超聲輔助低共熔溶劑制備咖啡果皮可溶性膳食纖維

邵芳芳 胡發(fā)廣 董文江 畢曉菲 陳罡 陳艦飛

關(guān)鍵詞：咖啡果皮；低共熔溶劑；可溶性膳食纖維；響應(yīng)面法

咖啡是全球最受歡迎的非酒精飲料之一。近年來，咖啡銷量逐年增加，其種植面積也在不斷擴大，僅2021年全球咖啡豆的產(chǎn)量達1050萬t，其加工產(chǎn)生的咖啡副產(chǎn)物的量也在不斷增加[1]，在我國，咖啡主要種植于云南省和海南省。2021年我國咖啡總產(chǎn)量為1.09887×105t，而每噸成品咖啡豆會產(chǎn)生約1.1t咖啡副產(chǎn)物。因這些副產(chǎn)物中含有高濃度的咖啡因、單寧、茶多酚等物質(zhì)而不可直接用作生物基質(zhì)和飼料，通常會被直接丟棄，不僅造成資源的浪費還會污染環(huán)境[2]。已有研究表明，這些副產(chǎn)物中含有高附加值的化合物，可利用一定的方法將其中對環(huán)境存在污染的部分進行轉(zhuǎn)化，進而用于提取生物活性化合物和聚合物的原料[3]。因此，咖啡副產(chǎn)物在食品加工中具有重要的應(yīng)用前景，需要進一步研究以更好地利用它。

在咖啡濕法處理過程中，產(chǎn)生的固體廢棄物中咖啡果皮是主要部分?？Х裙ず刑妓衔?、膳食纖維、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等成分，其中總膳食纖維含量占70%，可作為優(yōu)良的膳食纖維來源[4]。目前，對咖啡果皮各成分進行提取分析的研究較多，如HENRIQUE等[5]從阿拉比卡咖啡果皮中提取具有凝膠特性的果膠；TORRESVALENZUELA等[6]利用超分子溶劑對咖啡果皮中的生物活性物質(zhì)提取并分析了其生物活性；朱珂等[7]對比分析了咖啡果皮與不同來源的可溶性膳食纖維在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等方面的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)咖啡果皮可溶性膳食纖維的熱穩(wěn)定性和亞硝酸鹽吸附能力顯著優(yōu)于其他5種樣品；DASILVERIRA等[8]采用固態(tài)發(fā)酵研究了咖啡果皮中綠原酸的提取和穩(wěn)定性。

膳食纖維（DF）被認為是生物體中的第7種基本營養(yǎng)素，能通過腸道菌群產(chǎn)生多種有益作用，如抗肥胖、減輕炎癥、降低血糖等，可作為功能性食物成分廣泛應(yīng)用[9]。根據(jù)膳食纖維的溶解性將其分為可溶性膳食纖維（SDF）和不可溶性膳食纖維（IDF），與IDF相比，SDF由于其有效的溶解度、持油/持水能力、界面和表面性質(zhì)及結(jié)合各種分子的潛力而更受青睞[10]。提取方法和條件不同，對SDF的營養(yǎng)和理化性質(zhì)均有很大影響。目前，對咖啡果皮DF的研究主要集中在DF的制備、改性和功能特性方面的研究。DF常用的制備方法主要有化學(xué)法（如酸、堿處理）、物理法（如超聲波法、微波法、高壓均質(zhì)法）和生物法（如酶法、發(fā)酵法），研究中應(yīng)用較多的是物理法和酶法?；瘜W(xué)法雖已被廣泛運用于提取不同來源的纖維，如堿法提取，但因羥基離子會破壞氫鍵和酯鍵，導(dǎo)致SDF、半纖維素和纖維素的損失[11]，而且對環(huán)境不友好。酶法提取雖克服了堿提取法的pH值高、易腐蝕、廢物量大等缺點，但其反應(yīng)時間長、成本高，無法滿足常規(guī)需求。因此，探索安全、綠色、高效的提取方法很有必要。

