光動(dòng)力技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌的滅活作用

王曉迪,鄭雙芝,龐一,朱軍莉,陸海霞

(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,浙江 杭州,310018)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus, Vp)廣泛存在于魚(yú)、蝦、蟹和牡蠣等水產(chǎn)品中,是重要的水產(chǎn)品源致病菌[1-3]。傳統(tǒng)熱殺菌方式殺菌力強(qiáng),但高溫有時(shí)會(huì)對(duì)食品特別是水產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)、感官等方面產(chǎn)生不良影響。光動(dòng)力技術(shù)(photodynamic technology, PDT)是一種新型的非熱殺菌方法[4],當(dāng)光敏劑被特定波長(zhǎng)的光源激發(fā)后產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)[5],ROS可以通過(guò)3種途徑(生物膜破壞、蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。姜黃素是從姜黃根莖中提取的葉黃素,在酸性至中性條件下較穩(wěn)定,具有天然的光敏活性、高靶向性及分子識(shí)別功能,在藍(lán)光(420～480 nm)下可被激活,因在人體中生物利用度低、安全無(wú)毒性被批準(zhǔn)為食品添加劑[7-8]。由姜黃素介導(dǎo)的PDT綠色、安全、高效、殺菌譜廣,可以殺滅單核增生李斯特菌[9]、腐敗希瓦氏菌[10]、黃曲霉[11]、假單胞菌[12]、志賀氏菌[7]和諾如病毒[13]。

檸檬酸(citric acid, CA)是存在于柑橘類水果中的可食用酸,是食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的有機(jī)酸之一。檸檬酸本身抗菌活性較弱,常與其他技術(shù)結(jié)合達(dá)到協(xié)同抗菌作用[14]。檸檬酸結(jié)合藍(lán)光光照對(duì)大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌均可造成顯著的損傷,但是需要光照處理7.5 h,pH值低至4.5[15],此方法盡管可以殺滅食品表面致病菌,但所需時(shí)間長(zhǎng),而且添加量高會(huì)對(duì)食品口感造成影響。

姜黃素PDT協(xié)同低濃度檸檬酸處理的優(yōu)勢(shì)在于檸檬酸進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后分解生成酸根離子(ROO-)和質(zhì)子(H+),降低細(xì)胞內(nèi)的pH值,影響細(xì)胞膜的滲透性和代謝機(jī)制,從而增加光敏劑對(duì)細(xì)胞的滲透率和細(xì)菌對(duì)姜黃素的敏感性,可以在更短時(shí)間(光照時(shí)間≤10 min)內(nèi)達(dá)到更好的殺菌效果,同時(shí)不會(huì)過(guò)多降低食品pH值(pH 5.6),也可以降低姜黃素染色效應(yīng)帶來(lái)的的不良影響,而且姜黃素和檸檬酸都是安全的食品添加劑。因此本研究采用姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力殺菌協(xié)同檸檬酸處理滅活Vp,研究其滅菌機(jī)理,為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌株

副溶血弧菌 ATCC 17802(Vp17802)購(gòu)于上海保藏生物技術(shù)中心:http://www.shbcc.org.cn/。

1.1.2 試劑

食品級(jí)姜黃素(純度>95%),陜西省寶雞市扶風(fēng)慈緣生物科技有限公司;檸檬酸(99.5%),阿拉丁試劑公司;LB肉湯、胰酪大豆胨瓊脂(tryptose soya agar,TSA)、3% TSA、Baird-Parker瓊脂、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖(thiosulfate-citrate-bilesalts-sucroseagarmedium,TCBS)瓊脂,杭州微生物試劑有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ROS熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA,1 mmol/L),北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;超微量腺苷三磷酸酶(ATPase)測(cè)試盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)測(cè)定試劑盒、總蛋白測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LED藍(lán)光燈(波長(zhǎng)429.5 nm,輻照度18.34 mW/cm2,燈管長(zhǎng)度1.2 m),華宸照明;SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀,杭州寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司;SIGMA3-30K 高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Sigma公司;BIO-RAD 核酸電泳儀,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;JS-680D全自動(dòng)凝膠成像分析儀,上海培清科技有限公司;Nano Pro 2020超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京鼎昊源科技有限公司,Hitachi SU-8010 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),日立公司。

