代謝工程改造釀酒酵母合成β-胡蘿卜素

周頌,李由然,張梁,丁重陽,顧正華,石貴陽,徐沙*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素家族,存在于植物、水果和微生物中[1],它可以作為維生素原、功能性化妝品、食品著色劑和飼料補(bǔ)充劑,因此被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品、化妝品和食品工業(yè)等領(lǐng)域,是一類具有重要生物功能和商業(yè)價(jià)值的色素[2-3]。另外,β-胡蘿卜素還是一種最常見的維生素A補(bǔ)充劑,維生素A對于人體視覺發(fā)育至關(guān)重要,如果身體缺少維生素A,視力就會(huì)出現(xiàn)問題,甚至?xí)?dǎo)致夜盲癥[4]。盡管90%的商業(yè)化β-胡蘿卜素是通過化學(xué)合成方法得到的[5],但考慮到化學(xué)品的安全合成問題,以及消費(fèi)者對天然添加劑、微生物的偏好,利用微生物異源表達(dá)合成β-胡蘿卜素受到越來越多的關(guān)注[6]。

由于遺傳背景清楚、基因操作工具豐富、營養(yǎng)需求簡單、對高糖低pH等耐受性強(qiáng)、安全性高等特點(diǎn),釀酒酵母不僅是生物化學(xué)和分子生物學(xué)等研究的首選模式真核微生物,也是傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)和現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的重要工業(yè)微生物[7-9]。通過對釀酒酵母的系統(tǒng)改造,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)多種以乙酰輔酶A作為主要前體高效合成重要化合物,如中長鏈脂肪酸、長鏈醇、萜類、黃酮等[10-11]。在釀酒酵母中構(gòu)建的β-胡蘿卜素的合成途徑可以分為兩部分,上游甲羥戊酸途徑合成前體香葉基香葉基焦磷酸,以及下游β-胡蘿卜素的合成。類胡蘿卜素合成途徑非常復(fù)雜需要多種酶的協(xié)同作用,包括合成酶、脫氫酶、環(huán)化酶、羥化酶和酮化酶等。此外,大多數(shù)類胡蘿卜素在胞內(nèi)大量積累后,因其疏水性會(huì)損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并危害細(xì)胞的正常生理功能[12]。而脂質(zhì)體的積累可以緩解其產(chǎn)物毒性,但由于微生物底盤細(xì)胞中有限的膜結(jié)構(gòu)在一定程度上限制了類胡蘿卜素產(chǎn)量提升空間。

本研究室前期研究發(fā)現(xiàn),以釀酒酵母YPH499為底盤細(xì)胞,過量表達(dá)關(guān)鍵基因dga1、pah1以及與脂滴形成關(guān)聯(lián)緊密的ldp1基因,得到一株脂質(zhì)體含量提高的菌株LFD18,番茄紅素單位產(chǎn)量為109.3 mg/g CDW。本研究以LFD18為出發(fā)菌株,在實(shí)驗(yàn)中偶然得到一株β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的突變株,通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等基因轉(zhuǎn)錄水平提高。進(jìn)一步研究改造后得到工程菌ZS20,其β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高到194.3 mg/L。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株和所用引物

研究過程中所用的菌株及質(zhì)粒如表1所示,所用引物如表2所示,實(shí)驗(yàn)所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)使用的引物Table 2 Primers used in this study

續(xù)表2

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基LB (g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉18,121 ℃、20 min滅菌。酵母培養(yǎng)基YPD (g/L):蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20、若需固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉18,115 ℃、20 min滅菌。篩選培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20、5-FOA 1,115 ℃、20 min滅菌。氨基酸補(bǔ)足液(μg/mL):亮氨酸100、賴氨酸100、色氨酸80、尿嘧啶30、組氨酸30,超凈臺(tái)過濾除菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

Phanta?Max Super-Fidelity DNA polymerase、HiScript?Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司;Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox),羿圣生物科技上海有限公司;Fast Digested TM快速限制性內(nèi)切酶,美國Thermo公司;T4 DNA連接酶、pY26質(zhì)粒,大連TaKaRa公司;氨芐青霉素、諾爾斯菌素、潮霉素, Sigma-Aldrich公司;Simply P 總RNA提取試劑盒,杭州博日科技股份有限公司;蛋白胨、酵母粉,索萊寶科技有限公司。

1.4 重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將平板活化得到的單克隆工程菌株挑取單菌落接種于裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(30 h左右)得到種子液,然后以體積分?jǐn)?shù)3%轉(zhuǎn)接于含50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),每隔12 h取樣測定。

