加味沙參麥冬湯調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 通路對CAG 大鼠的治療作用

劉遠婷，趙 磊，丁甜甜，李 慧，李國英

（1.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，烏魯木齊 832000；2.新疆醫(yī)科大學校醫(yī)院，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院藥學部，烏魯木齊 832000）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）以胃黏膜腺體失去正常結(jié)構(gòu)為特征，目前普遍認為CAG 為胃癌（gastric carcinoma，GC）的癌前病變之一[1]。CAG 發(fā)病期間可見上腹脹滿、噯氣、食欲不振等不典型癥狀，患者往往不能及時發(fā)現(xiàn)和重視。隨著病程的深入，可出現(xiàn)黏膜異型增生、腸上皮化生等病理性病變，癌變率約為 2.55%～7.46 %[2]。隨著近年消化內(nèi)鏡檢查的不斷普及，CAG 檢出率逐漸提升，約占胃鏡檢查人群的7.5%～13.8%[3]。胃黏膜細胞增殖和凋亡的紊亂為CG 演化進程中的早期事件，在CAG 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。第10 號 染 色 體 缺 失 的磷 酸 酶 和 張 力 蛋 白 同 源 物（PTEN）及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT））信號通路參與細胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡及腫瘤發(fā)展的一系列過程，研究表明，PTEN的缺失可導(dǎo)致胃黏膜PI3K、AKT高表達，在正常胃組織-CAG 組織-GC 組織發(fā)展進程中，可見PI3K/AKT 通路逐漸被激活，從而抑制病變細胞凋亡[4-5]。大量臨床報告證實[6-7]，中醫(yī)藥在治療CAG 方面療效較好，可有效改善CAG 臨床癥狀，還可使黏膜萎縮狀態(tài)得到不同程度的逆轉(zhuǎn)，使治愈率顯著提高。胃腑生理狀態(tài)及功能的實現(xiàn)有賴于胃陰的濡潤，且CAG 病程遷延，常見胃陰虧損之候，故多配以滋陰益胃中藥。沙參麥冬湯有清養(yǎng)肺胃、生津潤燥的功效，臨床用于CAG 療效良好[8]。本研究通過復(fù)制CAG 大鼠模型，觀察加味沙參麥冬湯對細胞凋亡因子及PTEN/PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討其對CAG 的作用及相關(guān)機制。

1 實驗儀器與材料

1.1 動物 健康雄性Wistar 大鼠 60 只，SPF 級，體質(zhì)量（160±20）g，分籠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，保持12 h 光暗周期交替。實驗動物許可證號：SYXK（新）2023-0004。

1.2 藥物 維酶素片購自河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.2 g。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）購自美國 Fluka 公司，規(guī)格：5 g。加味沙參麥冬湯由新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院藥劑室提供，組成如下：北沙參12 g，玉竹10 g，麥門冬10 g，生扁豆10 g，天花粉15 g，桑葉6 g，生甘草3 g，白芍10 g，木瓜10 g。

1.3 儀器與試劑 -80 ℃超低溫冰箱（巨百生物有限公司）；Mirofuge 20 R 型低溫高速離心機（美國Thermo Fisher）；BG-XM496 酶標儀（北京六一儀器廠）；RM 2235 全自動輪轉(zhuǎn)式切片機，ChemTron KSW 正置光學顯微鏡，LEICA DM 2500 熒光相差顯微鏡（德國Leica公司）；Bio-Rad電泳儀（上海一恒科技有限公司）；Fluor Chem M 凝膠成像系統(tǒng)（廣州施萊登生物科技公司）。Fas、FasL 大鼠ELISA 檢測試劑盒購自上海酶科生物科技有限公司；TUNEL、DAPI 染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司 ；PTEN、PI3K、AKT 抗體試劑盒，DAB 顯色劑購自武漢博士德公司；PTEN、PI3K、AKT 鼠單克隆抗體，兔GAPDH 多克隆抗體購自美國Abcam 公司。

2 實驗方法

2.1 模型制備及干預(yù) 將60 只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、加味沙參麥冬湯低劑量、中劑量、高劑量組共6 組，每組各10 只。除空白組外，其余大鼠采用MNNG 自由飲用法復(fù)制CAG 模型[9]：取MNNG 粉末充分溶解于蒸餾水，配制為濃度170 mg/L的溶液灌于避光飲水瓶，每日更換瓶中溶液，大鼠自由飲用8 周，造模完成后行胃黏膜HE 染色，以黏膜腺體數(shù)減少、固有腺體萎縮等改變?yōu)槟Ｐ统晒藴?。陽性對照組以維酶素為陽性對照[10]，給予0.3 g/kg 維酶素混懸液灌胃，每日1 次，持續(xù)12 周；加味沙參麥冬湯低、中、高劑量分別給予加味沙參麥冬湯不同劑量灌胃（4.84、9.68、19.35 g/kg），每日1 次，持續(xù)12 周。

