大豆肽和豌豆肽對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝及其相關(guān)機(jī)制的研究

劉婧,任瑋,程改平,李可,徐淼,閆九明,李明亮,秦修遠(yuǎn)*

1(四川大學(xué) 華西醫(yī)院,四川 成都,610041)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015) 3(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京,100015)4(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造 國(guó)家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

大豆肽和豌豆肽是大豆分離蛋白或豌豆蛋白經(jīng)現(xiàn)代生物酶解等生物技術(shù)制得的小分子低聚肽,通過酶解技術(shù)釋放出蛋白質(zhì)氨基酸序列中存在的多種活性肽段,因而具有多種生物活性功能。除增強(qiáng)免疫力[1]、緩解體力疲勞[2]等以外,大豆肽還被證實(shí)具有多種生理功能。YIMIT等[3]證明了大豆肽能夠調(diào)節(jié)志愿者的細(xì)胞免疫系統(tǒng),提高血漿多巴胺水平來調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì),從而促進(jìn)大腦功能。RAYAPROLU等[4]發(fā)現(xiàn)了大豆肽能夠抑制包括血液CCRF-CEM和Kasami-3細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞等多種癌細(xì)胞生長(zhǎng),有望作為替代癌癥治療的食品配料或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。AMAKYE等[5]通過D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠灌胃不同來源生物活性肽,發(fā)現(xiàn)大豆肽也具有良好的抗衰老、抗氧化活性。ISHIHARA等[6]給予高脂飲食誘導(dǎo)的II型糖尿病小鼠大豆肽,結(jié)果顯示大豆肽能夠抑制II型糖尿病小鼠吸收膳食中的脂類,增加碳水化合物氧化,增加餐后能量消耗。

ZHU等[7]和WEI等[8]在豌豆肽中發(fā)現(xiàn)了4種具有調(diào)節(jié)糖代謝通路的肽段,并通過高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的II型糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)證明了豌豆肽能夠預(yù)防胰島素抵抗,可能具有開發(fā)糖尿病人使用的功能食品的基礎(chǔ)。崔欣悅等[9]在HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型中發(fā)現(xiàn),豌豆肽干預(yù)后細(xì)胞的葡萄糖消耗量提高了1.31～1.68倍,胰島素受體的表達(dá)提高率1.19～1.34倍,凋亡蛋白Caspase-3陽性表達(dá)率增加。張敏佳等[10]也通過環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠證實(shí)了豌豆肽能夠改善小鼠免疫臟器質(zhì)量及形態(tài),提高白細(xì)胞、脾臟T淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白含量等的含量。秦修遠(yuǎn)等[11]以DPPH自由基、羥自由基及Fe3+為判斷指標(biāo),研究了豌豆肽的抗氧化作用。

盡管已有研究證明大豆肽和豌豆肽均具有開發(fā)II型糖尿病人營(yíng)養(yǎng)膳食功能的基礎(chǔ),但對(duì)于二者的作用分子通路及二者復(fù)合的增效作用卻鮮有研究。本研究建立胰島素抵抗模型,探究不同比例的大豆肽與豌豆肽的復(fù)合物對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗、葡萄糖吸收的影響作用,并通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)及胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)/蛋白激酶B(Akt)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基,美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, 美國(guó)Gibco公司;雙抗、CCK-8檢測(cè)試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;人胰島素,索萊寶科技有限公司;2-(N-(7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑-4-氨基)-2-脫氧葡萄糖(2-NBDG),美國(guó)Sigma公司;葡萄糖檢測(cè)試劑盒、糖原檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所;IRS-1、磷酸化胰島素受體底物-1(p-IRS-1)、Akt、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)、GLUT2、GLUT4抗體,美國(guó)Proteintech公司;大豆肽、豌豆肽,北京中食海氏生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜,新加坡ESCO公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher Scientific;熒光酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;C6流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD公司;SDS-PAGE系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司 ;熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肽的基礎(chǔ)理化成分分析

參照GB 5009.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》、GB 5009.4—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》、GB 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》,分別對(duì)大豆肽和豌豆肽中水分含量、灰分含量和總氮(粗蛋白)的含量進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定。參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》,測(cè)定大豆肽和豌豆肽的氨基酸組成。采用文獻(xiàn)[12]所述高效凝膠過濾色譜法測(cè)定大豆肽和豌豆肽分子質(zhì)量及分布情況。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基采用含10% FBS和1%雙抗(均為體積分?jǐn)?shù))的DMEM高糖培養(yǎng)基。細(xì)胞融合達(dá)80%左右時(shí)用0.25%(體積分?jǐn)?shù))胰酶進(jìn)行消化傳代,平均2～3 d傳代1次。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組情況如下:對(duì)照組,僅用2% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基處理;模型組,含10-6mol/L胰島素[13-14]的2% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組用含肽的2% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基處理,分為大豆肽組、豌豆肽組、大豆肽∶豌豆肽=1∶1組、大豆肽∶豌豆肽=1∶2組、大豆肽∶豌豆肽=1∶3組、大豆肽∶豌豆肽=3∶1組、大豆肽∶豌豆肽=2∶1組,共9組,以上均為質(zhì)量比。