1.5 β-胡蘿卜素的提取和產(chǎn)量測定

對發(fā)酵過程中提取的發(fā)酵液樣品進(jìn)行快速提取,具體方法如下所述:先配制β-胡蘿卜素標(biāo)樣梯度制作標(biāo)曲,之后分別各取兩等份1 mL發(fā)酵液,離心收集菌體,無菌水清洗后,其中一份菌體80 ℃烘干至恒重,稱重計(jì)算菌體干重;另一份用于產(chǎn)物提取。向待提取β-胡蘿卜素的離心管中加入等體積的玻璃珠(0.5 mm)和1 mL氯仿,振蕩破碎5 min,冰浴1 min,10 000 r/min離心1 min,取上清液直到樣品無色,合并上清液;用N2吹干至色素析出,1 mL丙酮復(fù)溶后用酶標(biāo)儀測定,計(jì)算產(chǎn)物濃度。

1.6 RT-qPCR測定目的基因相對表達(dá)量

首先,采用Simply P總RNA提取試劑盒提取總RNA;然后,將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)定量,使?jié)舛燃s在200 ng/μL左右,以cDNA為模板,以act1為內(nèi)參基因。之后采用SYBR Green Master Mix在熒光定量PCR儀檢測系統(tǒng)CFX96上進(jìn)行qPCR。其中退火溫度為60 ℃,條件如下:循環(huán)1次(95 ℃,5 min),循環(huán)40次(95 ℃,10 s;60 ℃,30 s),結(jié)束時(shí)采集數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCq法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量[13]。

1.7 β-胡蘿卜素定性檢測

將待測菌株平板劃線活化平后板單菌落接種到裝有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,30 ℃、200 r/min 搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)4 d后收集菌體,用無菌水洗滌兩次收集菌體后以三氯甲烷為溶劑提取色素,N2吹干為粉末狀,送往無錫瑞峰檢測技術(shù)有限公司檢測。

1.8 發(fā)酵罐發(fā)酵

工程菌在YPD板上劃線活化獲得單個(gè)菌落,將該單菌落置于含有100 mL YPD的500 mL搖瓶中,220 r/min,30 ℃,培養(yǎng)16～18 h。將2.5 L的YPD培養(yǎng)基置于5 L發(fā)酵罐中,0.5 mol/L硫酸和5 mol/L氨水的自動(dòng)加入使pH值恒定在6.5,氣流為2 vvm,發(fā)酵溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速500 r/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

在釀酒酵母中利用誘導(dǎo)型GAL啟動(dòng)子表達(dá)外源類胡蘿卜素合成酶效果更好[14]。本文利用含有GAL啟動(dòng)子的質(zhì)粒Ts-BY(GAL1prGAL10pr)和Ts-BR(GAL1prGAL10pr)通過SmaⅠ和Hind Ⅲ 酶切線性化,如圖1-a所示,醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室已有的釀酒酵母LFD18得到工程菌ZS19,涂布YPD平板發(fā)現(xiàn)平板上出現(xiàn)兩種顏色菌落,一種顏色偏紅命名為ZS19 reddish,一種橘紅色較淺命名為ZS19,如圖1-b所示。經(jīng)核磁共振定性檢測兩株菌落產(chǎn)物都是β-胡蘿卜素。將ZS19 reddish和ZS19分別挑取到裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中發(fā)酵96 h,結(jié)果偏紅菌株ZS19 reddish在84 h產(chǎn)量更高為160.4 mg/L,如圖1-c所示。

a-質(zhì)粒TS-BY(GAL1prGAL10pr)和TS-BR(GAL1prGAL10pr)通過Sma Ⅰ和Hind Ⅲ酶切電泳圖; b-ZS19 reddish和ZS19發(fā)酵84 h對比圖;c-ZS19 reddish和ZS19發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量圖1 構(gòu)建轉(zhuǎn)化片段的驗(yàn)證,ZS19 reddish和ZS19發(fā)酵84 h對比及發(fā)酵產(chǎn)量對比圖Fig.1 Build validation of the transformation fragment, Comparison of ZS19 reddish and ZS19 fermentation at 84 h and production concentration

