基于網(wǎng)絡藥理學與實驗探討裘氏內(nèi)異方治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制

李 慧 楊華娣 毛佩瑜 張 婷 陸申奕 葉恬恬

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦科常見疾病，發(fā)病機制不明，主要表現(xiàn)為嚴重的盆腔疼痛、痛經(jīng)和生育能力低下，20%～50%的不孕癥婦女合并EMs，71%～87%的慢性盆腔疼痛婦女患有EMs，EMs 可使上皮性卵巢癌的發(fā)病風險增加50%，給女性的身體健康和家庭和諧帶來嚴重影響[1-2]。腹腔鏡或剖腹手術是EMs 的診斷“金標準”及首選療法，雖能取得一定臨床療效，但無法完全清除深層病灶組織，特別對于深部浸潤型EMs 患者，手術創(chuàng)傷大，術后復發(fā)率高[2]。激素療法對EMs 的療效相對較差[3]。EMs 在中醫(yī)學根據(jù)臨床特點歸屬于“痛經(jīng)”“癥瘕”、“不孕”等病之中。首批國家級名老中醫(yī)、國家突出貢獻專家裘笑梅先生行醫(yī)于錢塘一帶，于臨證治療中審因論證，創(chuàng)立治療EMs 的代表性方藥——裘氏內(nèi)異方，并已于臨床應用數(shù)十余年，治療病例數(shù)萬例，具有確切的療效[4-6]。但具體的作用機制尚不明確。本研究通過超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-Q/TOF-MS）聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學篩選裘氏內(nèi)異方治療EMs 的有效活性成分和有效作用靶點，預測裘氏內(nèi)異方干預EMs 的可能機制，并應用動物模型實驗來驗證潛在靶點和作用機制，以明確裘氏內(nèi)異方治療EMs 的合理性和實用性。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 裘氏內(nèi)異方（忍冬藤、紅藤各15 g，白毛藤10 g，延胡索15 g，赤芍12g，山楂15 g，大麥芽30 g，半枝蓮、川牛膝各15 g，白花蛇舌草10 g，紫丹參20 g，香茶菜、山海螺、威靈仙各15 g，淫羊藿12 g），由中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)方法煎煮2 次，第1 次加10 倍量水，第2 次加8 倍量水，分別提取1 h，紗布過濾，濃縮至原藥材濃度為0.63、1.25、2.5 g/mL 混懸液，分裝，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。裘氏?nèi)異方供試品溶液制備：取原藥液0.5 mL，加0.5 mL 超純水稀釋，渦旋1 min；取0.5 mL 稀釋液，再加0.5 mL 甲醇，渦旋1 min，14 000 r/min 離心20 min，取上清液。孕三烯酮膠囊（北京紫竹藥業(yè)公司，2.5 mg/粒，批號：H19980020）。取1 粒孕三烯酮膠囊，將內(nèi)容物加50 mL 純水溶解，配制成0.05 g/mL藥液。

1.2 動 物 6～8 周齡雌性SD 大鼠60 只，體質量（180～220）g，由上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0009。在浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司實驗動物中心進行試驗，動物實驗條件合格證號：SYXK（浙）2021-0033。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～26 ℃，空氣濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替，換風次數(shù)15～20 次/h，飼養(yǎng)3～5 d。本研究遵循國家制訂的實驗動物管理與使用指南，動物實驗倫理審查批準號：ZJEY-20220630-02。

