純化向菌體破碎后的上清中加入適量體積的瓊脂糖親和層析介質(zhì)(Ni)，4 °C輕搖20 min使Ni介質(zhì)充分結(jié)合目的蛋白。將上清蛋白與Ni介質(zhì)轉(zhuǎn)移至層析柱中并使液體流盡。向Ni柱中加入雜蛋白洗滌緩沖液(Tris 20 mmol/L，NaCl 0.2 mol/L，咪唑100 mmol/L，pH 7.4)，考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè)流出液，直至考馬斯亮藍(lán)G250幾乎不變藍(lán)，則說(shuō)明雜蛋白已被完全洗滌。向Ni柱中加入目的蛋白洗脫緩沖液(Tris 20 mmol/L，NaCl 0.2 mol/L，咪唑300 mmol/L，pH 7.4)，用考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè)流出液，直至考馬斯亮藍(lán)G250幾乎不變藍(lán)，則說(shuō)明目的蛋白已被完全洗脫。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度。根據(jù)說(shuō)明書用BCA法測(cè)定蛋白濃度(BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司)。

rLcClec4e-ex融合標(biāo)簽的切除將純化的目的蛋白透析至酶切緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)。根據(jù)蛋白濃度加入適量的重組凝血酶37 °C酶切2 h。將蛋白溶液與Ni介質(zhì)輕搖孵育20 min，收集流出液。

1.7 凝集實(shí)驗(yàn)

參照已有文獻(xiàn)[22]的方法。使用抗凝采血管取小鼠、新西蘭白兔和大黃魚血液，2000×g離心15 min去除上層血漿，用10倍紅細(xì)胞體積的TBS(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4)重懸，2000×g離心5 min，棄上清液加入適量TBS配制成2%(體積百分比)紅細(xì)胞懸液。

將無(wú)乳鏈球菌接入BHI培養(yǎng)基37 °C振蕩培養(yǎng)；嗜水氣單胞菌用LB培養(yǎng)基，變形假單胞菌用TSB培養(yǎng)基，溶藻弧菌、副溶血弧菌和坎氏弧菌用2216E培養(yǎng)基，28 °C振蕩培養(yǎng)。待菌液OD600達(dá)到約0.6 ，6000×g離心 5 min，收集菌體，TBS 洗滌 3次，每次5 min，重懸菌體，將濃度調(diào)整為2.0×108CFU/mL。

紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)在V型96孔血凝板中進(jìn)行，細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行。將rLcClec4e-ex (1.2 mg/mL)梯度稀釋，每孔加入50 μL，再向每孔加入50 μL血細(xì)胞/細(xì)菌并充分混勻，室溫放置40 min。對(duì)溶解在TBS-Ca (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，pH 7.4)中的rLcClec4e-ex蛋白進(jìn)行同樣的處理以檢測(cè)rLcClec4e-ex的凝集活性是否為Ca2+依賴性。同時(shí)用同濃度的rTrxA標(biāo)簽蛋白做為陰性對(duì)照。鏡檢觀察血細(xì)胞/細(xì)菌凝集效果，記錄最小凝集濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 糖抑制實(shí)驗(yàn)

為檢測(cè)rLcClec4e-ex的糖類特異性結(jié)合能力，以變形假單胞菌為實(shí)驗(yàn)菌，選取D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、D-半乳糖、D-海藻糖、α-乳糖、蔗糖和脂多糖等9種糖類，進(jìn)行糖抑制實(shí)驗(yàn)。在96孔板加入25 μL梯度稀釋的上述糖類，再加入25 μL rLcClec4e-ex(濃度為對(duì)變形假單胞菌的最小凝集濃度)混合物于室溫孵育30 min后，加入50 μL的變形假單胞菌懸液(2.0×108CFU/mL)，輕輕吹打混勻，室溫孵育1 h。鏡檢每種糖類是否對(duì)凝集具有抑制作用，并記錄最小抑制濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 LcClec4e的序列分析