近年來，低共熔溶劑（DES）作為一類綠色可持續(xù)溶劑，在功能性成分的提取方面得到較大發(fā)展。DES是由氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）按一定的摩爾比混合而成的二元或三元體系的液體混合物。與離子液體相比，DESs具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、可循環(huán)性好和熱穩(wěn)定性好等特性，而且具有制備簡單、生物相容性和環(huán)境友好等優(yōu)點[12]?；谶@些優(yōu)越的性能，有研究表明，DESs可作為替代溶劑從天然樣品中提取多糖[13]。如GUO等[14]采用遠紅外輻射（FIR）和熱風(fēng)循環(huán)（HAC）的輔助DES提取茯苓中的生物活性多糖，結(jié)果表明，優(yōu)化條件下茯苓多糖的提取效率是傳統(tǒng)提取方法的4～70倍。CHEN等[15]首次采用超聲輔助DES從芒果皮中提取果膠。超聲波作為一種非熱、無毒、安全、高效的綠色技術(shù)，已被應(yīng)用于食品工業(yè)中，其產(chǎn)生的空化、剪切和湍流作用能破壞細胞壁，促進溶劑的擴散，加快化合物的溶解，從而提高提取效率[16]。目前，還未見采用UAE-DESs提取咖啡果皮SDF的報道。因此，開發(fā)一種綠色的提取咖啡果皮中SDF的方法具有重要意義。

本研究以咖啡果皮為原料，采用UAE-DESs法制備咖啡果皮中可溶性膳食纖維，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗篩選最佳制備條件，進而建立一種綠色高效的提取咖啡果皮中SDF的方法。因此，UAE與DES的結(jié)合應(yīng)用為開發(fā)更綠色、更環(huán)保、更安全、更易于實施的萃取技術(shù)提供了條件，也為咖啡果皮SDF的綠色提取方法提供新思路和理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑咖啡鮮果（全紅果）采摘于海南省白沙縣咖啡種植基地。乙醇，購自西隴科學(xué)有限公司；氯化膽堿為分析純，購自上海源葉公司；1，3-丁二醇、甘油、尿素、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酰胺、乙二醇等均為分析純，購自上海阿拉丁公司。

1.1.2儀器與設(shè)備集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，購自鞏義市予華儀器有限公司；AvantiJXN-26高速冷凍離心機，購自美國貝克曼庫爾特有限公司；VOSHIN-1500C恒溫超聲波萃取儀，購自無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2方法1.2.1超聲輔助低共熔溶劑制備咖啡果皮可溶性膳食纖維（1）咖啡果皮預(yù)處理。將濕法加工得到的咖啡果皮40℃熱風(fēng)干燥至水分含量為11%左右，置于高速萬能粉碎機中粉碎，過60目篩，置于密封袋中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）DESs的制備。采用加熱攪拌的方法制備DESs[17]，制備步驟如下：將HBA與HBD按一定的摩爾比混合后，加入適量的水，置于80～90℃的磁力攪拌器中連續(xù)攪拌約3h，攪拌至形成均勻穩(wěn)定的透明液體，即低共熔溶劑，制備好的DESs保存在干燥皿中儲存?zhèn)溆谩?/p>

（3）咖啡果皮可溶性膳食纖維的綠色制備。

參考CHEN等[18]的實驗方法并略作修改，采用超聲輔助低共熔溶劑提取咖啡果皮可溶性膳食纖維：準確稱取3.0g咖啡果皮粉于燒杯中，按照液固比20∶1（mL/g）加入DESs溶劑攪拌均勻，置于超聲設(shè)備中，功率300W（頻率20～25KHz，變幅桿Φ12mm），超聲30min后，5000r/min離心10min，分離上清液，真空濃縮至原體積的1/4后，加入4倍體積無水乙醇醇沉5h，將混合物5000r/min離心10min，收集沉淀物，用無水乙醇反復(fù)洗滌，真空冷凍干燥，得咖啡果皮可溶性膳食纖維，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

超聲輔助水提法提取咖啡果皮可溶性膳食纖維的方法同上，略作修改。

1.2.2DESs的篩選為確定最佳提取溶劑，本研究對8種不同類型的DES進行SDF提取效果的評價。以不同的有機酸、多元醇和尿素與氯化膽堿的混合，在摩爾比和DES體系含水量固定的條件下，分別合成了1種尿素基DES（DES-1）、4種酸基DESs（DES-2、DES-3、DES-4和DES-8）、3種醇基DESs（DES-5、DES-6和DES-7），詳見表1。相比于常規(guī)溶劑，由于DESs的不同組分之間的氫鍵、范德華力和靜電相互作用使其具有更高的黏度[19]，為了提高提取效率，將所有不同的DESs體系添加質(zhì)量分數(shù)30%的水。具體操作如下：稱取3.0g咖啡果皮粉于燒杯中，按液固比20∶1（mL/g），分別加入1.2.1（2）中制備好的DES，設(shè)置超聲功率300W、超聲時間30min的條件下提取咖啡果皮中的可溶性膳食纖維，計算咖啡果皮可溶性膳食纖維的得率。