1.3 主要試劑及儀器 蘇木素（sigma，批號：H3136）；血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA） 抗體（Affinity，批號：AF5131）；絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1） 抗體（Affinity，批號：AF0836）；磷酸化AKT1（p-AKT1）（Thr308）抗體（ffinity，批號：AF0832）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）p85 alpha 抗體（Affinity，批號：AF6241）；磷 酸 化PI3K （p-PI3K）p85 alpha（Tyr607）抗體（Affinity，批號：AF3241）；抗兔二抗IgG，HRP-linked 抗體（CST，批號：7074）；抗鼠二抗IgG，HRP-linked 抗 體（CST，批 號：7076）；SYBR Green qPCR 試劑盒（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，貨號：11201ES08）；EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，B618583-0100）。SCIEX X-500R 四級桿飛行時間質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；TurboIonSpray 離子源（美國AB SCIEX 公司）；Waters ACQUITY I-Class Plus UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國沃特斯公司）；Thermo ST40R 低溫高速離心機（美國賽默飛公司）；IKA 微型渦旋混合儀（德國艾卡公司）；AUW220D 電子天平（日本島津公司）；低溫高速離心機（Thermo，Micro17R）；正置光學顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse Ci-L）；羅氏LightCycler 96 實時熒光定量PCR 儀（羅氏，LightCycler 96）；mRNA 定量儀（Thermo Scientific，Nanodrop one）。

1.4 方 法

1.4.1 網(wǎng)絡藥理學分析

1.4.1.1 網(wǎng)絡藥理學分析數(shù)據(jù)庫與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，檢索時間：2022 年5 月6 日）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/，檢 索 時 間：2022 年5 月17 日）；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http://www.omim.org/，檢索時間：2022 年5 月12 日）；蛋白質數(shù)據(jù)庫（UniProt，http://www.uniprot.org/uploadlists/，檢索時間：2022 年5 月17 日），Dis－GeNET 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.disgenet.org/）；DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）；Venny2.1.0數(shù) 據(jù) 庫（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；STRING 網(wǎng)站（https://string-db.org/）；生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/，檢索時間：2022 年5 月26 日）。

1.4.1.2 裘氏內(nèi)異方有效活性成分篩選 通過UPLCQ/TOF-MS 結合文獻檢索篩選出裘氏內(nèi)異方有效活性成分。

1.4.1.3 裘氏內(nèi)異方有效活性成分的靶標及EMs 相關靶點基因的獲取 在TCMSP 數(shù)據(jù)中分別以裘氏內(nèi)異方有效活性成分作為關鍵詞進行檢索，獲取其作用靶標。利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Human（人類）”檢索對應的基因靶標。以“Endometriosis”為關鍵詞在DisGeNET、DRUGBANK、GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索EMs 相關的靶標基因。

1.4.1.4 裘氏內(nèi)異方有效活性成分-EMs 共同靶標的獲取 將裘氏內(nèi)異方有效活性成分對應的靶標基因與EMs 相關靶標基因進行比對，篩選出共同靶標基因。

1.4.1.5 “藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡”構建 維恩分析獲得藥物與疾病的共同靶點，用圖形化顯示網(wǎng)絡并進行分析和編輯的軟件（Cytoscape 3.8.0）繪制“藥物活性成分-靶點”網(wǎng)絡，分析網(wǎng)絡特征。

1.4.1.6 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建與核心靶點的篩選 在蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫（STRING https://stringdb.org/）輸入裘氏內(nèi)異方有效活性成分與EMs 的共同靶點，構建靶點-靶點相互作用網(wǎng)絡圖，分析網(wǎng)絡特征。

1.4.1.7 KEGG 通路富集分析 將共同靶標基因導入DAVID 中，進行KEGG 通路富集分析，得到通路富集結果。選取P＜0.01 生物過程和通路，并且按照基因富集數(shù)從大到小篩選出排列前20 名的生物過程和通路。檢索文獻，篩選出可能的裘氏內(nèi)異方治療EMs 的通路。

