芪地糖腎顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK蛋白的影響

張 穎,靳亦龍,周立新

(1.衡水市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 衡水 053000;2.衡水市第四醫(yī)院,河北 衡水 053000)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)作為臨床中較常見(jiàn)的一類(lèi)代謝紊亂型疾病具有較高的發(fā)病率,而胰島素抵抗不僅是影響T2DM進(jìn)程的重要因素,也是引起本病中脂代謝紊亂的關(guān)鍵誘因[1-2]。T2DM在臨床中常表現(xiàn)為代謝紊亂,而胰島素抵抗可與這類(lèi)現(xiàn)象相互影響并產(chǎn)生惡性循環(huán)[3]。經(jīng)研究,脂聯(lián)素通過(guò)與其受體結(jié)合可發(fā)揮多種生物學(xué)作用,而骨骼肌脂聯(lián)素受體1(Adiponectin receptor1,AdipoR1)作為其重要受體亞型之一,與脂聯(lián)素結(jié)合后可通過(guò)激活腺苷酸激活蛋白激酶蛋白(AMP-activated protein kinase,AMPK)調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)p38激活絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-actvated protein kinase,p38MAPK)及葡萄糖代謝水平,進(jìn)而參與疾病中脂肪酸氧化反應(yīng)[4-5]。近年來(lái),隨著中醫(yī)藥在疾病研究中的不斷深入,發(fā)現(xiàn)部分中藥在糖尿病中具有改善胰島素抵抗的潛能。因此,臨床中可以此作為切入點(diǎn)研制相關(guān)治療T2DM的相關(guān)藥物。中醫(yī)理論認(rèn)為,糖尿病的病因在于陰虛氣滯、腎瘀精阻,而芪地糖腎顆粒作為中成藥是以明代張景岳提出的“真陰精氣”理論加以補(bǔ)腎填精為主要治療原則的方劑[6]。該方主要以熟地、生黃芪、芡實(shí)、山萸肉、水蛭、熟大黃、白花蛇舌草等多種成分組合而成。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),該方不僅可有效降低糖尿病患者蛋白尿水平,還在降低血糖及預(yù)防糖尿病腎病等方面具有一定療效[7-8]。本文通過(guò)探究芪地糖腎顆粒對(duì)T2DM胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK等相關(guān)蛋白的作用機(jī)制,為該藥在相關(guān)疾病的臨床治療中提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只,6～8周齡,體重160～220 g,購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京) 2018-0006,于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng),濕度50%～60%,溫度16～22 ℃,晝夜交替,自由進(jìn)食飲水,本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照我院動(dòng)物倫理原則操作。

1.2 藥物與試劑 芪地糖腎顆粒(涿州東樂(lè)制藥公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20113036);胰島素放免試劑盒(北京科美東雅生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：080829);蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)：201208);ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司,批號(hào)：201211);p38MAPK、AMPK、AdipoR1抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司,貨號(hào)PL0305436、PL0502571、252007)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯公司,型號(hào)：AV5421);臺(tái)式離心機(jī)(武漢愛(ài)斯佩有限公司,型號(hào)：DM041 Ⅱ);全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞有限公司,型號(hào)：BS-200)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為健康組、模型組及低、中、高劑量組。除健康組外其余組均參照文獻(xiàn)[9]建立糖尿病模型,高脂高糖喂養(yǎng)1周后腹腔注射2%鏈脲霉素25 mg/kg,取尾靜脈血測(cè)血糖>16.67 mmol/L為建模成功。健康組與模型組大鼠均1次/d給予等量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃;芪地糖腎顆粒各劑量組給藥依據(jù)文獻(xiàn)[10]按中藥出藥率28.16%計(jì)算,人用藥量為26.2 g,用羧甲基纖維素液配制成濃度為低劑量1.31 g/kg、中劑量2.62 g/kg、高劑量5.24 g/kg的藥液,均于每日上午9：00前預(yù)熱30 min后灌胃1次,連續(xù)干預(yù)30 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 ELISA檢測(cè)大鼠血清中脂質(zhì)代謝水平：給藥結(jié)束后禁食24 h,麻醉抽取腹部靜脈血1 ml,2000 r/min離心20 min,檢測(cè)總膽固醇(Total cholesterol,TC),高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),甘油三酯(Triglyceride,TG)表達(dá),操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 酶聯(lián)免疫法測(cè)定胰島素抵抗：大鼠禁食12 h,用戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動(dòng)脈取血,放免法評(píng)估空腹胰島素(FINS),酶聯(lián)免疫法評(píng)估空腹血糖(FBG),依據(jù)文獻(xiàn)[11-12]以FBG與FINS乘積倒數(shù)的自然對(duì)數(shù)來(lái)表示,計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)(ISI)=Ln[1/(FINS×FBG)]和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.5.3 免疫印跡檢測(cè)AdipoR1、AMPK、p38MAPK：用2%戊巴比妥10 ml/kg麻醉處死大鼠,取50 mg骨骼肌組織,提取總蛋白試劑盒檢測(cè)濃度,電泳后將蛋白分離,轉(zhuǎn)PVDF膜,密封2 h,加抗體AdipoR1(1∶500)、AMPK(1∶500)、p38MAPK(1∶1000),4 ℃孵育24 h,洗滌,加二抗(1∶500), β-actin為內(nèi)參,Image J軟件測(cè)得灰度值。

