槲芪方加減對(duì)肝癌化療栓塞術(shù)后大鼠一氧化氮合酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、乏氧及免疫功能的影響

孔慶旭,陳桂云,陳自力,李 俊

(1.鐘祥市中醫(yī)院,湖北 鐘祥 431900;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,安徽 合肥230032)

肝癌在臨床上較為常見,主要是由肝細(xì)胞等發(fā)生癌變引發(fā)的惡性腫瘤,其發(fā)病率及病死率均較高[1]。在我國(guó)肝癌主要由乙型肝炎誘發(fā),早期多以肝移植的方法進(jìn)行治療,中晚期多采用肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù) (Hepatic artery chemoembolization,TACE)治療[2]。TACE創(chuàng)傷小,但臨床發(fā)現(xiàn)單純進(jìn)行TACE治療未能完全消滅腫瘤細(xì)胞,有近95%的腫瘤胞膜外可見到殘存的腫瘤細(xì)胞,殘留病灶通過(guò)得到新的供血、供氧繼續(xù)生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移[3]。有學(xué)者認(rèn)為這一現(xiàn)象與腫瘤乏氧微環(huán)境有關(guān)[4]。多種因子參與血管新生與乏氧過(guò)程,其中一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular epidermal growth factor,VEGF)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞供氧、供血的作用,加快腫瘤生長(zhǎng)[5-6]。另外有研究發(fā)現(xiàn)[7]TACE術(shù)后還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低。在腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展的過(guò)程當(dāng)中,免疫系統(tǒng)通過(guò)多種途徑發(fā)揮著腫瘤細(xì)胞殺傷作用,其中T淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)對(duì)免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞,維持機(jī)體免疫平衡,其一方面幫助機(jī)體對(duì)抗疾病,另一方面抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。在TACE術(shù)后免疫功能降低,會(huì)使機(jī)體對(duì)抗疾病的能力降低并增加腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。因此,尋找改善局部乏氧狀態(tài)、免疫功能,抗血管新生以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的藥物對(duì)于TACE術(shù)后治療至關(guān)重要。中醫(yī)認(rèn)為肝癌屬于“肝積”“臌脹”范疇,以本虛標(biāo)實(shí)為病機(jī),因虛致病,因邪致實(shí),具體表現(xiàn)為肝郁脾腎氣血虛、痰濕疫毒殘未盡[8]。槲芪方是由錢英教授總結(jié)出的治療肝癌的中藥方,具有滋補(bǔ)肝腎、和血調(diào)肝、益氣健脾、祛風(fēng)利濕和解毒通絡(luò)的作用,與上述肝癌病機(jī)相契合。目前已有研究證實(shí)槲芪方對(duì)于治療肝癌動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后患者效果顯著,但具體作用機(jī)制尚未完全掌握,基于此,本實(shí)驗(yàn)研究槲芪方加減對(duì)肝癌化療栓塞術(shù)后大鼠iNOS、VEGF、乏氧及免疫功能的影響,為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞：肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。SPF級(jí)SD雄性大鼠,購(gòu)自蘇州市顧秀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備公司,許可證號(hào)SCXK(蘇)-2021-0203,本次實(shí)驗(yàn)已通過(guò)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào)20210204。

1.1.2 藥物：槲芪方由槲寄生、黃芪、白花蛇舌草各30 g,丹參20 g,莪術(shù)6 g等藥物組成。槲芪方藥材均購(gòu)自亳州市六順堂藥業(yè)有限公司,由我院中醫(yī)室煎制。