1.2.3單因素實驗設(shè)計從1.2.2提取結(jié)果中選擇可溶性膳食纖維得率最高的DES體系進行實驗，將DES摩爾比、DES含水量、液固比、超聲功率、超聲時間分別設(shè)置為1∶2、30%、40mL/g、300W、30min進行提取，考察其他影響因素對SDF得率的影響。各因素設(shè)置如下：DES摩爾比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、DES含水量（10%、20%、30%、40%、50%）、液固比（10、20、30、40、50mL/g）、超聲功率（100、200、300、400、500W）、超聲時間（10、20、30、40、50min）。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化實驗在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法和Box-Behnken模型設(shè)計對4個主要影響因素（X1：DES含水量、X2：液固比、X3：超聲功率、X4：超聲時間）進行優(yōu)化，并將SDF得率作為響應(yīng)指標，4個影響因素代碼水平的實驗設(shè)計分別為（–1、0和+1）和各變量的實際實驗值見表2。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS24.0軟件（IBMCorporation，NewYork，NY）進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Origin2018軟件（Northampton，MA，USA）進行制圖，BBD的分析使用Design-Expert12軟件（Stat-Ease，Minneapolis，MN）進行回歸分析和圖形優(yōu)化。所有實驗均重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1DES的篩選

由于不同的DES在極性、溶解度、黏度、表面張力和物理化學(xué)等方面存在差異，導(dǎo)致分子間作用強度不同，使其對目標提取物的提取效率不同[20]。由圖1可知，不同類型DESs溶劑對咖啡果皮SDF得率具有顯著性差異，其中DES-1（氯化膽堿/尿素）組成的DES體系SDF得率最高，為10.10%，顯著高于傳統(tǒng)溶劑水提法，其次為有機酸基DESs，醇基DESs提取效果較差。故確定氯化膽堿與尿素進行后續(xù)實驗。

2.2單因素實驗

2.2.1氯化膽堿/尿素摩爾比對咖啡果皮SDF得率的影響HBA/HBD摩爾比是影響DESs理化性質(zhì)的重要因素，HBD的比例越高，黏度越小。但當HBD比例過高時，不容易形成DESs[21]。由圖2可知，咖啡果皮SDF得率隨摩爾比的增大呈先增大后減小，當氯化膽堿/尿素的摩爾比為1∶2時，SDF得率最高，為9.87%，這可能是由于HBD的增加，使DES黏度和表面張力降低，有利于SDF的傳質(zhì)和溶出，導(dǎo)致SDF得率提高；當摩爾比繼續(xù)增大時，SDF得率反而降低，這可能是因為不同的摩爾比使DES體系的黏度和表面張力不同，過高的摩爾比反而會弱化溶劑與目標物的相互作用[22]。故確定摩爾比1∶2進行后續(xù)實驗。

2.2.2DES含水量對咖啡果皮SDF得率的影響由于大多數(shù)DESs的黏度很高，過高的黏度會導(dǎo)致質(zhì)量傳遞的速度緩慢，溶劑的萃取速率降低，所以通過含水量來調(diào)節(jié)DESs的黏度和極性[23-24]，但最佳含水量也與特定的化合物有關(guān)。由圖3可知，DES含水量在10%～40%之間時，SDF得率逐漸增大，可能是由于在DES中加入適量水，增加了DES分子流動性，降低了黏度，增加了擴散能力，使其能夠與咖啡果皮SDF充分接觸，SDF溶解度增大，當DES含水量為40%時SDF得率最大，為10.35%；但當DES含水量繼續(xù)增大時，過量的水可能限制了SDF與DES組分之間的相互作用，使SDF在DES中的溶解度大大降低，從而導(dǎo)致SDF提取效率下降[25]。故選擇DES含水量40%進行后續(xù)實驗。