1.5.4 PCR檢測(cè)AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA：大鼠全身麻醉后取骨骼肌組織50 mg,液氮研磨,按TRIzol說(shuō)明書(shū)提取并測(cè)定總RNA,合成cDNA,取2 μl cDNA行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系25 μl,反應(yīng)條件：95 ℃,5 min預(yù)變性,90 ℃,15 s變性,70 ℃,30 s退火,75 ℃延伸30 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán),反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳分析,引物序列由上海生物工程公司合成,用Image MasterTMTotal La圖像分析系統(tǒng)分析基因表達(dá)量,見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C、TG表達(dá)比較 見(jiàn)表2。與健康組比較,模型組血清HDL-C降低,LDL-C、TC、TG均升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組血清HDL-C升高,LDL-C、TC、TG均降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中TC、HDL-C、TG、LDL-C表達(dá)比較(mmol/L)

2.2 各組大鼠血清中FBC、FINS表達(dá)比較 見(jiàn)表3。與健康組比較,模型組血清中FBC、FINS均升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組血清FBC、FINS均降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清中FBC、FINS表達(dá)比較

2.3 各組大鼠HOMA-IR、ISI表達(dá)比較 見(jiàn)表4。與健康組比較,模型組ISI降低,HOMA-IR升高(P<0.05);與模型組比較,低劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組ISI升高,HOMA-IR降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠HOMA-IR、ISI表達(dá)比較

2.4 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比較 見(jiàn)表5(圖1)。與健康組比較,模型組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均升高(P<0.05)。

圖1 各組AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白表達(dá)比較

表5 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白比較

2.5 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比較 見(jiàn)表6。與健康組比較,模型組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均降低(P<0.05);與模型組比較,低劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA均升高(P<0.05)。

表6 各組大鼠AdipoR1、AMPK、p38MAPK mRNA比較

3 討 論

臨床對(duì)于T2DM的治療常使用胰島素、雙胍類(lèi)及磺脲類(lèi)藥物等進(jìn)行干預(yù),盡管有一定療效,但也在一定程度上引發(fā)低血糖及腸道功能紊亂[13-14]。因此,現(xiàn)階段通過(guò)充分發(fā)揮中醫(yī)治療優(yōu)勢(shì)進(jìn)而尋找有效干預(yù)T2DM的方法至關(guān)重要。中藥黃芪是糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的常用治療藥物,對(duì)于多種疾病的治療均有明顯的功效。

T2DM在中醫(yī)學(xué)屬于“消渴”范疇,其病機(jī)主要是陰虛津虧與盛炙燥熱相互作用的結(jié)果,中醫(yī)病理將其總結(jié)為“濕炙不濟(jì)、腎虛津竭、脾損氣滯”[13-15]。而血脂代謝紊亂不僅是糖尿病產(chǎn)生的關(guān)鍵病因,也是誘發(fā)相關(guān)心血管病變的重要危險(xiǎn)因素[16]。在T2DM中持續(xù)高血脂所產(chǎn)生的脂毒性不僅可對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生不良作用,還對(duì)增加胰島素抵抗和破壞糖代謝功能具有重要影響[17-18]。文中結(jié)果顯示,T2DM大鼠HDL-C偏低,LDL-C、TC、TG偏高,給藥后,各劑量組HDL-C均有所升高,LDL-C、TC、TG也有所降低,其中以高劑量組脂代謝水平改善最為顯著,提示高劑量芪地糖腎顆粒對(duì)調(diào)節(jié)T2DM時(shí)期的脂質(zhì)代謝水平療效確切。芪地糖腎顆粒中的生黃芪成分可以增加胰島素敏感性,通過(guò)改善脂肪細(xì)胞因子代謝抑制血清游離脂肪酸過(guò)度生成,進(jìn)而改善T2DM時(shí)期的脂質(zhì)代謝異常并調(diào)節(jié)免疫機(jī)制。且有學(xué)者在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn),芪地糖腎顆粒在改善T2DM大鼠的足細(xì)胞損傷方面療效良好,并可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)功能發(fā)揮治療效用[19]。