1.2 菌懸液、光敏劑及檸檬酸母液的制備

1.2.1 菌懸液的制備

將Vp劃線于TCBS和Baird-Parker平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落到含3 g/100 mL NaCl的LB肉湯中,37 ℃,180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h至穩(wěn)定期。取1.5 mL菌液10 000 r/min,4 ℃離心5 min棄上清液,沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后加生理鹽水重懸至1 mL,使菌懸液對(duì)數(shù)濃度為8～9 lg CFU/mL。

1.2.2 姜黃素及檸檬酸母液的配制

按照檀利軍等[16]的方法制備4 000 μmol/L的姜黃素母液和1 000 μmol/L的姜黃素儲(chǔ)備液。母液與儲(chǔ)備液均4 ℃避光保存。檸檬酸母液:稱取1 g檸檬酸用10 mL無(wú)菌水配制成0.1 g/mL的母液。

1.3 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)Vp的殺菌效果

取100 μL菌懸液加入無(wú)菌生理鹽水中,使菌液濃度為7～8 lg CFU/mL。在24孔板中加入姜黃素、100 μL菌液、檸檬酸溶液以及PBS/LB肉湯使孔板中溶液總體積為1 mL。在室溫、黑暗條件下孵育10 min后,用LED藍(lán)光燈照射,然后將菌液梯度稀釋涂布于30 g/L NaCl TSA平板上,培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

設(shè)置空白對(duì)照組(L-M-C-)、PDT組(L+M-C-)、酸處理組(L-M-C+)、姜黃素處理組(L-M+C-)、姜黃素加酸處理組(L-M+C+)和姜黃素PDT協(xié)同酸處理組(L+M+C+)。為考察介質(zhì)及pH值對(duì)殺菌效果的影響分別在PBS緩沖液和30 g/L NaCl肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行處理,具體如下:

PBS中:姜黃素摩爾濃度為0.5、2 μmol/L,光照時(shí)間為0.5、1、2 min。

LB肉湯(30 g/L NaCl)中:姜黃素摩爾濃度為2、4 μmol/L,光照時(shí)間為1、5、10 min。

CA處理組:添加CA至其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

1.4 ROS的測(cè)定

取100 μL Vp菌懸液與姜黃素溶液(最終摩爾濃度分別為0、2、4、20 μmol/L)、檸檬酸溶液(終質(zhì)量濃度為0或0.5 mg/mL)混合,加PBS使24孔板中溶液總體積為1 mL,黑暗條件下孵育10 min,分別光照0、5、10 min后,4 ℃、10 000 r/min離心5 min棄上清液,用PBS重懸,加入10 μL熒光探針DCFH-DA(終摩爾濃度為10 μmol/L),顛倒混勻使探針和細(xì)胞充分接觸,37 ℃培養(yǎng) 20 min。用PBS洗滌3次后立即在485 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度[17]。設(shè)置3組試驗(yàn):L-M-C-、L-M+C+和L+M+C+。

1.5 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)細(xì)胞中抗氧化酶的影響

過(guò)夜活化的菌液振蕩均勻后,取100 μL菌懸液加入30 g/L NaCl的LB肉湯中,使菌體濃度為8 lg CFU/mL。設(shè)置4組試驗(yàn):L-M-C-、L-M+C+、L-M-C+和L+M+C+,藍(lán)光照射時(shí)間10 min。

1.5.1 CAT活性測(cè)定

樣品分組處理后,加入鉬酸銨迅速終止CAT分解H2O2的反應(yīng),剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物,在405 nm處測(cè)定其生成量,可計(jì)算出CAT的活力。同時(shí)測(cè)定各樣品中蛋白質(zhì)含量。定義反應(yīng)體系中每毫升菌液每秒催化1 μmol H2O2為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.5.2 SOD活性測(cè)定