LcClec4e的cDNA全長(zhǎng)為1546 bp，包含一個(gè)309 bp的5′-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，一個(gè)771 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，一個(gè)466 bp的3′-UTR。LcClec4eORF編碼254個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)的分子量和理論等電點(diǎn)分別為24.3 ku和4.99。推斷的LcClec4e蛋白包含一個(gè)跨膜區(qū)域(transmembrane region，47-69位氨基酸)和一個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain，CRD，117～249位氨基酸)(圖1)。以LcClec4e氨基酸序列在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，結(jié)果顯示，LcClec4e與黃姑魚等鱸形目魚類Clec4e序列的一致性較高，約為81.89%～92.58%。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，各序列間具有較高的相似性，LcClec4e具有CTLR典型序列WIGL，6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，碳水化合物識(shí)別基序EPN和WFD以及2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，魚類Clec4e聚成一簇，遠(yuǎn)離鳥類和哺乳類組成的分支，其中LcClec4e與黃姑魚Clec4e的親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖1 LcClec4e 序列分析跨膜區(qū)域和糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域分別藍(lán)色和粉紅色突出顯示；方框表示跨膜區(qū)；下劃線表示糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域。Fig. 1 Sequence analysis of LcClec4eTransmembrane region and carbohydrate recognition domain are shown in blue and pink, respectively; transmembrane region is shown with square frame; carbohydrate recognition domain is shown with underline.

圖3 最大似然法構(gòu)建的Clec4e系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)標(biāo)尺(0.1)代表遺傳距離；節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字是用 bootstrapping 算法進(jìn)行 1000 次重復(fù)計(jì)算出的自展值(%)。Fig. 3 Maximum likelihood phylogenetic tree constructed based on Clec4e amino acid sequencesThe scale bar (0.1) represents the genetic distance; Numbers beside the internal branches indicate bootstrap values based on 1000 replications.

2.2 LcClec4e在大黃魚不同的組織和免疫細(xì)胞中的表達(dá)特征

LcClec4e在所檢測(cè)的10種組織中均有表達(dá)，其中在肝臟中表達(dá)最高、在腸中表達(dá)最少(圖4-a)。同時(shí)，LcClec4e在所檢測(cè)的3種原代免疫細(xì)胞中也均有表達(dá)，在原代頭腎巨噬細(xì)胞(PKM)中表達(dá)最高，其次是原代頭腎淋巴細(xì)胞(PKL)，在原代頭腎粒細(xì)胞(PKG)中表達(dá)最低(圖4-b)。經(jīng)滅活溶藻弧菌刺激后，LcClec4e在3種免疫細(xì)胞中的表達(dá)都顯著上調(diào)，在PKG與PKM中的相對(duì)表達(dá)量在4和8 h達(dá)到最高，隨后均出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而在PKL中則是持續(xù)表達(dá)上調(diào)(圖5)。

圖4 LcClec4e在大黃魚組織(a)和免疫細(xì)胞(b)中的表達(dá)譜(a) 1. 腸，2. 腦，3. 胃，4. 脾臟，5. 鰓，6. 頭腎，7. 心臟, 8. 肌肉，9. 皮膚，10. 肝臟，(n=3)；(b) 1. 原代頭腎粒細(xì)胞，2. 原代頭腎淋巴細(xì)胞，3. 原代頭腎巨噬細(xì)胞(n=3)。Fig. 4 Expression profiles of LcClec4e in tissues and immune cells(a) 1. intestine, 2. brain, 3. stomach, 4. spleen, 5. gills, 6. head kidney, 7. heart, 8. muscle, 9. skin, 10. liver (n=3); (b) 1. primary head kidney granulocytes, 2. primary head kidney lymphocytes, 3. primary head kidney macrophages (n=3).

圖5 滅活溶藻弧菌刺激后免疫細(xì)胞中LcClec4e的表達(dá)水平變化(a)原代頭腎粒細(xì)胞，(b)原代頭腎巨噬細(xì)胞，(c)原代頭腎淋巴細(xì)胞；n=3， “*”P＜ 0.05，“**”P ＜ 0.01。Fig. 5 Expression changes of LcClec4e in immune cells after stimulation with inactivated V. alginolyticus(a) primary head kidney granulocytes, (b) primary head kidney macrophages, (c) primary head kidney lymphocytes; n=3, * P ＜0.05 and ** P ＜0.01.