2.2 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析

為了進(jìn)一步研究菌株ZS19 reddish和ZS19表現(xiàn)型差異的原因,分別挑取單菌落到裝有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,搖瓶培養(yǎng)72 h后收集5 mL菌體送樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測定。結(jié)果表明,ZS19 reddish對比ZS19共有84個(gè)基因發(fā)生下調(diào),12個(gè)基因上調(diào),如圖2-a所示。對上述差異基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果如圖3所示。轉(zhuǎn)錄水平變化的基因主要與各種生物過程有關(guān),如:生物調(diào)控(biological process)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)等。此外,與大分子復(fù)合體(macromolecular complex)、膜組分(membrane part)、催化活性(catalytic activity)等也密切相關(guān)。

根據(jù)上述結(jié)果,選取與葡萄糖代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝有關(guān)的hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等6個(gè)基因,進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,上述基因均發(fā)生顯著上調(diào),特別是hxk1上調(diào)125.2倍,hmg2上調(diào)31.3倍,結(jié)果如表3所示。

a-ZS19 reddish和ZS19顯著性差異比較圖;b-ZS19 reddish和ZS19差異情況火山圖圖2 ZS19 reddish和ZS19顯著性差異比較圖和差異情況火山圖Fig.2 Comparison of ZS19 reddish and ZS19 significant differences and volcanic map

圖3 ZS19 reddish和ZS19比較基因分類圖Fig.3 Comparison of ZS19 reddish and ZS19 gene ontology classification

表3 qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄結(jié)果Table 3 qPCR verify transcription results

2.3 β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌的改造

將hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2基因分別過量表達(dá),結(jié)果表明相比突變株ZS19 reddish β-胡蘿卜素產(chǎn)量有所下降,但菌株ZS19-DPP1、ZS19-LPP1、ZS19-HXK1、ZS19-FDH1細(xì)胞干重有明顯提高。并且上述4株菌生產(chǎn)性狀相比ZS19 reddish更為穩(wěn)定,平板傳代5次后,菌落仍然全部一致呈現(xiàn)橙紅色,而ZS19 reddish傳代5次后出現(xiàn)大量白色菌落。根據(jù)圖4的結(jié)果,hxk1、dpp1、lpp1和fdh1基因的發(fā)酵產(chǎn)量相對較高,而且細(xì)胞干重也有所提高,因此將這4個(gè)基因進(jìn)行聯(lián)合過表達(dá)得到的新菌株命名為ZS20。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明β-胡蘿卜素的產(chǎn)量在84 h達(dá)到194.3 mg/L,此時(shí)ZS19 reddish產(chǎn)量為154.7 mg/L,提高約26%;相比出發(fā)菌株ZS19提高約110%。后續(xù)可以嘗試將hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2基因進(jìn)行聯(lián)合過表達(dá)得到新的改造菌株,或者可以進(jìn)一步提高重組菌β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

a-各過表達(dá)菌株發(fā)酵產(chǎn)量;b-各過表達(dá)菌株發(fā)酵細(xì)胞干重圖4 過表達(dá)基因轉(zhuǎn)化菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量及干重Fig.4 Strain fermentation concentration and dry cell weight

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

使用上海迪必爾公司的5 L發(fā)酵罐,對重組菌ZS20進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為:溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速500 r/min,pH 6.5。2.5 L培養(yǎng)基高壓滅菌后降溫至30 ℃加入種子液,發(fā)酵總時(shí)長為96 h,發(fā)酵28 h時(shí)溶氧降至最低,此時(shí)開始以F1(0)為0.006進(jìn)行指數(shù)流加500 g/L葡萄糖至48 h(發(fā)酵罐體積因素),β-胡蘿卜素在84 h達(dá)到最高為259.8 mg/L,細(xì)胞干重在84 h為7.9 mg,單位產(chǎn)量為32.9 mg/g CDW。

對ZS20菌株進(jìn)行補(bǔ)加氨基酸發(fā)酵優(yōu)化,本研究以釀酒酵母YthmgⅠ菌株作為出發(fā)菌株構(gòu)建代謝改造重組菌,Ythmg1菌株中組氨酸、賴氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶被改造破壞,因此對ZS20菌株補(bǔ)加氨基酸培養(yǎng)。2.5 L培養(yǎng)基高壓滅菌后降溫至30 ℃,加入種子液并添加氨基酸補(bǔ)足液,發(fā)酵24.5 h時(shí)溶氧降至最低,此時(shí)以F1(0)為0.006進(jìn)行指數(shù)流加500 g/L葡萄糖到48 h,繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至96 h,發(fā)酵圖片如圖5-a所示;每12 h取樣后處理樣品提取β-胡蘿卜素后測產(chǎn)量在84 h達(dá)到最高為314.3 mg/L,相比優(yōu)化之前產(chǎn)量提高約21%,單位產(chǎn)量為38.8 mg/g CDW,結(jié)果如圖5-b所示;對胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行液相測定,葡萄糖和乙醇、乙酸、甘油等發(fā)酵副產(chǎn)物含量如圖5-c所示。