1.4.2 動物實驗驗證

1.4.2.1 動物模型制備 依據(jù)既往課題EMs 模型大鼠造模經(jīng)驗[7]，將雌性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d 后，戊酸雌二醇（0.2 mg/kg 體質量）灌胃，每日1 次，連續(xù)3 d，使各組大鼠動情期趨于一致（進行陰道涂片，可見大量無核角化細胞）。末次給戊酸雌二醇后禁食12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，備皮后開腹，結扎并剪取大鼠左側子宮約0.5 cm，將子宮于無菌生理鹽水中縱向剪開，以可吸收手術絲線訂于腹壁上（內(nèi)膜貼向腹壁），關腹。術后腹腔注射頭孢呋辛鈉抗感染，每日1次，連續(xù)5 d。4 周后，大鼠麻醉再次開腹，觀察子宮內(nèi)膜移植部位，若見到內(nèi)膜生長為透明囊泡，內(nèi)有液體積聚，則為造模成功。另設假手術組，僅開腹后剪去子宮周圍脂肪組織，關腹。

1.4.2.2 分組給藥 將假手術組（正常組）大鼠和成模的造模組（共60 只）大鼠按照隨機數(shù)表法分為正常組、模型組、孕三烯酮組和裘氏內(nèi)異方高（QNY-H組，2.5 g/mL 藥液灌胃）、中（QNY-M 組，1.25 g/mL 藥液灌胃）、低劑量組（QNY-L 組，0.63 g/mL 藥液灌胃），每組10 只，正常組和模型組予生理鹽水（10mL/kg）灌胃，每日1 次；孕三烯酮組予孕三烯酮藥液0.26 mg/kg 灌胃，每周2 次，每次1 mL，其余時間點予生理鹽水10 mL/kg 灌胃，連續(xù)4 周。測定異位內(nèi)膜面積變化后用眼科剪剪取異位子宮內(nèi)膜組織及正常組大鼠子宮內(nèi)膜，取部分內(nèi)膜組織立即放入10%中性甲醛中固定，剩余內(nèi)膜組織迅速放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2.3 子宮異位內(nèi)膜面積及Di Paola R 評分測定末次給藥后，大鼠禁食12 h，稱重。皮下注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，開腹，以游標卡尺分別測量異位內(nèi)膜長徑，短徑；以子宮內(nèi)膜異位病灶體積（mm3）=1/2×長徑×短徑2，比較不同組間異位內(nèi)膜面積變化。根據(jù)Di Paola R 評分系統(tǒng)[8]計算子宮內(nèi)膜異位病變的粘連評分。粘連評分：無病變，計0 分；粘連累及宮腔體積＜1/3，膜性粘連，計1 分；粘連累及宮腔體積＜2/3，肌性粘連，計2 分；粘連累及宮腔體積＞2/3，肌性粘連，計3 分；粘連累及宮腔體積＞2/3，結締組織性粘連，計4 分。

1.4.2.4 病理形態(tài)學觀察 切除異位內(nèi)膜，去除周圍脂肪組織，隨后進行多聚甲醛固定-石蠟包埋-切片-蘇木精-伊紅染色處理，光鏡下觀察異位內(nèi)膜細胞顯微結構，電鏡觀察異位內(nèi)膜細胞超微組織學結構。

1.4.2.5 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGFA 蛋白表達水平測定 采用商品化定量Western blot 化學發(fā)光試劑盒和PVDF 膜檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-Akt、VEGFA 蛋白水平，嚴格按照說明書操作步驟進行操作。

1.4.2.6 qRT-PCR 檢測子宮異位內(nèi)膜組織PI3K、AKT mRNA 的表達水平 Trizol 法提取組織總RNA，逆轉錄后，實時定量PCR 檢測各組異位內(nèi)膜中PI3K、AKT mRNA 的表達，qRT-PCR 所用引物序列信息見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

表1 引物序列

1.4.2.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間計量資料若符合正態(tài)分布且符合方差齊性檢驗，用One-way-ANOAY 單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Turkey 檢驗；若符合正態(tài)分布但方差不齊，則采用Dunnett’s T3 檢驗或獨立樣本t 檢驗；若不符合正態(tài)分布，則采用Kruskal-Wallis H 檢驗。顯著性水平α=0.05。所有數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 網(wǎng)絡藥理學預測