2.2 胃黏膜血流量（GMBF）測定 測試前大鼠禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后取尾靜脈血1 mL，置于抗凝管中，開腹分離右側(cè)股靜脈、股動脈，由股靜脈穿刺注入中性紅生理鹽水溶液，先以4 mg/kg速度注入0.5 %中性紅溶液，輸注2 mL 后，以微量注射泵注入0.05 %溶液維持，每隔15 min 收集1 次胃液，2 h 后心臟穿刺取血4 mL，分光光度計法于540 nm波長下比色，得出血液、胃液內(nèi)中性紅濃度并計算GMBF。GMBF =胃液中性紅濃度/血液中性紅濃度×單位時間內(nèi)胃液分泌量。

2.3 ELISA 實驗檢測血清中Fas、FasL 含量 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后解剖，經(jīng)腹主動脈采血后處死，離心后收集上清，按ELISA 試劑盒操作步驟檢測血清中Fas、FasL 的含量：反應(yīng)孔中加入酶標抗體100 μL、稀釋劑40 μL 和血清樣品10 μL，同時做空白孔及陰性對照孔，于37℃溫箱反應(yīng)1 h 后洗滌，加入臨時配制的顯色劑100 μL，37℃避光15 min 后終止反應(yīng)，于酶標檢測儀450 nm波長處測定OD 值，以O(shè)D 值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣品OD 值代入曲線求Fas、FasL 的相應(yīng)濃度。

2.4 TUNEL 染色檢測胃黏膜上皮細胞凋亡 大鼠采血處死后立即取材，取部分胃黏膜組織放入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，液體石蠟中包埋后作5 μm 厚切片，切片脫蠟至水，EDTA 修復(fù)液 98 ℃ 抗原修復(fù)，加入蛋白酶K 工作液于37 ℃孵育18 min，TUNEL 反應(yīng)液37 ℃反應(yīng)1 h，加入終止液室溫處理15 min 后，滴加DAPI 襯染細胞核，滴加抗熒光催滅劑，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞并拍照，隨機選取5 個視野，Image J 軟件分析平均光密度值。

2.5 免疫組織化學法檢測胃黏膜PTEN、PI3K、AKT的陽性表達 取部分胃黏膜組織放入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，液體石蠟中包埋后作5 μm 厚切片，切片脫蠟至水，加入H2O2室溫封閉10 min，置于抗原修復(fù)液中熱修復(fù)，滴加5% BSA 封閉20 min，滴加一抗后于4℃過夜，滴加二抗于37℃反應(yīng)20 min，滴加SABC 于37℃反應(yīng)20 min，加入DAB 顯色，自來水沖洗后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察陽性細胞表達并拍照，隨機選取5個視野，Image J 軟件分析平均光密度值。

2.6 Western-blot 檢測胃黏膜PTEN、PI3K、AKT 的蛋白表達 取大鼠胃黏膜組織100 mg，加入RIPA裂解液，12 000 rpm，4℃離心30 min 后取裂解上清，BCA 法于562 nm 波長處進行蛋白定量，加入Loading buffer 稀釋濃度，制膠后各組取10 μL樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜，滴加5%TBST 脫脂奶粉封閉液室溫2 h，加入一抗（1:1 000）置于4℃過夜，加二抗（1:5 000）室溫反應(yīng)1 h，ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，采用Image J 軟件對蛋白條帶進行定量分析，以GAPDH 為內(nèi)參，分別計算PTEN、PI3K、AKT 的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以GraphPad Prism 5.0 軟件繪制柱狀圖，結(jié)果以均數(shù)±標準差 （±s）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 加味沙參麥冬湯對胃黏膜血流量的影響 與空白組比較，模型組胃黏膜血流量明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高不同劑量組灌胃治療后，胃黏膜血流量隨著給藥劑量的升高逐漸提升（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜血流量（± s，n = 10） mg/（kg.hr）

表1 各組大鼠胃黏膜血流量（± s，n = 10） mg/（kg.hr）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 GMBF空白組 26.35±3.93模型組 10.87±4.46#陽性對照組 19.75±3.26△加味沙參麥冬湯低劑量組 15.34±5.12△加味沙參麥冬湯中劑量組 17.88±3.19△加味沙參麥冬湯高劑量組 23.13±4.58△