1.3.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

將1.3.2節(jié)所述各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0、100、200、400、600、800 μg/mL,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率選擇最佳處理濃度。

1.3.5 葡萄糖消耗檢測(cè)

收集細(xì)胞,接種于96孔板(1×105細(xì)胞/mL,200 μL/孔),培養(yǎng)24 h,然后,用含10-6mol/L胰島素和2% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。按照分組各自加入不同樣品,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每24 h更換新鮮培養(yǎng)基。收集最后24 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中剩余葡萄糖含量。

1.3.6 葡萄糖吸收檢測(cè)

細(xì)胞按照1×105/mL的密度接種在6孔板中(2 mL/孔)培養(yǎng)24 h。然后,用含10-6mol/L胰島素和2%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。按照分組各自加入不同樣品,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每24 h更換新鮮培養(yǎng)基。將細(xì)胞用PBS洗滌后,以50 μmol/L的終濃度加入2-NBDG,在37 ℃下孵育30 min后,將細(xì)胞用PBS洗滌2次,以去除殘留的2-NBDG。消化細(xì)胞,將細(xì)胞全部收集在黑色96孔板中,并立即在485 nm/530 nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞對(duì)2-NBDG的攝取,以反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力。

1.3.7 細(xì)胞糖原含量測(cè)定

按1.3.6節(jié)方法培養(yǎng)后。收集細(xì)胞,按照糖原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞糖原含量。

1.3.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)

按1.3.6節(jié)方法培養(yǎng)后。收集細(xì)胞蛋白用于Western Blot。分別檢測(cè)細(xì)胞中以下蛋白的相對(duì)表達(dá)量:IRS-1、p-IRS-1、Akt、p-Akt、GLUT2、GLUT4。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2022對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用Tukey法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)置3～6次重復(fù),*#P<0.05表示具有顯著性差異。#與對(duì)照組相比具有顯著性差異,*與模型組相比具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆肽和豌豆肽的基礎(chǔ)理化檢測(cè)結(jié)果分析

大豆肽中水分含量為4.73%,灰分含量為5.08%,蛋白質(zhì)含量(以干基計(jì))為86.98%,豌豆肽中水分含量為4.46%,灰分含量為5.04%,蛋白質(zhì)含量(以干基計(jì))為88.30%。2種肽的氨基酸組成及分子質(zhì)量分布如表1和表2所示。

2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè)

用CCK-8法檢測(cè)大豆肽和豌豆肽對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率影響,以確定安全劑量范圍。由圖1可以看出,在肽質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí),各處理組對(duì)細(xì)胞存活率均無顯著影響,當(dāng)肽質(zhì)量濃度達(dá)到400、600、800 μg/mL時(shí),肽對(duì)細(xì)胞毒性的作用逐漸增強(qiáng),細(xì)胞存活率顯著性降低(#P<0.05),因此,大豆肽和豌豆肽100、200 μg/mL對(duì)HepG2細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性,本實(shí)驗(yàn)后續(xù)采取肽的安全劑量為200 μg/mL。

表2 分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating oligopeptides

a-肽質(zhì)量濃度100 μg/mL;b-肽質(zhì)量濃度200 μg/mL;c-肽質(zhì)量濃度400 μg/mL;d-肽質(zhì)量濃度600 μg/mL;e-肽質(zhì)量濃度800 μg/mL圖1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率Fig.1 Cell survival rate measured by CCK-8 assay

2.3 葡萄糖消耗檢測(cè)

HepG2細(xì)胞在含有10-6mol/L的胰島素和2%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中處理24 h建立胰島素抵抗模型。從圖2可知,模型組的葡萄糖消耗相比于對(duì)照組顯著降低,說明HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立成功,經(jīng)大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量都顯著升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1組在各處理組中相比于模型組差距最為顯著。

圖2 HepG2細(xì)胞24 h的葡萄糖消耗量Fig.2 Glucose consumption of HepG2 in 24 h

2.4 葡萄糖吸收檢測(cè)

2-NBDG的熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力。由圖3可知,經(jīng)造模處理后,模型組的熒光強(qiáng)度相比于對(duì)照組顯著降低,經(jīng)大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度相比于模型組有了不同程度的升高,其中,豌豆肽組、大豆肽∶豌豆肽=1∶3和2∶1相比于模型組具有顯著性差異,尤其是大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組中細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相比于模型組差距最為顯著,表明該組細(xì)胞的葡萄糖吸收能力升高最為顯著。