2.1.1 裘氏內(nèi)異方有效活性成分 對裘氏內(nèi)異方供試品溶液進UHPLC-Q/TOF-MS 系統(tǒng)分析，得到復方提取液總離子流圖，通過與SCIEX OS 軟件自帶的中藥二級數(shù)據(jù)庫中化合物TCM MS/MS Library 的一級精確質量數(shù)、同位素分布比和MS/MS 比較與篩選，在正離子模式下歸屬色譜峰64 個，在負離子模式下歸屬色譜峰52 個，見圖1。結合文獻檢索獲得裘氏內(nèi)異方的主要活性成分共19 個，見表2。

圖1 超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用技術總離子流圖（正負模式）

表2 裘氏內(nèi)異方水煎劑可能的治療EMs 的活性成分

2.1.2 裘氏內(nèi)異方有效活性成分對應的靶標基因及EMs 靶標基因 在TCMSP 上檢索篩選出的19 個裘氏內(nèi)異方主要活性成分對應的靶標共240 個，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶標轉換為靶標基因。從Dis－GeNET、DRUGBANK、GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得了3816 個EMs 的相關靶標基因。

2.1.3 藥物與疾病的共同靶標基因 將裘氏內(nèi)異方有效活性成分對應的靶標基因與EMs 相關靶標基因進行比對，篩選出共同靶標基因132 個，通過微生信網(wǎng)站繪制VENN 圖，見圖2。

圖2 藥物靶點與疾病靶點VENN 圖

2.1.4 “活性成分-作用靶點”可視化網(wǎng)絡分析 將19 個活性成分及132 個交集靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建成分-靶點網(wǎng)絡圖，并刪除與網(wǎng)絡圖連接不緊密的節(jié)點，結果顯示19 種活性成分協(xié)同作用于132 個調(diào)節(jié)靶點，體現(xiàn)了裘氏內(nèi)異方的多成分、多靶點的作用特點，見圖3。

圖3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡

2.1.5 PPI 網(wǎng)絡構建 將裘氏內(nèi)異方可能治療EMs的132 個作用靶標導入STRING 數(shù)據(jù)庫，設置置信度得分（confidence score）為0.900，獲取相互作用關系，見圖4。統(tǒng)計其連接數(shù)，排序前20 的基因見圖5。

圖4 裘氏內(nèi)異方治療心EMs 的核心作用靶點PPI 圖

圖5 PPI 中的核心基因

2.1.6 KEGG 通路富集分析 將共同靶標基因導入DAVID 中，進行KEGG 通路富集分析，得到通路富集結果。選取P＜0.001 生物過程和通路，并且按照基因富集數(shù)從大到小篩選出排列前20 名的生物過程和通路，見圖6。結合文獻檢索，發(fā)現(xiàn)PI3K 信號通路可能是裘氏內(nèi)異方治療EMs 主要作用機制之一。

圖6 裘氏內(nèi)異方有效活性成分作用靶點的KEGG 通路富集分析

2.2 動物實驗驗證

2.2.1 裘氏內(nèi)異方對子宮異位內(nèi)膜體積及Di Paola R 評分結果的影響 與正常組比較，模型組大鼠子宮異位內(nèi)膜體積和Di Paola R 評分均顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，孕三烯酮組和裘氏內(nèi)異方高、中、低劑量組大鼠子宮異位內(nèi)膜體積和Di Paola R評分均顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），可見表3、圖7。

圖7 大鼠異位內(nèi)膜面積變化情況

表3 各組大鼠異位內(nèi)膜體積及Di Paola R 評分比較（±s）

表3 各組大鼠異位內(nèi)膜體積及Di Paola R 評分比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別正常組模型組孕三烯酮組裘氏內(nèi)異方高劑量組裘氏內(nèi)異方中劑量組裘氏內(nèi)異方低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10異位內(nèi)膜體積（mm3）0.00±0.00 136.03±11.07a 45.50±10.93c 52.34±13.71c 87.36±9.09c 110.59±13.27b Di Paola R 評分（分）0.00±0.00 3.40±0.55a 1.00±0.71c 1.40±0.55c 1.80±0.84c 2.00±0.71b