1.1.3 試劑與儀器：全自動(dòng)生化分析儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào)Pinnacle),流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司,型號(hào)CytoFLEX ),蘇木素-伊紅染色液(上海古朵生物科技有限公司,貨號(hào)GD-K4042),TUNEL試劑盒、HIF-1α、VEGF(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào)GS0248、YT788-TUV、YT848-SNU),iNOS一抗(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司,貨號(hào)GD-A079581),辣根過(guò)氧化物酶二抗(上海研卉生物科技有限公司,貨號(hào)127-035-099)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立、分組及干預(yù)：于50只大鼠中隨機(jī)抽取12只作為健康組進(jìn)行對(duì)照,37只大鼠建立肝癌模型。取1只小鼠,將瘤株注入小鼠腹部,7～10 d腹水形成后,傳代備用。取1只大鼠,麻醉后將0.5 ml(約5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞)的傳代腹水注入大鼠體內(nèi),10 d后長(zhǎng)出1.5 cm的腫瘤結(jié)節(jié),后麻醉大鼠去除結(jié)節(jié),剪成約1 mm3的小塊備用。將需建模的大鼠備皮,于腹部正中切開,暴露肝左葉,切開部分肝組織等并擴(kuò)張肝內(nèi)切口,止血后將一小塊腫瘤結(jié)節(jié)置入,止血后將肝臟送回原位并關(guān)腹,縫合。術(shù)后,將大鼠安置于安靜、舒適的飼養(yǎng)籠里。建模過(guò)程中意外死亡1只大鼠,剩余36只大鼠建模成功,隨機(jī)分為模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組以及聯(lián)合組,每組12只。肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組大鼠給予肝動(dòng)脈栓塞治療[9]：將自制的微導(dǎo)管插入肝動(dòng)脈內(nèi),注入5-Fu 20 mg/kg,加超液態(tài)碘油0.5 ml/kg,術(shù)后拔管,縫合,消毒,分籠飼養(yǎng)。聯(lián)合組：根據(jù)人與動(dòng)物用藥量換算公式,在肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組基礎(chǔ)上給予模型大鼠27 ml/kg槲芪方灌胃,2次/d,共24周[10]。健康組與模型組大鼠給予同體積 0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠肝功能指標(biāo)水平：末次治療后,取各組大鼠頸動(dòng)脈血5 ml,3000 r/min(半徑10 cm)離心15 min,取上清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (Aspartate transaminase,AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠免疫功能指標(biāo)水平：干預(yù)結(jié)束后取各組大鼠頸動(dòng)脈血5 ml,提200 μl外周血單核細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入刺激劑佛波醇乙酯、離子霉素、莫能霉素等工作液混勻,常規(guī)培養(yǎng)6 h,PBS清洗,離心5 min,800 r/min,離心半徑10 cm,收集細(xì)胞,加入5 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD3+、CD4+、CD8+并檢測(cè)其水平,具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理變化：取各組大鼠肝組織,甲醛固定,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、常規(guī)切片,蘇木素伊紅(HE)染色,進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.2.5 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)各組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡：取各組大鼠肝組織石蠟切片脫蠟,加入蛋白酶工作液,常溫孵育15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后加入TUNEL液,常溫?zé)o光孵育1 h,PBS清洗,加50 μl convertr-POD,無(wú)光孵育0.5 h。PBS清洗,3,3-二氨基苯聯(lián)胺液顯色,PBS沖洗,蘇木素復(fù)染,脫水透明,封片。熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)發(fā)熒光的陽(yáng)性細(xì)胞。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠VEGF、iNOS、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)：肝組織采用0.125%胰蛋白裂解液,勻漿,4000 r/min離心后,進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,PBS沖洗,5 min/次,加入VEGF、iNOS、HIF-1α(1∶500)一抗及 GAPDH抗體(1∶1000 )、過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2000),雜交處理4 h后,沖洗,將膜浸入電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液,檢測(cè)獲取圖像。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝功能水平比較 見表1。與健康組比較,模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組ALT、AST、ALP水平均升高(P<0.05),與模型組比較,肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組ALT、AST、ALP水平均降低(P<0.05),肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組ALT、AST、ALP水平均高于聯(lián)合組(P<0.05)。

表1 各組大鼠肝功能水平比較(U/L)

2.2 各組大鼠免疫功能水平比較 見表2。與健康組比較,模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05),模型組與聯(lián)合組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與模型組及聯(lián)合組比較,肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠免疫功能水平比較

2.3 各組大鼠肝組織病理變化比較 健康組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠肝細(xì)胞排列雜亂無(wú)章,細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)呈空泡狀;肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組大鼠肝細(xì)胞排列不規(guī)則,有少量空泡;聯(lián)合組大鼠肝細(xì)胞排列緊密,僅見少量腫脹(圖1)。

A：健康組;B：模型組;C：肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組;D：聯(lián)合組

2.4 各組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡比較 見圖2。健康組、模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組大鼠肝癌細(xì)胞凋亡率分別為(1.25±0.14)%、(3.17±0.36)%、(14.35±1.48)%、(19.62±2.05)%。健康組細(xì)胞凋亡率低于模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組(P<0.01),模型組細(xì)胞凋亡率低于肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組(P<0.01),肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組細(xì)胞凋亡率低于聯(lián)合組(P<0.01)。

A：健康組;B：模型組;C：肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組;D：聯(lián)合組

2.5 各組大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表達(dá)比較 見表3(圖3)。與健康組比較,模型組、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組與聯(lián)合組VEGF、iNOS、HIF-1α表達(dá)均升高(P<0.05),與模型組比較,肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組VEGF、iNOS、HIF-1α表達(dá)均升高(P<0.05),與模型組及肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組比較,聯(lián)合組VEGF、iNOS、HIF-1α表達(dá)均降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠HIF-1α、iNOS、VEGF蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠VEGF、iNOS、HIF-1α蛋白表達(dá)比較

3 討 論

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,早期無(wú)明顯癥狀但疾病進(jìn)展較快,術(shù)后復(fù)發(fā)較高,嚴(yán)重威脅患者生命安全[11]。而TACE術(shù)是一種常見的肝癌治療方法,雖然可提高臨床療效,但該治療方法仍存在局限性,如易導(dǎo)致肝組織損傷、免疫功能下降等。槲芪方作為一種傳統(tǒng)中藥方劑被廣泛應(yīng)用于肝癌治療,并取得了一定的療效。因此,本研究通過(guò)對(duì)比肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)組和聯(lián)合組的指標(biāo)水平,旨在探究槲芪方加減對(duì)肝癌化療栓塞術(shù)后大鼠的影響,為肝癌治療提供新的思路。