a-ZS20菌株發(fā)酵96 h發(fā)酵圖;b-ZS20菌株發(fā)酵產(chǎn)量及干重;c-ZS20菌株發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、乙酸和甘油質(zhì)量濃度圖5 葡萄糖指數(shù)流加發(fā)酵ZS20菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)物、干重及副產(chǎn)物測定Fig.5 Determination of dry weight and byproducts of β-carotene in ZS20 strain fermentation by glucose exponential flow

3 結(jié)論與討論

釀酒酵母是生產(chǎn)類胡蘿卜素的常用底盤微生物之一,研究重點(diǎn)主要集中在代謝中心節(jié)點(diǎn)乙酰CoA的合成、前體甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑的優(yōu)化以及下游異源途徑的優(yōu)化等,但類胡蘿卜素作為一種外源產(chǎn)物其代謝調(diào)控方式仍有待進(jìn)一步研究。本研究通過同時(shí)過量表達(dá)hxk1、dpp1、lpp1和fdh1使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高26%。本論文過量表達(dá)的己糖激酶1(hxk1),可以磷酸化葡萄糖、果糖和甘露糖,在微生物利用葡萄糖生長方面是不可缺少的,調(diào)控糖代謝在細(xì)胞生長過程中起著重要作用[15]。甲基乙二醛還原酶由gre2(yol151w)編碼[16]。hmg2編碼酵母中羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的兩個(gè)同工酶之一,HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲戊酸[17],與MVA途徑緊密相關(guān),這種酶的抑制會(huì)導(dǎo)致甲羥戊酸下游所有產(chǎn)物的合成減少,包括膽固醇[18]。dpp1(二?；视徒沽姿崃姿崦?基因編碼DGPP磷酸酶,在釀酒酵母中轉(zhuǎn)化含有dpp1基因的多拷貝質(zhì)粒使DGPP磷酸酶活性提高10倍,DGPP磷酸酶是釀酒酵母中的一種膜相關(guān)的34-kDa酶,它催化DGPP去磷酸化生成磷酸酯(phosphate ester,PA),再催化PA去磷酸化生成二?；视蚚19]。lpp1編碼的脂質(zhì)磷酸酶產(chǎn)物是一種膜相關(guān)酶,可催化Mg2+PA、二?；视徒沽姿?diazanium,[[(2R)-2,3-di(octanoyloxy)propoxy]-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate,DGPP)和溶血磷酸酯(lysophosphatidic acids,LPA)的獨(dú)立去磷酸化[12],與脂質(zhì)載體的合成有關(guān)。以上基因或與底物代謝有關(guān),或與MVA途徑和脂質(zhì)載體的合成緊密相關(guān),因此對β-胡蘿卜素合成具有重要影響。

值得一提的是雖然分別過量表達(dá)hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2后β-胡蘿卜素產(chǎn)量反而下降,但其菌體量相比ZS19有顯著提高。對hxk1、dpp1、lpp1和fdh1進(jìn)行同時(shí)過量表達(dá)β-胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高,有可能與dpp1、lpp1的過量表達(dá)增加了細(xì)胞脂質(zhì)體含量,可以降低產(chǎn)物毒性,提高了細(xì)胞干重有關(guān)。酵母代謝調(diào)控系統(tǒng)龐大復(fù)雜,長期以來大量的代謝途徑調(diào)控依賴過量表達(dá)和基因敲除,難以實(shí)現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)調(diào)控[20],后續(xù)可以利用啟動(dòng)子調(diào)控、反義RNA調(diào)控和基于CRISPR-Cas9的代謝途徑精準(zhǔn)調(diào)控等策略,精準(zhǔn)調(diào)控hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2等基因的表達(dá),并進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法等使β-胡蘿卜素產(chǎn)量繼續(xù)提高。接下來可以把hxk1、dpp1、lpp1、fdh1、hmg2和gre2同時(shí)過表達(dá),或許都可以使β-胡蘿卜素產(chǎn)量繼續(xù)提高,之后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化,分批補(bǔ)料優(yōu)化等策略;同時(shí)可以通過進(jìn)一步PATHWAY分析,研究與產(chǎn)物合成相關(guān)的代謝途徑及其調(diào)控,進(jìn)一步提高重組菌β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。