2.2.2 裘氏內(nèi)異方對子宮異位內(nèi)膜病理形態(tài)的影響HE 染色結果顯示，正常組大鼠子宮結構基本正常，上皮細胞排列基本整齊、致密，模型組大鼠子宮結構遭到破壞，上皮細胞排列不規(guī)則，部分出現(xiàn)脫落，間質細胞結構疏松，組織間隙增大；與模型組比較，孕三烯酮組和裘氏內(nèi)異方高、中、低劑量組大鼠子宮組織在損傷、間隙增大、間質細胞疏松等情況上均有顯著改善，改善程度從高到低依次為：孕三烯酮組和裘氏內(nèi)異方高劑量組＞裘氏內(nèi)異方中劑量組＞裘氏內(nèi)異方低劑量組，見圖8；與正常組比較，模型組大鼠子宮HE 評分顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，孕三烯酮組、裘氏內(nèi)異方高、中、低劑量組大鼠子宮的HE 評分均顯著下降（P＜0.01 或P＜0.05），見表4。

圖8 各組大鼠子宮病理學改變（HE 染色，200 倍：100μm，400 倍：50μm）

表4 各組大鼠子宮HE 染色評分比較（分，±s）

表4 各組大鼠子宮HE 染色評分比較（分，±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別正常組模型組孕三烯酮組裘氏內(nèi)異方高劑量組裘氏內(nèi)異方中劑量組裘氏內(nèi)異方低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 HE 染色評分0.33±0.58 4.00±0.00a 1.33±0.58c 1.33±0.58c 1.67±0.58c 2.33±0.58b

2.2.3 裘氏內(nèi)異方對大鼠異位內(nèi)膜組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-Akt、VEGFA 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT、VEGFA 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 蛋白表達水平顯著性降低（P＜0.01）；與模型組比較，孕三烯酮組、裘氏內(nèi)異方高劑量組、裘氏內(nèi)異方中劑量組和裘氏內(nèi)異方低劑量組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT、VEGFA 蛋白表達水平均降低（P＜0.05 或P＜0.01），p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 蛋白表達水平均升高（P＜0.05 或P＜0.01），孕三烯酮組和裘氏內(nèi)異方高劑量組作用更顯著，見圖9、表5。

圖9 內(nèi)膜組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、VEGFA 蛋白表達條帶圖

表5 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGFA 蛋白表達水平比較（±s）

表5 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGFA 蛋白表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K 為磷酸化PI3K；AKT 為絲氨酸/蘇氨酸激酶；p-AKT 為磷酸化AKT；VEGFA 為血管內(nèi)皮生長因子A

組別正常組模型組孕三烯酮組裘氏內(nèi)異方高劑量組裘氏內(nèi)異方中劑量組裘氏內(nèi)異方低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 PI3K 1.00±0.13 2.10±0.12a 1.42±0.16c 1.39±0.16c 1.54±0.32b 1.56±0.17b AKT 1.00±0.14 3.67±0.24a 1.78±0.39c 1.72±0.33c 2.20±0.16b 2.64±0.12b VEGFA 1.00±0.24 2.49±0.05a 1.27±0.08c 1.32±1.56c 1.61±0.22b 1.91±0.19b p-PI3K/PI3K 0.89±0.13 0.24±0.05a 0.87±0.04c 0.81±0.04c 0.56±0.06b 0.41±0.04b p-AKT/AKT 0.93±0.14 0.26±0.02a 0.89±0.13c 0.84±0.03c 0.61±0.04b 0.52±0.03b

2.2.4 裘氏內(nèi)異方對大鼠異位內(nèi)膜組織PI3K、Akt mRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組異位內(nèi)膜組織中PI3K、Akt mRNA 的表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，孕三烯酮組、裘氏內(nèi)異方高劑量組、裘氏內(nèi)異方中劑量組、裘氏內(nèi)異方低劑量組異位內(nèi)膜組織中PI3K、Akt mRNA 的表達水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表6。