腫瘤缺氧環(huán)境中,會(huì)使得HIF-1α水平增加,促進(jìn)iNOS含量增加并產(chǎn)生一定的一氧化氮,增加VEGF表達(dá),促進(jìn)腫瘤血管生成[12-14]。VEGF是促血管新生的重要因子,與其受體結(jié)合后通過(guò)磷酸肌醇等途徑調(diào)控iNOS表達(dá),誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)生,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)血管新生,形成惡性循環(huán)[15]。研究提示[16],TACE術(shù)后,腫瘤并未完全壞死,癌中心及癌周仍有大量存活的癌細(xì)胞,這些癌細(xì)胞存在于不同程度的乏氧環(huán)境中。已有研究表明[17],HIF-1α能夠誘導(dǎo)VEGF、iNOS促進(jìn)血管新生,加快腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。中醫(yī)認(rèn)為肝癌的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),治療肝癌應(yīng)重視氣血、臟腑間的關(guān)系,并主張將“補(bǔ)肝體” 和 “益肝用”運(yùn)用于肝癌治療中。槲芪方具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、溫陽(yáng)健脾、滋補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)通絡(luò)等功效,符合上述病機(jī)。該方中以黃芪、槲寄生、丹參為君藥,益氣固表、滋補(bǔ)肝腎;白花蛇舌草、莪術(shù)為臣藥,清熱解毒、活血化瘀。研究提示,槲芪方可有效提高肝癌患者臨床療效[18]。本研究與上述結(jié)果相似,也證實(shí)了槲芪方可改善肝癌大鼠的肝功能,另外TUNEL結(jié)果也顯示槲芪方加減可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也表明黃芪、莪術(shù)[19]、白花蛇舌草[20]均可通過(guò)調(diào)控HIF-1α、VEGF治療腫瘤。本研究結(jié)果顯示術(shù)后HIF-1α、VEGF、iNOS水平升高,認(rèn)為可能是由于TACE刺激,HIF-1α、iNOS被激活,產(chǎn)生腫瘤致癌基因,誘發(fā)癌變,使得VEGF增加,加重癌變。槲芪方治療后HIF-1α、VEGF、iNOS水平降低,提示TACE增加了腫瘤局部微環(huán)境的乏氧,而槲芪方則顯著降低HIF-1α、iNOS的表達(dá),提示槲芪方對(duì)于術(shù)后腫瘤乏氧微環(huán)境具有改善作用;VEGF水平也顯著降低,提示槲芪方通過(guò)改善術(shù)后乏氧環(huán)境,抑制腫瘤血管新生,間接起到抑制侵襲的作用。

TACE的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其會(huì)導(dǎo)致患者的免疫功能降低并損壞肝臟組織,嚴(yán)重者會(huì)促進(jìn)病情發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道[21],肝癌術(shù)后患者的免疫功能與遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。其中CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴細(xì)胞的重要成員,參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。CD4+具有抗腫瘤的作用,CD8+是機(jī)體發(fā)揮免疫抑制的關(guān)鍵,CD4+/CD8+可反映患者機(jī)體免疫抑制程度[22]。行TACE術(shù)治療后機(jī)體氣血耗損狀態(tài)進(jìn)一步加重,槲芪方以滋補(bǔ)肝腎、益氣健脾、和血調(diào)肝等為主要治療原則,符合氣血耗損的治療。槲芪是桑寄生科槲寄生屬植物,性平味苦,歸肝、腎經(jīng),功可祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、養(yǎng)血[23]。槲芪方不僅具有輔助抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用,而且還具有直接抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。槲寄生提取物多糖及總堿可抑制肝癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。生黃芪健脾益氣,丹參和血養(yǎng)肝,郁金解郁化痰,白花蛇舌草祛疫解毒,莪術(shù)化瘀消癥,水紅花子化瘀通絡(luò),苦參利濕解毒,全方調(diào)補(bǔ)肝脾腎氣血為主,利濕解毒活血通絡(luò)消癥為輔。現(xiàn)代研究提示,槲芪方中黃芪、莪術(shù)、槲寄生、丹參等中藥材均具有提高免疫功能的作用[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)TACE治療后免疫功能降低,經(jīng)過(guò)槲芪方治療后免疫功能顯著增加,提示槲芪方具有提高TACE術(shù)后患者免疫功能的作用,這與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述,槲芪方加減可提高肝癌TACE術(shù)后大鼠的免疫功能,通過(guò)抑制肝癌大鼠乏氧微環(huán)境中HIF-1α、iNOS及VEGF水平,改善乏氧微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。