2.3 LcClec4e-ex的原核表達(dá)

PCR擴(kuò)增出胞外段LcClec4e-ex，回收目的片段，得到約400 bp的片段，與預(yù)期大小一致。重組質(zhì)粒pET-32a-rLcClec4e-ex誘導(dǎo)表達(dá)和純化的結(jié)果顯示，融合蛋白的大小為28 ku (含分子量為11.8 ku的TrxA標(biāo)簽蛋白)，符合蛋白預(yù)期大小(28.6 ku)(圖6)。表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)后超聲破碎，SDS-PAGE分別檢測(cè)上清液與沉淀，發(fā)現(xiàn)rLcClec4e-ex大量存在上清液中，少量存在沉淀中。大量誘導(dǎo)表達(dá)取破碎的菌液上清液進(jìn)行Ni柱親和層析純化后，將純化的rLcClec4e-ex的融合標(biāo)簽切除，再次Ni柱親和層析純化后，SDS-PAGE檢測(cè)幾乎無(wú)雜帶。

圖6 rLcClec4e-ex的表達(dá)與純化M. 蛋白 marker；1. 上清液中的總蛋白；2. 純化后的蛋白；3. 酶切后的蛋白。Fig. 6 Expression and purification of rLcClec4e-ex proteinM. protein marker; 1. total protein in the supernatant; 2. the purified protein; 3. protein after enzyme digestion.

2.4 rLcClec4e-ex的凝集活性

純化的rLcClec4e-ex在TBS-Ca中能凝集小鼠和新西蘭白兔的紅細(xì)胞，對(duì)大黃魚紅細(xì)胞無(wú)凝集作用(圖版Ⅰ)；細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)顯示，rLcClec4e-ex能凝集嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌，對(duì)副溶血弧菌和無(wú)乳鏈球菌無(wú)凝集作用(圖版Ⅱ)；在沒(méi)有Ca2+的情況下，rLcClec4e-ex對(duì)各種紅細(xì)胞和細(xì)菌均無(wú)凝集作用，可見(jiàn)其對(duì)紅細(xì)胞和細(xì)菌的凝集作用為Ca2+依賴型。同時(shí)，在rTrxA處理的對(duì)照中沒(méi)有觀察到凝集現(xiàn)象。rLcClec4e-ex對(duì)紅細(xì)胞和細(xì)菌的最小凝集濃度見(jiàn)表3。

表3 rLcClec4e-ex對(duì)紅細(xì)胞/細(xì)菌的最小凝集濃度Tab. 3 The minimal agglutinating concentration of rLcClec4e-ex against RBCs/bacteria

2.5 rLcClec4e-ex的糖類結(jié)合特異性

糖抑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、α-乳糖和脂多糖預(yù)處理均可抑制rLcClec4e-ex對(duì)變形假單胞菌的凝集作用；而蔗糖、D-半乳糖和D-海藻糖不能抑制rLcClec4eex對(duì)該菌的凝集活性。各種糖的最小抑制濃度見(jiàn)表4。

表4 糖類對(duì)rLcClec4e-ex凝集變形假單胞菌的最小抑制濃度Tab. 4 Minimal inhibition concentration of sugar on the agglutination of rLcClec4e-ex toward P. plecoglossicida

3 討論

C型凝集素受體(CTLR)作為模式識(shí)別受體(PRR)，通過(guò)識(shí)別并結(jié)合病原體表面糖類結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，在先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用。本研究從大黃魚中克隆并鑒定了LcClec4e，并檢測(cè)了其在不同的組織與免疫細(xì)胞中的表達(dá)譜和凝集特性。結(jié)果顯示，LcClec4e是一個(gè)具有跨膜結(jié)構(gòu)的受體，無(wú)信號(hào)肽，屬于CTLR家族中Ⅱ型亞家族的成員[33]。多序列比對(duì)的結(jié)果表明，LcClec4e的氨基酸序列與許多魚類Clec4e具有較高的同源性，都具有CTLR標(biāo)志性保守基序WIGL，在其C端有一個(gè)典型的碳水化合物結(jié)合域(CRD)，該CRD不僅包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(C1-C4)，并且在該CRD序列的N端出現(xiàn)了2個(gè)額外的半胱氨酸殘基(C0和C0’)，說(shuō)明LcClec4e的CRD屬于“長(zhǎng)型”(long-form)[33]，它們是維持和穩(wěn)定CRD的重要基礎(chǔ)[34]。同其他魚類的CTLR一樣，LcClec4e CRD包含了結(jié)合Ca2+所必需的殘基與典型的糖結(jié)合基序EPN以及WFD，表明LcClec4e具有碳水化合物親和性[35]。值得注意的是，WND是哺乳動(dòng)物CTLR結(jié)合碳水化合物的一個(gè)極其重要的基序[34]，魚類Clec4e通常表現(xiàn)為一個(gè)類似的基序WFD，而無(wú)脊椎動(dòng)物CTLR中，WND基序又可突變?yōu)镕RD[36]或WSD[37]?？梢?jiàn)，CTLR的保守基序可能由于進(jìn)化差異在不同物種間產(chǎn)生突變。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，LcClec4e與其他魚類Clec4e處于同一分支中，表明本研究克隆得到的LcClec4e確實(shí)為Clec4e的同源基因，且LcClec4e與同為石首魚科的黃姑魚Clec4e的序列一致性最高，為92.58 %。以上結(jié)果表明LcClec4e具有結(jié)構(gòu)的保守性，提示其功能也具有保守性。