2.2.3液固比對咖啡果皮SDF得率的影響由圖4可知，隨著液固比的增加，SDF得率顯著提高，當液固比為30mL/g時，SDF得率最高，為10.79%，但隨著液固比繼續(xù)增大，SDF得率逐漸降低。因為過低或過高的液固比會導(dǎo)致萃取不充分，或者隨著溶液用量的增加而增加不必要的消耗[26]。故選擇固液比30mL/g進行后續(xù)實驗。

2.2.4超聲功率對咖啡果皮SDF得率的影響由圖5可知，隨超聲功率的增大，SDF得率先逐漸增大，超聲功率在300W時，SDF得率最高，為10.64%；這可能是由于超聲波的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)增強，原料細胞被破壞，加快了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，并且強化了溶質(zhì)擴散，促進了目標物質(zhì)的溶出[27]；超聲功率在300～500W時，SDF得率減小，可能是因為超聲功率強度增加時，空化效應(yīng)限制了聲波在萃取介質(zhì)中的循環(huán)，給系統(tǒng)提供了不可控的機械剪切。此外，超聲功率過高，破壞了物料中已釋放的可溶性成分，使其進一步分解為小分子物質(zhì)而無法被乙醇沉淀[28]。故選擇超聲功率300W進行后續(xù)實驗。

2.2.5超聲時間對咖啡果皮SDF得率的影響由圖6可知，在10～30min時，SDF得率隨時間的延長而增加。超聲30min得率最高，為10.63%；但當時間超過30min后，SDF得率下降。其原因可能是細胞內(nèi)外SDF濃度在30min前未達到平衡。隨著時間的增加，SDF逐漸溶解，當細胞內(nèi)外達到平衡狀態(tài)時，提取溶劑中SDF的濃度不再增加，達到平衡后，SDF由于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在超聲的作用下發(fā)生水解[29-30]。

2.3響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.3.1試驗設(shè)計與結(jié)果分析根據(jù)2.2結(jié)果分析，確定氯化膽堿/尿素的摩爾比為1∶2，以DES含水量、液固比、超聲功率和超聲時間作為主要影響因素，SDF得率（Y）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.3.2回歸模型顯著性檢驗及方差分析采用Design-Expert12對BBD獲得的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到DES含水量、液固比、超聲功率、超聲時間對響應(yīng)值Y的二次多項式回歸方程如下：Y=–48.44181+1.60843X1+0.669012X2+0.054241X3+0.469143X4–0.005016X1X2–0.000054X1X3–0.004544X1X4–0.000210X2X3+0.002862X2X4+0.000262X3X4–0.016000X12–0.007701X22–0.000087X32–0.006849X42。

由表4可知，模型P<0.0001，F(xiàn)值為125.42，失擬項差異不顯著，證實了模型的高度顯著性。擬合優(yōu)度可以通過確定系數(shù)（R2）、調(diào)整確定系數(shù)（RAdj2）和方差系數(shù)（CV）來驗證。確定系數(shù)（R2=0.9932）和調(diào)整后的確定系數(shù)（RAdj2=0.9853）表明該模型證實了模型的高度擬合優(yōu)度。同時，CV值為1.23，顯示了數(shù)據(jù)極好的可靠性。模型的有效性較低證實了回歸模型實驗值的準確性和可靠性。P值不僅揭示了各系數(shù)的顯著性，而且解釋了自變量的相互作用模式。一次項和二次項X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42對SDF得率的影響極顯著（P<0.01）；交互項X1X2、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4極顯著（P<0.01），說明DES含水量和液固比、DES含水量和超聲功率、液固比和超聲功率、液固比和超聲時間、超聲功率和超聲時間之間的交互作用對SDF得率的影響較強；其余因子影響不顯著。根據(jù)表4中各因子的P值和F值可知，各因子對SDF得率影響大小為：超聲時間>液固比>DES含水量>超聲功率。

2.3.3響應(yīng)面結(jié)果分析基于模型的3D響應(yīng)面圖，通過超聲輔助DES提取SDF的得率顯然與主要變量相關(guān)。3D響應(yīng)面圖反映了各因素對SDF得率的相互影響。如圖7～圖11所示，DES水含量與液固比、DES含水量與超聲時間、液固比與超聲功率、液固比和超聲時間、超聲功率與超聲時間對得率有顯著的正向影響。響應(yīng)等高線圖顯示了各因素對SDF得率的顯著性，且等高線圖趨于橢圓形，說明交互作用顯著；圖12響應(yīng)曲面較平緩，且等高線圖趨于圓形，說明DES含水量與超聲功率的交互作用對SDF得率不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

