阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響*

任　薇，孫耕耘，王　勝，熊玲玲，朱春冬，李春穎，周　群(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥3003;安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸內(nèi)科，安徽合肥300)

·短篇論著·

阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響*

任薇1，2，孫耕耘1△，王勝2，熊玲玲2，朱春冬2，李春穎2，周群2
(1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽合肥230031;2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部呼吸內(nèi)科，安徽合肥230022)

目的:研究阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)模型大鼠的防治作用，從氣道炎癥及黏液高分泌角度探討其作用機(jī)制。方法:將18只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、慢阻肺模型組、阿奇霉素治療組，每組6只。通過煙熏及大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型。HE染色觀察大鼠肺組織病理變化。肺功能儀檢測大鼠肺通氣功能。ELISA檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞介素(IL) -8、IL-17和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。Western blot及real-time PCR檢測支氣管肺組織中MUC5ac和Toll樣受體4(TLR4)蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果:模型組大鼠支氣管肺組織HE染色結(jié)果符合慢阻肺病理改變。與模型組比較，治療組損傷程度顯著減輕。模型組與對照組比較，肺功能明顯下降，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量明顯增高(P＜0. 05)，肺組織中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0. 05)。與模型組比較，治療組肺功能的下降減輕，大鼠BALF中IL-8、IL-17、TNF-α含量的升高受到明顯抑制(P＜0. 05)，肺組織中MUC5ac和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平的受到明顯抑制(P＜0. 05)。結(jié)論:阿奇霉素可降低慢阻肺模型大鼠BALF中IL-8、IL-17和TNF-α水平，抑制肺組織內(nèi)MUC5ac和TLR4蛋白表達(dá)，通過減輕氣道炎癥及黏液高分泌來達(dá)到防治慢阻肺的作用。

慢性阻塞性肺疾病;阿奇霉素;氣道炎癥;氣道黏液高分泌

［ABSTRACT］AIM: To observe the effect of azithromycin on the rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD)，and to explore the underlying mechanism about the airway inflammation and mucus hypersecretion.METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal control group，COPD model group，azithromycin treatment group.The COPD model was established by the method of cigarette smoking combined with intratracheal injection of LPS.Pathological changes of the bronchi and lung tissues of the rats were observed with HE staining.Pulmonary ventilation function in the rats was detected with pulmonary function instrument.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA.The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in bronchi and lung tissues was determined by real-time PCR and Western blot.RESULTS: HE staining showed that the changes of bronchi and lung tissues in model group were consistent with typical pathological manifestations of COPD.Compared with model group，these changes were alleviated in treatment group.The pulmonary functions in model group were significantly decreased compared with control group.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF in model group were significantly increased compared with control group (P＜0. 05).The expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels inmodel group was significantly higher than that in control group (P＜0. 05).Compared with model group，the degree of the descent in pulmonary function in treatment group was significantly lessened.Compared with model group，the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in treatment group were significantly inhibited (P＜0. 05).Furthermore，the expression of MUC5ac and TLR4 at mRNA and protein levels in treatment group was significantly lower than that in model group (P＜0. 05).CONCLUSION: Azithromycin decreases the levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of COPD model rats，inhibits the protein expression of MUC5ac and TLR4 in the lung tissues，thus playing a preventive and therapeutic role to reduce airway inflammation and airway mucus hypersecretion.

［KEY WORDS］Chronic obstructive pulmonary disease; Azithromycin; Airway inflammation; Airway mucus hypersecretion

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD;簡稱慢阻肺)是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要以不完全可逆的氣流受限為特征［1］。其氣流受限進(jìn)行性發(fā)展與氣道慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)。同時(shí)合并存在的黏液高分泌亦可導(dǎo)致氣道狹窄，加快肺功能下降進(jìn)程［2］?；颊叩牟贿m多表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰、胸悶氣喘。阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，有臨床研究發(fā)現(xiàn)長期小劑量阿奇霉素口服可預(yù)防慢阻肺急性發(fā)作，降低患者住院率及死亡率，但具體機(jī)制尚不清楚［3］。本研究擬從動物實(shí)驗(yàn)觀察阿奇霉素對慢阻肺的防治作用，并探討其是否可能通過改善氣道炎癥、改善氣道黏液高分泌發(fā)揮作用。