2.5 細(xì)胞糖原含量檢測(cè)

由圖4可知,經(jīng)過造模處理后,模型組細(xì)胞中糖原含量相比于對(duì)照組顯著降低,經(jīng)大豆肽和豌豆肽及其各比例配比處理后,各處理組中細(xì)胞糖原含量相比于模型組出現(xiàn)了不同程度的升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組中細(xì)胞糖原含量相比于模型組升高具有顯著性差異。

圖3 HepG2細(xì)胞中2-NBDG的熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity of 2-NBDG in HepG2

圖4 HepG2細(xì)胞糖原含量Fig.4 Glycogen content in HepG2

2.6 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)分析

GLUT2和GLUT4,同屬促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,分別以非胰島素方式和胰島素依賴性方式調(diào)節(jié)葡萄糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)[15-16]。圖5模型組中,細(xì)胞的GLUT2和GLUT4蛋白的表達(dá)量相比于對(duì)照組都出現(xiàn)了一定程度的降低,在大豆肽和豌豆肽以及其不同配比下,細(xì)胞中GLUT2和GLUT4蛋白的表達(dá)量相比于模型組出現(xiàn)了不同程度的升高,其中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1處理組的細(xì)胞中上述2個(gè)蛋白的表達(dá)量相比于模型組升高最為顯著。

a-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2和GLUT4灰度圖;b-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2相對(duì)灰度值;c-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2相對(duì)灰度值圖5 GLUT2和GLUT4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of GLUT2 and GLUT4 preoteins

2.7 IRS-1/Akt通路磷酸化水平分析

磷酸化的IRS-1可以導(dǎo)致Akt產(chǎn)生磷酸化效應(yīng),引起Akt通路活化。Akt是胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白激酶,在細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、糖類代謝過程中起重要作用。活化的Akt抑制可以GSK-3β的磷酸化作用,引起GSK-3β下游底物糖原合成酶活性升高,從而促進(jìn)糖原合成,抑制糖原分解,提高葡萄糖代謝,降低血糖,改善胰島素抵抗?fàn)顩r。由圖6可以看出,模型組中細(xì)胞IRS-1和Akt磷酸化水平相比于對(duì)照組顯著降低,在處理組中,大豆肽∶豌豆肽=2∶1組的細(xì)胞中上述2種蛋白的磷酸化水平相比于模型組提高較為顯著。

a-IRS-1、Akt及其磷酸化產(chǎn)物灰度圖;b-IRS-1磷酸化水平;c-Akt磷酸化水平圖6 IRS-1和Akt蛋白的磷酸化水平Fig.6 Phosphorylation levels of IRS-1 and Akt

3 結(jié)論

胰島素抵抗是組織對(duì)胰島素作用的敏感性下降,通常的臨床上指的是機(jī)體對(duì)胰島素促進(jìn)葡萄糖提取的作用發(fā)生抵抗[17]。肝臟是胰島素作用的中藥靶組織之一,而HepG2細(xì)胞是一種體外研究肝細(xì)胞的常用細(xì)胞株,也是建立胰島素抵抗模型研究的常用模型[18]。

GLUT2和GLUT4是調(diào)節(jié)葡萄糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白成員,分別以非胰島素和胰島素依賴性方式調(diào)節(jié)葡萄糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。IRS-1/P13K/AKT信號(hào)通路已被證實(shí)是GLUT4調(diào)控通路的上游。IRS-1促進(jìn)P13K的磷酸化,磷酸化的P13K進(jìn)一步將絲氨酸/蘇氨酸Akt磷酸化為p-Akt,進(jìn)一步促進(jìn)GLU4從內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜,最后激發(fā)葡萄糖攝取。GLUT2易位能夠介導(dǎo)葡萄糖在肝細(xì)胞膜中的擴(kuò)散,并維持細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖的平衡[19]。因此,胰島素刺激的葡萄糖攝取減少與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下p-IRS-1減少有關(guān)。

本研究中建立的胰島素抵抗模型,表明HepG2細(xì)胞在模型刺激下的葡萄糖消耗、葡萄糖吸收、糖原含量的減少,GLUT2和GLUT4蛋白表達(dá)水平均降低,磷酸化的IRS-1及Akt均下降,而大豆肽及豌豆肽通過進(jìn)入細(xì)胞膜作用,顯著改善了葡萄糖代謝水平,這表明大豆肽和豌豆肽可能通過增加IRS和Akt的磷酸化水平來促進(jìn)葡萄糖攝取和提高細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2和GLUT4的表達(dá)量,從而激活胰島素信號(hào)通路,進(jìn)一步改善葡萄糖跨膜代謝障礙,提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和消耗能力以及糖原合成能力。當(dāng)大豆肽與豌豆肽以2∶1的比例時(shí)效果最佳。