LcClec4e在大黃魚所檢測(cè)的10種組織中均有表達(dá)，呈組成型分布，且在肝臟中表達(dá)量最高。在已報(bào)道的魚類CTLR中，有的在脾臟或鰓中表達(dá)量最高，如虹鱒[38]、大西洋鮭[39]、鯉[21]CTLR和大黃魚LcNTC[22]，也有的主要在肝臟中表達(dá)，如點(diǎn)帶石斑魚(E. coioides)[40]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[41]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[42]的CTLR。除此之外，斑馬魚CTLR4在卵巢中表達(dá)量最高[43]，半滑舌鰨CsCTL1在腎臟中表達(dá)量最高[44]，香魚PaCTL在腦中表達(dá)量最高[18]。上述結(jié)果表明CTLR在不同魚類中的表達(dá)譜存在明顯差異，可能是由于魚種差異或生存環(huán)境不同所導(dǎo)致的。此外，LcClec4e基因在大黃魚原代頭腎巨噬細(xì)胞(PKM)、原代頭腎粒細(xì)胞(PKG)和原代淋巴細(xì)胞(PKL)均有表達(dá)，用滅活溶藻弧菌處理后，LcClec4e在3種免疫細(xì)胞中的表達(dá)量都極顯著上調(diào)，提示LcClec4e參與了大黃魚抗細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答過(guò)程。

少數(shù)CTLR的凝集作用為非Ca2+依賴型[45-47]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃魚Clec4e的胞外段(rLcClec4eex)對(duì)紅細(xì)胞和細(xì)菌的凝集均為Ca2+依賴型，這與多數(shù)CTLR是相同的[48]。在本研究中，rLcClec4eex能夠凝集小鼠和兔的紅細(xì)胞，卻無(wú)法凝集大黃魚紅細(xì)胞，這與大黃魚膜型LcDC-SIGN的紅細(xì)胞凝集特性相同[49]，說(shuō)明高等與低等脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞表面糖類分子之間存在差異。而大黃魚分泌型LcNTC[22]對(duì)人、兔和大黃魚紅細(xì)胞均具有凝集活性，可見(jiàn)CTLR的凝集活性也與蛋白本身結(jié)構(gòu)和特性有關(guān)。細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明rLcClec4eex對(duì)嗜水氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌和坎氏弧菌均具有凝集作用，而對(duì)副溶血弧菌和無(wú)乳鏈球菌沒(méi)有凝集效果，表明其可能主要在抵御革蘭氏陰性菌入侵的免疫防御中發(fā)揮作用。CTLR對(duì)紅細(xì)胞和細(xì)菌的凝集基于其與細(xì)胞表面特定碳水化合物的結(jié)合。本研究中糖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rLcClec4e-ex對(duì)多種糖類均具有廣泛的結(jié)合力，包括D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-麥芽糖、α-乳糖和脂多糖，表明LcClec4e可能是這些糖類物質(zhì)的受體。尖吻鱸Clec4e已被認(rèn)為是脂多糖的受體之一，脂多糖通過(guò)與其結(jié)合，誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的表達(dá)[50]。與納氏海蟾魚(Thalassophryne nattereri)的Nattectin[45]不同的是，雖然LcClec4e也具有典型的糖特異性結(jié)合基序EPN，但rLcClec4eex不能結(jié)合D-半乳糖，這可能與其缺乏半乳糖特異性結(jié)合基序QPD有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究從大黃魚中鑒定了一種新的C型凝集素受體Clec4e，其組成型表達(dá)在檢測(cè)的大黃魚各組織和免疫細(xì)胞中，滅活溶藻弧菌可極顯著上調(diào)LcClec4e在免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平；重組LcClec4e對(duì)紅細(xì)胞和革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌均表現(xiàn)出凝集活性，且為Ca2+依賴型。此外，還證實(shí)重組LcClec4e對(duì)細(xì)菌的凝集基于其與各種碳水化合物的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LcClec4e可能作為一種PRR通過(guò)與菌體表面的糖類PAMPs結(jié)合來(lái)識(shí)別病原菌，并參與大黃魚抗細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）