材料和方法

1動物

18只雄性SD大鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心(許可證號SCXK蘇2009-0002)，清潔級，6～8周齡，體重(200±20) g。

2試劑與儀器

阿奇霉素(輝瑞公司) ; LPS(Sigma) ; RSE3020動物肺功能儀器(北京貝蘭博科技有限公司) ; ELISA檢測試劑盒(上海源葉生物技術(shù)有限公司) ; RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所) ; AF-10型自動制冰機(jī)(SCOTSMAN) ; JW-3021HR高速臺式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司) ; TRIzol Reagent(Invitrogen) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo) ; ABI2720型普通PCR儀(ABI) ; DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠) ;熒光定量PCR儀(Thermo)。

3主要方法

3.1大鼠COPD模型的建立SD大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:①正常對照(control)組，生理鹽水10 mL·kg－1·d－1灌胃共8周;②慢阻肺模型(model)組:生理鹽水10 mL·kg－1·d－1灌胃4周后，開始造模，造模第1天、第14天，腹腔注射6%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉大鼠，氣管注入LPS 200 μL(1g/L)，第2～28天(第1天、14天除外)每日上午將大鼠置于密封的1 m3煙室中，持續(xù)吸入香煙煙霧(滁州煙卷廠生產(chǎn)的紅三環(huán)香煙，焦油量19 mg，尼古丁1. 2 mg) 30 min，每天15支，每天熏1次，同時(shí)每天繼續(xù)生理鹽水灌胃;③阿奇霉素治療(treatment)組，阿奇霉素(8. 3 g/L) 10 mL/kg灌胃4周后，造模方法同前，造模同時(shí)每天繼續(xù)阿奇霉素灌胃治療。造模4周后，處死大鼠。

3.2大鼠肺功能測定大鼠麻醉后分離暴露氣管，進(jìn)行氣管插管并固定，用動物呼吸機(jī)測定用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、0. 1s用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0. 1 second，F(xiàn)EV0. 1)、呼氣峰值流速(peak expiratory flow，PEF)。

3.3大鼠支氣管肺泡灌洗麻醉狀態(tài)下測定大鼠肺功能后，迅速打開胸腔，將灌胃針頭從切口處插入氣管，用4 mL生理鹽水灌洗右肺，反復(fù)進(jìn)行3次，共回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)約7 mL，1 500 r/min離心15 min，取上清－20℃保存。

3.4肺組織病理學(xué)檢查取右肺組織，置于4%甲醛中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

當(dāng)前HSE管理體系得到了企業(yè)和社會的共同認(rèn)可，HSE管理體系建設(shè)、體系運(yùn)行正在成為企業(yè)的重要任務(wù)。應(yīng)從HSE管理體系運(yùn)行的實(shí)際出發(fā)，以深入剖析、系統(tǒng)研究為基本路徑，找到解決HSE管理體系運(yùn)行問題和提升HSE管理體系運(yùn)行效能的策略和方法，實(shí)現(xiàn)對HSE管理體系的系統(tǒng)改進(jìn)和科學(xué)優(yōu)化，在企業(yè)管理層面和功能體系上促進(jìn)企業(yè)內(nèi)在、全面、跨越式地發(fā)展。

3.5BALF中IL-8、IL-17和TNF-α含量的測定應(yīng)用ELISA法進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

3.6Western blot檢測MUC5ac和TLR4的表達(dá)取新鮮肺組織，加蛋白裂解液冰上研磨裂解，加入EP管中反復(fù)凍融，離心后取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別加I 抗4℃過夜，PBS洗滌3次后，加入相應(yīng)的II抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，ECL試劑盒顯色，X線膠片曝光。條帶的灰度值用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)測定。