3.2 加味沙參麥冬湯對血清Fas、FasL 表達的影響 ELISA 結(jié)果可見，模型組血清中Fas、FasL 的濃度較空白組明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高不同劑量組灌胃治療后，血清Fas、FasL 的濃度隨著給藥劑量的升高逐漸降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清Fas、FasL 水平（± s，n = 10） pg/mg

表2 各組大鼠血清Fas、FasL 水平（± s，n = 10） pg/mg

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 Fas FasL空白組 942.01±249.76 59.37±16.94模型組 3 024.88±142.40# 844.09±37.76#陽性對照組 901.81±88.76△ 353.97±53.53△加味沙參麥冬湯低劑量組1 703.50±120.29△ 572.45±97.45△加味沙參麥冬湯中劑量組 915.21±78.97△ 401.99±60.65△加味沙參麥冬湯高劑量組 524.86±73.12△ 158.05±23.82△

3.3 加味沙參麥冬湯對胃黏膜細胞凋亡的影響 TUNEL 染色顯示，TUNEL 標記的細胞呈現(xiàn)綠色熒光，DAPI 陰性復(fù)染的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，模型組胃黏膜見較多綠色熒光細胞核，數(shù)量高于空白組（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高不同劑量組灌胃治療后，綠色熒光細胞核數(shù)量隨著給藥劑量的升高逐漸降低（P＜0.05），如圖1，見表3。

圖1 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況（TUNEL，×200）

表3 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況（± s，n = 10）

表3 各組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況（± s，n = 10）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 MD 值空白組 5.11±1.33模型組 19.95±3.02#陽性對照組 10.52±1.59△加味沙參麥冬湯低劑量組 15.29±1.88△加味沙參麥冬湯中劑量組 12.26±2.07△加味沙參麥冬湯高劑量組 7.87±1.32△

3.4 加味沙參麥冬湯對胃黏膜PTEN、PI3K、AKT 陽性表達的影響 IHC 結(jié)果顯示，空白組胃黏膜可見較多PTEN 陽性表達，僅見少量PI3K、AKT 的陽性表達，與空白組比較，模型組胃黏膜中PTEN 的陽性表達量明顯減少，PI3K、AKT 的陽性表達量明顯增多（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高不同劑量組灌胃治療后，PTEN 的陽性表達量隨著給藥劑量的升高逐漸增多，PI3K、AKT 的陽性表達量逐漸減少（P＜0.05），如圖2，表4 所示。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織PTEN、PI3K、AKT 的陽性表達（IHC，×200）

表4 各組大鼠胃黏膜組織PTEN、PI3K、AKT 陽性表達（± s，n = 10） MOD 值

表4 各組大鼠胃黏膜組織PTEN、PI3K、AKT 陽性表達（± s，n = 10） MOD 值

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 PTEN PI3K AKT空白組 0.43±0.07 0.25±0.05 0.28±0.03模型組 0.16±0.06# 0.49±0.04# 0.55±0.04#陽性對照組 0.31±0.05△0.32±0.08△0.34±0.05△加味沙參麥冬湯低劑量組0.24±0.09△0.40±0.04△0.42±0.06△加味沙參麥冬湯中劑量組0.29±0.07△0.36±0.06△0.38±0.05△加味沙參麥冬湯高劑量組0.39±0.06△0.29±0.03△0.31±0.06△

3.5 加味沙參麥冬湯對胃黏膜PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白的影響 與空白組比較，模型組胃黏膜組織中PTEN 的蛋白表達明顯減少，PI3K、AKT 的蛋白表達明顯增多（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)加味沙參麥冬湯低、中、高不同劑量組灌胃治療后，AKT 的蛋白表達隨著給藥劑量的升高逐漸減少（P＜0.05）；低劑量組PTEN、PI3K 的蛋白表達量較模型組有所改善，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量、高劑量組PTEN 的蛋白表達較模型組明顯增多，PI3K 的蛋白表達較模型組明顯減少（P＜0.05），如圖3 所示。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白表達