樣品分組處理后,用WST-1法[18]測(cè)定細(xì)菌SOD活力(U/mg prot)。單位定義:在本反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

1.6 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)和通透性的影響

1.6.1 ATPase活力測(cè)定

樣品處理同1.5節(jié),處理后的菌懸液用PBS洗滌重懸,超聲細(xì)胞破碎儀破碎后測(cè)定ATPase活力。用超微量ATPase試劑盒測(cè)定各細(xì)胞破碎液中的ATPase活性,同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)試劑測(cè)定各組樣品中蛋白質(zhì)含量[19]。

1.6.2 AKP活力測(cè)定

樣品處理同1.5節(jié),處理后的菌懸液2 500 r/min離心10 min,取上清液用超微量AKP試劑盒測(cè)定各樣品AKP活性,同時(shí)測(cè)定各組樣品中蛋白質(zhì)含量。AKP活性用King unit/100 mL表示,定義為100 mL菌液與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1金氏單位(King unit)。

1.6.3 SEM觀察細(xì)菌形態(tài)變化

菌液經(jīng)處理后移取至1.5 mL EP管中,10 000 r/min離心4 min,棄上清液,迅速用固定液(2.5%戊二醛)充分固定后在4 ℃冰箱放置過(guò)夜。經(jīng)梯度體積分?jǐn)?shù)(30%,50%,70%,80%,90%,95%和100%)乙醇連續(xù)脫水、臨界點(diǎn)干燥、鍍膜后SEM觀察。

1.7 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)細(xì)菌DNA的影響

將過(guò)夜活化的菌液振蕩均勻后,取100 μL加入30 g/L NaCl LB肉湯中,使菌體濃度達(dá)到8 lg CFU/mL,設(shè)置5組試驗(yàn):L-M-C-、L+M-C-、L-M-C+、L-M+C+和L+M+C+。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組樣品均設(shè)置3個(gè)平行,所得數(shù)據(jù)為3次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用Origin 2019b軟件作圖并分析,通過(guò)SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)Vp的殺菌效果