3.7Real-time PCR檢測MUC5ac mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)用TRIzol提取肺組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，MUC5ac、TLR4、GAPDH引物序列見表1。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明設(shè)置PCR反應(yīng)體系，具體如下: 2×SYBR Green Mixture 5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、雙蒸水2 μL。以GAPDH為內(nèi)參照，上機(jī)進(jìn)行檢測，擴(kuò)增條件為: 95℃5 min; 95℃10s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)量采用2－ΔΔCt法計(jì)算。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，繼而采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩間比較。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組大鼠肺功能的檢測結(jié)果比較

治療組肺功能明顯低于對照組，但顯著優(yōu)于模型組(P＜0. 05)，見表2。

表2　各組大鼠肺功能指標(biāo)變化Table 2.Changes of lung function indexes (Mean±SD.n =6)

2各組大鼠肺組織病理學(xué)改變比較

對照組的支氣管管壁未見增厚，支氣管管壁及肺泡結(jié)構(gòu)完整，纖毛未見脫落;模型組的氣管壁增厚明顯，管腔狹窄，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，融合成大皰，上皮細(xì)胞大量脫落，纖毛倒伏、脫落明顯，支氣管壁及血管周圍有多種炎性細(xì)胞浸潤;治療組的支氣管管壁輕度增厚，管腔可見局部輕度變形，部分肺泡融合，上皮細(xì)胞少量脫落，部分纖毛倒伏，支氣管壁及血管周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組的支氣管、肺組織改變符合慢阻肺的病理表現(xiàn)，治療組支氣管肺組織損傷程度輕于模型組，見圖1。

Figure 1.The pathological changes of the rat lung tissues (HE staining，×100).圖1　各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

3大鼠支氣管肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α含量的測定結(jié)果

模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α含量均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見表3。

表3　各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17和TNF-α的含量Table 3.The levels of IL-8，IL-17 and TNF-α in the BALF of the rats (ng/L.Mean±SD.n =6)

4大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白相對表達(dá)水平

模型組支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見圖2。

5大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4 mRNA相對表達(dá)水平

模型組支氣管肺組織MUC5ac和TLR4的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組(P＜0. 05)，而治療組均顯著低于模型組(P＜0. 05)，見表4。

討論

有研究顯示熏香煙加氣管注入內(nèi)毒素所致大鼠呼吸系形態(tài)和功能的改變，與人類慢阻肺病理改變相符［4］。本實(shí)驗(yàn)通過煙熏和氣管內(nèi)注入LPS的方法復(fù)制慢阻肺大鼠模型。HE染色觀察到慢阻肺組大鼠支氣管壁及血管周圍以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤明顯，上皮細(xì)胞可見纖毛倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞增多，黏液腺體增生，氣管壁膠原纖維顯著增多，管壁增厚伴管腔狹窄，肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔擴(kuò)大、融合成大皰等肺氣腫改變。其肺功能指標(biāo)下降明顯，提示慢阻肺造模成功。慢阻肺表現(xiàn)氣道慢性炎癥病變，氣道炎癥可致杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增加，而黏液分泌增加易繼發(fā)感染加重氣道炎癥改變。氣道炎癥和氣道高分泌二者互相影響。有報(bào)道顯示大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有一定的抗炎作用［5］，本實(shí)驗(yàn)觀察阿奇霉素治療組大鼠較模型組大鼠病理及肺功能均有明顯改善，提示可能對于慢阻肺有一定的防治作用。

Figure 2.The protein expressions of MUC5ac and TLR4 in the bronchi and lung tissues.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05 vs control group;#P＜0. 05 vs model group.圖2　支氣管肺組織MUC5ac和TLR4蛋白表達(dá)變化

表4　各組大鼠支氣管肺組織MUC5ac和TLR4 mRNA的相對表達(dá)水平Table 4.The mRNA levels of MUC5ac and TLR4 in bronchi andlung tissues (Mean±SD.n =6)