2.3.4預(yù)測模型驗證實驗由圖13A可知，殘差正態(tài)分布圖的點接近直線，表明其滿足了正態(tài)性假設(shè)；由圖13B可知，殘差隨機分散，表明觀察的原始方差對所有值都是確定的；由13圖C可知，實驗預(yù)測值與實際值之間的誤差較小。因此，該模型可預(yù)測響應(yīng)面的提取得率。

使用DesignExpert12軟件分析，確定提取咖啡果皮SDF得率最大的提取條件：DES含水量為39.91%，液固比為32.37mL/g，超聲功率為305.20W，超聲時間為33.80min，在此條件下提取咖啡果皮SDF的得率可達到理論最大值10.80%。考慮到實際操作和儀器的可行性，將最佳提取工藝參數(shù)分別修改為X1=40%、X2=32mL/g、X3=305W、X4=34min，利用改進后的提取參數(shù)重復(fù)實驗3次，SDF得率為10.74%±0.14%，與模型預(yù)測值10.80%接近，說明該模型適用于超聲輔助DESs法提取咖啡果皮SDF的優(yōu)化。

3討論

本研究初步探索采用超聲輔助DES法制備咖啡果皮SDF的綠色新方法。通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定了最佳的制備條件，結(jié)果表明，UAE-DES法提取得率為10.74%±0.14%，顯著高于傳統(tǒng)水提法6.50%±0.22%。DONG等[31]研究了不同提取方法（化學(xué)法、酶法、化學(xué)-酶法、超聲輔助酶法和剪切乳化輔助酶法）對咖啡皮SDF的理化、結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。結(jié)果表明，剪切乳化輔助酶法提取SDF的得率最高（13.96%），其次是超聲輔助酶法（13.04%）、酸-酶法（11.38%）和酶法（9.54%），酸提取的得率最低（9.16%）。與本研究結(jié)果相比，復(fù)合法（物理結(jié)合酶法）中，雖然部分方法提取SDF的得率高于UAE-DES法，但酶法提取的條件要求比較嚴格，且生產(chǎn)成本較高，而UAE-DES法提取有諸多優(yōu)點，如成本低、簡單易得、安全、可生物降解、具有可設(shè)計性等，而且可從不同的食品基質(zhì)中提取化學(xué)成分，滿足了現(xiàn)代加工對環(huán)境友好的需求。WANG等[32]采用天然低共熔溶劑（NADES）結(jié)合超聲輔助酶解（UAEE）提取柴胡多糖，結(jié)果表明，最佳DES體系為摩爾比為1∶3的尿素與氯化膽堿，其含水量為20%，這與本研究的最佳DES體系一致；CHEN等[15]采用超聲輔助天然低共熔溶劑提取芒果皮中的果膠，篩選了甜菜堿-檸檬酸和氯化膽堿-蘋果酸2種新型綠色溶劑，并通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗進一步優(yōu)化提取條件，結(jié)果表明，2種DES提取的果膠含量顯著高于鹽酸提取的果膠含量。由于不同物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和組成不同，因此，DES與目標物質(zhì)間的相互作用力不同，故篩選出的最佳DES不同，基于上述文獻表明，不同物質(zhì)在結(jié)構(gòu)和組成方面的差異，使得DES與目標物質(zhì)間的相互作用力不同，進而篩選得到的最佳DES不同。但UAE-DES法在提取食品功能性成分方面依然存在巨大潛力。然而，DES的高黏度仍是提取過程中最主要的缺點，如何降低DES黏度是今后研究的重點，同時明確HBA與HBD的選擇，使其提取優(yōu)勢最大化，最終為生物活性物質(zhì)的提取和食品分析預(yù)處理等方面提供更多的選擇。因此，本研究為咖啡果皮SDF的提取提供了一種綠色、經(jīng)濟、環(huán)保的替代方法，為SDF的綠色提取提供了新思路，在未來設(shè)計使用咖啡副產(chǎn)品的功能性食品配方時具有重要意義。