表6 各組PI3K、AKT mRNA 表達水平比較（±s）

表6 各組PI3K、AKT mRNA 表達水平比較（±s）

注：PI3K 為；AKT 為；與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別正常組模型組孕三烯酮組裘氏內(nèi)異方高劑量組裘氏內(nèi)異方中劑量組裘氏內(nèi)異方低劑量組孔數(shù)333333 PI3K/GAPDH 1.00±0.07 2.91±0.21a 1.30±0.08c 1.35±0.04c 1.597±0.16c 2.34±0.25c Akt/GAPDH 1.00±0.09 1.96±0.18a 1.16±0.12c 1.14±0.11c 1.26±0.13c 1.59±0.14b

3 討 論

EMs 的發(fā)生與激素、免疫、炎癥、基因、表觀遺傳學、血管新生等有關，發(fā)病機制復雜，治療難度大，因此，在深入研究EMs 的發(fā)病機理同時，尋找有效的藥物治療靶點，具有重要的臨床意義。江浙一帶多雨多濕，濕郁化熱致瘀熱內(nèi)阻，故江浙錢塘地區(qū)患者多以瘀熱互結為主證，治療多以清化瘀熱為主，兼顧扶正[9]。裘氏內(nèi)異方是浙派裘氏婦科治療EMs 的代表方劑，方中忍冬藤、紅藤、白毛藤，三藤合用清熱解毒、活血祛瘀和通絡散結之效強，為君藥；延胡索、大麥芽、炒山楂、川牛膝活血散結、行滯逐瘀止痛，四者合用共助化瘀止痛之效，為臣藥；赤芍、香茶菜、山海螺、白花蛇舌草、半枝蓮解毒消腫，活血散瘀，紫丹參養(yǎng)血調(diào)經(jīng)安神，活血祛瘀止痛，《婦科明理論》中有“一味丹參，功同四物”之說，共為佐藥；威靈仙、淫羊藿溫陽通脈、辛散能走，并能引領諸藥直達病所，為使藥。綜觀全方，寒熱并用，氣血兩調(diào)，藥專力強，共同發(fā)揮清化逐瘀的功效，從而瘀消濕祛熱清，氣行血暢痛止。裘氏內(nèi)異方臨床療效確切，但機制未明，故本研究結合網(wǎng)絡藥理學和實驗驗證來研究裘氏內(nèi)異方治療EMs 的分子機制。