多項(xiàng)研究表明IL-8和TNF-α在慢阻肺氣道炎癥過程中發(fā)揮肯定而重要的作用［6-7］。其作為炎性反應(yīng)因子，在慢阻肺患者痰液、血液和支氣管肺泡灌洗液中均有顯著升高［8-9］。近年來IL-17在慢阻肺發(fā)病研究中受到重視。研究表明IL-17能通過促進(jìn)IL-8、TNF-α的釋放，使中性粒細(xì)胞氣道內(nèi)聚集增多，參與慢阻肺氣道炎癥［10］。本研究顯示模型組肺泡灌洗液IL-8、IL-17和TNF-α較對照組明顯升高，阿奇霉素治療后相關(guān)指標(biāo)下降，提示阿奇霉素對慢阻肺氣道炎癥的防治效果可能與此作用有關(guān)。

吸煙是COPD的主要病因之一，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)吸煙可促進(jìn)MUC5ac的合成和分泌［11］。黏蛋白MUC5ac是氣道黏液的主要成分，由杯狀上皮細(xì)胞分泌，一些促炎因子如IL-1β、TNF-α，以及細(xì)菌毒性產(chǎn)物均可促進(jìn)其合成［12］。有報(bào)道提出慢阻肺患者的氣道中TLR4表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞過度分泌MUC5ac黏蛋白，高黏液分泌狀態(tài)導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)放大，是慢阻肺進(jìn)行性發(fā)展的重要因素［13］。并且隨著氣道慢性炎癥的長期存在，可誘導(dǎo)小氣道中無黏液分泌功能細(xì)胞向黏液上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，過多黏液分泌加重氣道的狹窄阻塞，加劇肺功能的下降［14-15］。本研究對于TLR4及MUC5ac黏蛋白通過Western blot和real-time PCR方法進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)果顯示模型組較對照組大鼠支氣管肺組織蛋白表達(dá)水平明顯升高，阿奇霉素治療組各指標(biāo)較模型組明顯下降。提示阿奇霉素可能通過改善控制氣道黏液高分泌狀態(tài)，以達(dá)到防治慢阻肺的目的。

慢阻肺發(fā)生發(fā)展與氣道炎癥、氣道黏液高分泌密切相關(guān)。研究指出［16］阿奇霉素可抑制NF-κB表達(dá)。NF-κB具備多向調(diào)節(jié)功能，其作為上游啟動因子涉及到慢阻肺氣道炎癥多個(gè)環(huán)節(jié)。炎癥反應(yīng)產(chǎn)生、炎癥介質(zhì)釋放可激活NF-κB，NF-κB激活后進(jìn)一步促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，如TNF-α、IL-8等。其通過基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，可產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)［17］。同時(shí)Fujisawa等［18］觀察發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β和IL-17A通過NF-κB通路轉(zhuǎn)錄機(jī)制，調(diào)控誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞分泌MUC5ac，提示NF-κB與細(xì)胞因子特異性結(jié)合，影響氣道MUC5ac表達(dá)。TLR-4是病原分子識別受體，激活后可導(dǎo)致IκB磷酸化降解，參與NF-κB的激活［19］，引起核因子κB信號通路開放，誘導(dǎo)氣道MUC5ac表達(dá)。阿奇霉素有可能通過NF-κB通路，達(dá)到改善氣道炎癥、控制氣道黏液高分泌的作用。

總之，本研究顯示，對于慢阻肺模型大鼠，阿奇霉素能夠減輕慢阻肺相關(guān)病理損傷，減緩肺功能的下降，降低肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α炎癥因子水平，降低大鼠支氣管肺組織TLR4及MUC5ac黏蛋白表達(dá)，說明阿奇霉素有可能通過改善氣道炎癥和氣道黏液高分泌，以達(dá)到防治慢阻肺的作用。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，余小慧)

Effect of azithromycin on airway inflammation and airway mucus hypersecretion in rats with chronic obstructive pulmonary disease

REN Wei1，2，SUN Geng-yun1，WANG Sheng2，XIONG Ling-ling2，ZHU Chun-dong2，LI Chun-ying2，ZHOU Qun2
(1Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230031，China;2Department of Geriatric Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230022，China.E-mail: sungengyun@tom.com)

R563. 3; R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.007

1000-4718(2015)10-1767-05

2015-04-28

2015-08-04

安徽高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.KJ2013Z182)

△Tel: 0551-62922904; E-mail: sungengyun@tom.com