胰島素抵抗是T2DM的病理基礎(chǔ),可由多種途徑影響其作用環(huán)節(jié)并參與T2DM進(jìn)程[20]。文中研究顯示,T2DM大鼠的ISI指數(shù)較低而FBC、FINS及HOMA-IR指數(shù)均較高,經(jīng)不同劑量的芪地糖腎顆粒干預(yù)后各組大鼠的ISI指數(shù)有所升高,FBC、FINS及HOMA-IR指數(shù)也有所降低,其中以高劑量組表現(xiàn)最為顯著,提示高劑量芪地糖腎顆粒對(duì)改善T2DM大鼠的胰島素水平具有一定積極效用。胰島素抵抗是引起糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的“動(dòng)力”根源,常表現(xiàn)為葡萄糖供應(yīng)障礙,外周及骨骼肌組織的胰島素敏感性大幅度降低等[21]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,腎的病理學(xué)機(jī)制與胰島素生物學(xué)效應(yīng)相吻合,而腎虛也是胰島素抵抗的眾多因素之一。中藥芪地糖腎顆粒以養(yǎng)精溫補(bǔ)為主要治療原則,方中大黃可通經(jīng)活絡(luò),黃芪、熟地行氣溫精之效,山萸肉可止遺滋補(bǔ),芡實(shí)固表養(yǎng)內(nèi),水蛭養(yǎng)腎通經(jīng),白花蛇舌草則有改善下焦?jié)釢窈屠诖x效用。諸藥聯(lián)合應(yīng)用可在補(bǔ)養(yǎng)調(diào)和、標(biāo)本兼治的同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體血糖代謝[22]。有學(xué)者在對(duì)早期糖尿病腎病的研究中發(fā)現(xiàn),黃芪可參與糖尿病的胰島素抵抗調(diào)節(jié)過(guò)程[23]。由此推測(cè),芪地糖腎顆粒改善T2DM的機(jī)制可能與多藥材共同作用相關(guān),使藥物在發(fā)揮抑制機(jī)體脂肪酸生物合成及提高葡萄糖攝取的同時(shí)加快脂肪酸氧化,最終達(dá)到降低胰島素抵抗及胰島素敏感性的效用。

骨骼肌是機(jī)體重要的能量?jī)?chǔ)存中心,并在葡萄糖、脂質(zhì)代謝等方面具有重要干預(yù)作用[24]。本文研究表明,T2DM大鼠骨骼肌中的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均較低,而藥物干預(yù)后各組大鼠的AdipoR1、AMPK、p38MAPK蛋白均有不同程度的升高,其中以高劑量組升高最為顯著。脂聯(lián)素作為關(guān)鍵脂肪因子可在調(diào)節(jié)代謝功能的同時(shí)促進(jìn)葡萄糖吸收,并對(duì)穩(wěn)定機(jī)體能量平衡有著重要作用。脂聯(lián)素與AdipoR1相互作用可使AMPK產(chǎn)生磷酸化反應(yīng),進(jìn)而參與調(diào)節(jié)外周組織對(duì)葡萄糖吸收及糖代謝時(shí)期靶分子葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,而AMPK能夠通過(guò)磷酸化下游靶分子激活p38MAPK進(jìn)而參與調(diào)節(jié)脂肪代謝。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn),黃芪可通過(guò)調(diào)節(jié)糖尿病中AdipoR1、AMPK、p38MAPK相關(guān)通路水平改善糖尿病大鼠脂質(zhì)代謝及反應(yīng)機(jī)制[25]。由此分析,高劑量的芪地糖腎顆粒配伍可能通過(guò)發(fā)揮中藥降糖及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等機(jī)制,使部分信號(hào)發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝功能及改善紊亂引發(fā)的胰島素敏感性降低現(xiàn)象。

綜上所述,芪地糖腎顆粒可對(duì)改善T2DM胰島素抵抗、脂代謝及AdipoR1、AMPK及p38MAPK等蛋白產(chǎn)生有一定調(diào)節(jié)作用,為臨床該藥治療T2DM提供科學(xué)依據(jù)。由于中藥成分復(fù)雜且在改善疾病中是多途徑的,本次研究對(duì)于藥物的具體調(diào)節(jié)路徑仍未完全闡明,有待進(jìn)一步深入研究。