3.1 網(wǎng)絡藥理學分析 網(wǎng)絡藥理學是目前廣泛用來預測復方中藥治療機制的方法之一。在臨床實際中，復方中藥主要是通過水煎劑口服的方式達到治療作用，但復方水煎劑在煎煮過程中部分藥材中的化學成分未能轉移到湯劑中，或者在多種成分的協(xié)同作用下，部分化學成分的生物利用度發(fā)生改變，從而使得水煎劑的化學成分并不是簡單的生藥活性成分的相加[10]。而目前多數(shù)文獻中中藥網(wǎng)絡藥理學研究指標均以各數(shù)據(jù)庫中收集的生藥化學成分及其口服生物利用度為篩選條件，使得網(wǎng)絡藥理學預測結果可能存在偏差[11]?？紤]到藥效成分對研究結果準確性的重要影響，本研究采用UHPLC-Q/TOF-MS，結合文獻檢索篩選出木犀草苷、槲皮素、柚皮素、延胡索甲素、淫羊藿苷、葛根素、漢黃芩素等19 種裘氏內(nèi)異方水煎劑有效活性成分，大多具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化應激及免疫調(diào)節(jié)等作用[12-14]。槲皮素可通過下調(diào)封閉蛋白6（CLDN6）表達，抑制整合素鏈接激酶（ILK）信號通路，抑制子宮異位內(nèi)膜生長[15]；淫羊藿苷可降低血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）與異位組織中的核因子-κB（NF-κB）與磷酸化NF-κB（p-NF-κB）的水平，使異位內(nèi)膜組織中黏膜上皮變薄、腺體減少、移植萎縮異位內(nèi)膜[16]。木犀草苷和山柰酚具有調(diào)節(jié)脂代謝異常、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等多種功效[17]。葛根素具有止痛、抗癌、抗炎的作用[18]。有研究表明葛根素可抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化，競爭性結合雌激素受，降低環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達，從而抑制異位內(nèi)膜細胞增殖[19]。通過構建PPI 網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)AKT1、IL-6、VEGFA、Jun（JUN）等靶點“Degree”值最高，這些靶點在裘氏內(nèi)異方治療EMs 的生物過程中可能起到關鍵作用。AKT1 是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶的基因，參與細胞存活、生長、增殖等生物過程，其可通過降低細胞凋亡率促進細胞存活[20]；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種強效特異性血管生成因子，可直接作用于內(nèi)皮細胞而促進血管新生，加快在位子宮內(nèi)膜異常轉移及異位子宮內(nèi)膜的增生[21]；IL-6 是參與機體免疫應答、具有廣泛免疫調(diào)節(jié)的促炎細胞因子，具有促進異位內(nèi)膜及間質細胞的增殖、侵襲、轉移及促進血管生成的作用，可導致盆腔局部組織黏連及纖維化，促使EMs 異位子宮內(nèi)膜病灶的形成[22]。因此裘氏內(nèi)異方可能通過抑制炎性因子、免疫調(diào)節(jié)以及抑制血管新生來治療EMs，在后續(xù)研究中可著重關注此類生物活性物質治療EMs 中的相關作用機制。通過KEGG 通路富集分析的結果可知，EMs 與炎癥、雌激素、癌癥等多條通路關系密切，其中PI3K/AKT 通路為靶點富集最多的通路，該通路可被多種細胞因子激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞轉錄、翻譯和存活的功能。PI3K 被激活后，催化產(chǎn)生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），引發(fā)AKT 磷酸化，磷酸化的AKT 可通過增加異位內(nèi)膜細胞的增殖及其在纖維化微環(huán)境中的維持，從而促進內(nèi)異癥的發(fā)生[23]；諸多研究已經(jīng)證實PI3K-AKT 通路在EMs 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，該途徑的激活可誘導血管內(nèi)皮細胞生長，異位內(nèi)膜細胞增殖和侵襲能力增強，加速EMs 的發(fā)展進程[24-26]。因此本研究推測裘氏內(nèi)異方可能通過干預PI3K-AKT 信號通路治療EMs。

3.2 動物試驗分析 結合本實驗數(shù)據(jù)顯示，裘氏內(nèi)異方各劑量均可縮小EMs 大鼠子宮異位內(nèi)膜面積，降低Di Paola R 評分、子宮HE 評分及PI3K、AKT、VEGFA 蛋白表達水平，其中以高劑量組作用更加顯著。說明抑制PI3K-AKT 通路可能是裘氏內(nèi)異方的治療機制，且效果與其劑量正相關。初步證實了網(wǎng)絡藥理學的預測結果具有一定的科學性。

綜上所述，本研究對裘氏內(nèi)內(nèi)異方治療EMs 的成分、靶點和作用機制進行了預測和驗證。闡明了裘氏內(nèi)異方多成分、多靶點、多通路治療EMs 的作用特點，研究結果明確了裘氏內(nèi)異方治療EMs 的合理性和實用性，為裘氏內(nèi)異方臨床新應用、新型中藥制劑研發(fā)和進一步的實驗研究提供理論依據(jù)和參考，有助于裘氏內(nèi)異方臨床治療EMs 的推廣應用。但由于網(wǎng)絡藥理學本身所具有的局限性以及中藥、疾病靶標眾多等諸多元素，本研究獲得的結果可能存在一定的偏差，因此課題組后期將圍繞物質基礎-藥效學評價-機制驗證等開展進一步研究。