a-PBS;b-3 g/100 mL NaCl LB肉湯圖1 姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)PBS和 30 g/L NaCl LB肉湯中Vp的殺菌效果Fig.1 The inactivation effect of curcumin- mediated PDT combined with citric acid on V.parahaemolyticus in PBS and 30 g/mL NaCl LB 注:“-”的表示無(wú)相應(yīng)處理,“+”表示進(jìn)行相應(yīng)處理; 不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)PBS/LB兩種介質(zhì)中Vp的影響如圖1所示。菌懸液加檸檬酸后,PBS和30 g/L NaCl LB肉湯中的pH值分別從7.4、7.0下降至5.6、4.8。結(jié)果表明,L+M-C-,L-M-C+,L-M+C-3組單一因素和姜黃素協(xié)同檸檬酸(L-M+C+)處理后 Vp菌落總數(shù)與空白對(duì)照組(L-M-C-)無(wú)顯著差異(P<0.05);姜黃素介導(dǎo)PDT(L+M+C-)殺菌效果增強(qiáng),且隨姜黃素濃度增加而增強(qiáng);姜黃素介導(dǎo)PDT協(xié)同檸檬酸(L+M+C+)處理組顯著殺滅Vp(P<0.05),殺菌效果隨姜黃素濃度的增加和光照時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng),同時(shí)與檸檬酸表現(xiàn)出協(xié)同作用,在PBS中Vp下降了7.43 lg CFU/mL。在LB肉湯中要達(dá)到與在PBS中類似的殺菌效果則需提高姜黃素的濃度并延長(zhǎng)光照時(shí)間,添加檸檬酸同樣有顯著協(xié)同效應(yīng),但是在LB肉湯中Vp耐受性更強(qiáng),主要是因?yàn)長(zhǎng)B培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)干擾姜黃素對(duì)藍(lán)光的吸收,降低了光動(dòng)力的殺菌效率。但同時(shí)LB肉湯緩沖pH的作用沒(méi)有PBS強(qiáng),而Vp對(duì)酸較敏感,有研究表明檸檬酸飲料對(duì)弧菌有強(qiáng)烈的抑制作用,一是pH值的影響,二是其陰離子具有獨(dú)特的殺菌功能[20]。因此添加檸檬酸對(duì)LB肉湯中Vp的協(xié)同殺菌效果極為顯著。由此可見(jiàn),延長(zhǎng)光照時(shí)間、增加光敏劑濃度、協(xié)同檸檬酸處理均可以增強(qiáng)PDT滅活效果。本研究中檸檬酸對(duì)PDT殺菌的增強(qiáng)作用可能來(lái)自兩方面:1)增加細(xì)菌對(duì)光敏劑姜黃素的敏感性;2)提高姜黃素本身的光活性。檸檬酸降低細(xì)胞內(nèi)pH值并影響細(xì)胞質(zhì)環(huán)境[21],增強(qiáng)姜黃素的滲透以及細(xì)菌對(duì)姜黃素光活性的敏感性,產(chǎn)生更強(qiáng)的抗菌光活性。而且從另一個(gè)角度來(lái)看,酸性環(huán)境還可以提高姜黃素在水中的穩(wěn)定性和溶解度,直接增強(qiáng)了姜黃素的抗菌光活性[22]。LI等[23]研究了姜黃素殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌及其在不銹鋼表面生物膜的光動(dòng)力學(xué)殺菌效果,結(jié)果也表明,姜黃素濃度、孵育和光照時(shí)間是影響細(xì)菌光動(dòng)力失活的主要因素。DE OLIVEIRA等[24]用姜黃素結(jié)合長(zhǎng)波黑斑效應(yīng)紫外線(ultraviolet radiation A)滅活大腸桿菌O157∶H7和李斯特菌,通過(guò)添加檸檬酸來(lái)增強(qiáng)殺菌效果,使姜黃素溶液pH值從6降到2.5,再經(jīng)UV-A光照5 min后,大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌都減少了5 lg CFU/mL,說(shuō)明酸性環(huán)境有利于姜黃素的殺菌。另有研究表明,沒(méi)食子酸和乳酸也能影響大腸桿菌O157∶H7的細(xì)胞膜滲透性和代謝機(jī)制,與UV-A光結(jié)合,可以導(dǎo)致細(xì)菌失活[25]。

2.2 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS及對(duì)細(xì)菌抗氧化酶活性的影響

光敏劑吸收光子被激發(fā)后到達(dá)三重態(tài)的激發(fā)態(tài),通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型光動(dòng)力反應(yīng)生成超氧陰離子(·O2-)、H2O2、羥自由基(·OH)等ROS和單線態(tài)氧(1O2),使細(xì)胞死亡[6],如圖2-a所示。L-M+C+組與空白對(duì)照組相比ROS水平?jīng)]有顯著提升,說(shuō)明姜黃素必須被藍(lán)光激發(fā)才能產(chǎn)生ROS。提高姜黃素的濃度(2、4 μmol/L)、延長(zhǎng)光照時(shí)間(5、10 min)、加檸檬酸(0.5 mg/mL)等都會(huì)導(dǎo)致體系中 ROS的水平顯著提高(P<0.05)。FREITAS等[26]用姜黃素光動(dòng)力處理金黃色葡萄球菌,發(fā)現(xiàn)姜黃素濃度不變時(shí),隨光照時(shí)間的延長(zhǎng),ROS生成量增加。ROS量與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果呈負(fù)相關(guān),即隨姜黃素濃度增加、光照時(shí)間延長(zhǎng)及檸檬酸的添加,菌體內(nèi)ROS水平不斷升高,菌落總數(shù)不斷降低。