4 討論

中醫(yī)學將CAG 歸屬于“胃脘痛”“痞滿”“胃萎”等范疇，認為其病性屬虛實并見，以虛為本。脾胃虛弱，升降運化無力，招致外邪侵擾，或形成氣滯、食積、濕濁、瘀血，實邪內(nèi)阻，使虛者愈虛，日久則郁熱傷陰，見胃陰虧損，胃絡(luò)失和，胃體萎弱之征。胃為陽土，喜潤而惡燥，津液充盈胃方能受納五味而降濁。本病起病隱襲，病程遷延，日久則郁熱傷陰，常見胃陰虧損之候，治宜滋陰益胃，益氣健脾[11]。沙參麥冬湯為吳鞠通《溫病條辨》中清養(yǎng)肺胃、生津潤燥的代表方[12]，全方由沙參、麥冬、玉竹、冬桑葉、扁豆、天花粉、甘草組成，本人在臨床上應(yīng)用沙參麥冬湯加味，在原方基礎(chǔ)上加用白芍、木瓜，用于CAG 效果顯著。方中北沙參、麥門冬相伍甘涼濡潤，入胃以養(yǎng)陰，為君藥；玉竹、天花粉清熱兼以養(yǎng)陰，二藥合用使沙參、麥冬滋陰之力倍增，為臣藥；桑葉滋陰潤燥，白扁豆補中培土、益氣化濕，以防滋陰之品助濕生滿，白芍、木瓜舒肝和胃、斂陰生津，共為佐藥；甘草為使，調(diào)和諸藥，與白芍、木瓜酸味之品同用，酸甘合法，二濟其陰，起到激活胃腺，增加胃液作用。

多數(shù)研究證明[13-14]，胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡的紊亂與CAG 的發(fā)病和進展密切相關(guān)。CAG 胃黏膜在慢性炎癥刺激下細胞不穩(wěn)定性增加，出現(xiàn)大量凋亡及異?；钴S的增殖細胞，細胞增殖和凋亡指數(shù)隨黏膜萎縮程度的加重逐漸增加；在CAG 伴腸化生階段，發(fā)生細胞凋亡障礙，增殖細胞持續(xù)增加，進而出現(xiàn)不典型增生[15]。胃黏膜細胞增殖凋亡及腺體萎縮受EGFR/PI3K/AKT信號通路的調(diào)控，表皮生長因子受體（EGFR）與其受體在細胞膜上結(jié)合，在CAG 胃黏膜中出現(xiàn)不同程度的高表達和激活，引起黏膜上皮細胞分化和增殖活躍，隨后通過激活其下游PI3K/AKT 信號實現(xiàn)對細胞凋亡的調(diào)節(jié)[16-17]?；罨腜I3K 能夠?qū)⒘姿峄字＜〈级姿幔≒IP2）催化為磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 激活A(yù)KT，AKT 由胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞膜，通過下游多種效應(yīng)因子抑制細胞凋亡[18]。磷酸酯酶和張力蛋白同源基因（PTEN）是一種抑癌基因，可通過下調(diào)PIP3水平對細胞內(nèi)PI3K/AKT 信號進行負性調(diào)控，PTEN的失活可促使PIP3 積聚，從而增強AKT 活化[19]。在CAG 到GC 的病理進展中，黏膜組織PTEN 的表達量隨病情的加重而減少[20]。

團隊前期研究證實[21]，加味沙參麥冬湯灌胃干預(yù)可增強CAG 大鼠黏膜上皮保護功能，改善黏膜病理損傷，在分子層面，其作用后抑制了EGFR 通路表達水平，進而減輕上皮細胞的異常增殖。本研究中，模型組胃黏膜凋亡陽性細胞數(shù)增加，血清中促凋亡分子Fas及其配體FasL 的水平顯著升高，提示CAG 大鼠細胞凋亡與增殖水平同時升高，經(jīng)加味沙參麥冬湯治療后，胃黏膜凋亡細胞明顯減少，血清中Fas、FasL 的水平顯著降低，表明加味沙參麥冬湯對CAG 凋亡和增殖均有改善作用，可通過抑制細胞過度凋亡，從而改善黏膜萎縮狀態(tài)。檢測PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白發(fā)現(xiàn)，模型組胃黏膜PTEN 表達水平明顯降低，PI3K、AKT 的表達明顯增高，加味沙參麥冬湯治療后增加了PTEN的表達，抑制了PI3K、AKT 的水平，提示加味沙參麥冬湯可通過上調(diào)PTEN 表達抑制病變組織PI3K/AKT通路的過度激活。

綜上所述，加味沙參麥冬湯對MNNG 所誘導(dǎo)的CAG 大鼠具有明顯療效，可通過減輕上皮細胞過度凋亡，維護黏膜損傷過程中凋亡與增殖的平衡達到胃黏膜保護效果，并可通過促進抑癌基因PTEN 的表達抑制PI3K/AKT 通路活性，進而在延緩萎縮病變組織炎-癌轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用。