CAT和SOD都是細(xì)菌體內(nèi)重要的抗氧化酶,這些抗氧化酶共同作用,防止細(xì)胞內(nèi)ROS水平過(guò)高[27]。Vp的CAT活力如圖2-b所示。是否協(xié)同檸檬酸處理對(duì)CAT活力影響更大,高濃度姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理后,Vp的CAT完全失活(P<0.05)。Vp的SOD活力如圖2-c所示。SOD活力受姜黃素濃度影響更顯著,SOD活力與姜黃素濃度呈劑量依賴性。低濃度姜黃素PDT處理Vp使SOD活力略微增加,這是SOD對(duì)少量ROS的應(yīng)激響應(yīng)[28],但隨著姜黃素濃度的升高SOD活力最高下降了89.75%。由此可知:PDT處理時(shí),提高姜黃素濃度及添加檸檬酸會(huì)使SOD和CAT活力下降,高濃度姜黃素協(xié)同檸檬酸處理時(shí)酶活力下降更顯著(P<0.05)。

KHAN等[29]用核黃素作為光敏劑光動(dòng)力處理大腸桿菌時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,與只核黃素處理和單光照處理的樣品相比,暴露于光照下核黃素處理的樣品中SOD和CAT顯著降低。韓啟明等[30]研究發(fā)現(xiàn)低濃度姜黃素光動(dòng)力處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌會(huì)導(dǎo)致兩種菌SOD活力略微上升,但隨著光敏劑濃度上升酶活力又會(huì)下降,這是酶對(duì)適量ROS的應(yīng)激響應(yīng)及因氧化爆發(fā)超過(guò)細(xì)菌抗氧化能力,最終破壞酶的空間結(jié)構(gòu),與本文結(jié)果一致。

a-ROS量;b-CAT活力;c-SOD活力圖2 姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)Vp細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS量、體內(nèi)CAT活力、SOD活力的影響Fig.2 Effects of curcumin- mediated PDT combined with citric acid on concentration of ROS and activities of CAT or, SOD in V.parahaemolyticus

2.3 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)細(xì)胞壁、膜通透性的影響

2.3.1 對(duì)細(xì)胞壁、膜通透性的影響

ATPase是生物膜上的一種極其重要的蛋白酶,對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著必不可少的作用。當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí),ATP含量迅速下降,可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞中ATPase活性來(lái)反映細(xì)胞膜的損傷[31]。由圖3-a可以看出,PDT處理后Vp的ATPase活性均顯著降低(P<0.05)。PDT處理時(shí),提高姜黃素濃度和添加檸檬酸會(huì)使ATPase活力下降,在高濃度姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理時(shí)ATPase活性下降最多,細(xì)胞膜損傷更嚴(yán)重。L+M+C+處理組與空白對(duì)照組相比Vp的Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性分別下降了97.98%和97.34%。細(xì)菌中的AKP通常位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中間,只有當(dāng)細(xì)胞壁受損時(shí),才會(huì)泄漏到胞外。因此,可通過(guò)測(cè)定上清液中AKP含量反映細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性。由圖3-b可知,與空白對(duì)照組相比,添加檸檬酸的處理都可以顯著增加Vp細(xì)胞壁通透性(P<0.05)。不光照僅姜黃素聯(lián)合檸檬酸處理后,與對(duì)照組相比兩種菌的AKP活性都有上升,甚至高于姜黃素光動(dòng)力處理組,但仍比姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理組的AKP活性低(P<0.05),表明這些處理均對(duì)細(xì)胞壁造成損傷。經(jīng)高濃度姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理10 min后,與空白對(duì)照組相比AKP活性上升了0.28 King unit/100 mL。由此可知,PDT處理時(shí),提高姜黃素濃度和添加檸檬酸會(huì)使上清液中AKP活力上升,在高濃度姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理時(shí),上清液中AKP活性上升最多,細(xì)胞壁損傷最嚴(yán)重。

a-姜黃素介導(dǎo)的PDT復(fù)合檸檬酸處理后對(duì)Vp ATPase活性的影響; b-姜黃素介導(dǎo)的PDT復(fù)合檸檬酸處理后對(duì)Vp上清液中 AKP活性的影響圖3 姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理后對(duì) Vp細(xì)胞中ATPase和上清液中AKP活性的影響Fig.3 Effects of curcumin-mediated PDT combined with citric acid on ATPase activity in V.parahaemolyticus and AKP activity in supernatant

2.3.2 SEM觀察細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步探究PDT各處理對(duì)Vp的作用機(jī)理,通過(guò)SEM對(duì)細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖4所示。與空白對(duì)照組相比,經(jīng)姜黃素PDT處理后,Vp發(fā)生形變,出現(xiàn)更深的凹槽和褶皺(圖4-b)。再協(xié)同檸檬酸處理,由于細(xì)胞膜被破壞導(dǎo)致內(nèi)容物流失嚴(yán)重,Vp呈現(xiàn)扁平破損狀態(tài)(圖4-c)。

a-L-M-C-;b-L+M+C-;c-L+M+C+圖4 姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)Vp 細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4 Effects of curcumin-mediated PDT combined with citric acid on cell morphology of V.parahaemolyticus 注:光照時(shí)間均為10 min(圖5同)。

2.4 姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理對(duì)細(xì)菌DNA的損傷

光動(dòng)力處理后 Vp基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳如圖5所示。與對(duì)照組相比,低濃度姜黃素PDT組的 DNA條帶稍微變暗,高濃度姜黃素PDT組的DNA條帶變暗更明顯,從總體水平來(lái)看,Vp經(jīng)過(guò)姜黃素PDT處理后,DNA均有損傷(圖5)。高濃度姜黃素PDT協(xié)同檸檬酸處理后A3泳道已經(jīng)沒(méi)有條帶出現(xiàn)說(shuō)明Vp已完全受損,與計(jì)數(shù)結(jié)果相吻合。有研究發(fā)現(xiàn),PDT會(huì)導(dǎo)致某些細(xì)菌DNA的嚴(yán)重?fù)p傷,包括Vp、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等[32]。

A1-2 μmol/L姜黃素;A2-4 μmol/L姜黃素; A3-4 μmol/L姜黃素+0.5 mg/mL CA圖5 姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理前后 Vp DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 DNA agarose gel electrophoresis map of V.parahaemolyticus before and after treatment by curcumin-mediated PDT combined with citric acid

3 結(jié)論

姜黃素介導(dǎo)的PDT殺菌效果具有姜黃素濃度和光照時(shí)間依賴性,同時(shí)姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同檸檬酸處理表現(xiàn)出更好的殺菌效果,當(dāng)姜黃素PDT協(xié)同低濃度檸檬酸共同處理時(shí),既避免了在實(shí)際應(yīng)用到食品中時(shí)高濃度的姜黃素對(duì)食品的顏色造成影響,也解決了姜黃素在食品基質(zhì)中的溶解度低影響殺菌效果的問(wèn)題,還不會(huì)因添加過(guò)高的檸檬酸使食品的pH值降低太多。PDI協(xié)同CA處理對(duì)Vp的滅活機(jī)理主要是姜黃素吸收430 nm的藍(lán)光被激發(fā)到更高的能量狀態(tài),通過(guò)電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性ROS,進(jìn)而破壞細(xì)胞壁、膜、DNA,改變酶活力(ATPase、抗氧化酶CAT、SOD活力下降,AKP活力上升等),擾亂細(xì)胞的正常生理功能,并最終導(dǎo)致細(xì)胞壁、膜破損進(jìn)而裂解死亡。同時(shí)PDT協(xié)同檸檬酸處理可以有效清除Vp生物被膜。

本研究為姜黃素介導(dǎo)的PDT協(xié)同CA處理應(yīng)用于控制不適合或不進(jìn)行熱殺菌的食品中Vp的污染提供了理論依據(jù)。