糖皮質激素激活自噬對軟骨細胞衰老的影響*

薛恩興，張　雪，陳成旺，張　宇(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院關節(jié)外科，手術室，浙江溫州35000)

糖皮質激素激活自噬對軟骨細胞衰老的影響*

薛恩興1△，張雪2，陳成旺1，張宇1
(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院1關節(jié)外科，2手術室，浙江溫州325000)

目的:探討糖皮質激素對關節(jié)軟骨細胞衰老和自噬影響，并分析自噬在其中的作用及機制。方法:培養(yǎng)SD大鼠軟骨細胞，阿利辛染色和collagen II免疫組化進行鑒定。使用不同濃度的地塞米松作用于軟骨細胞不同的時間后，LysoTracker Red和MDC染色觀察自噬囊泡的生成，Western blot檢測LC3、beclin-1、P62、p70S6K 和4EBP1蛋白表達的變化。β-半乳糖苷酶染色分析糖皮質激素對軟骨細胞衰老的影響，并使用自噬抑制劑來探討自噬對地塞米松作用下軟骨細胞衰老的作用。結果:地塞米松可以顯著提高軟骨細胞的自噬水平，尤其是在作用4 d后，LC3-II表達隨著地塞米松濃度的增加而升高，而P62和beclin-1的表達也驗證自噬水平的升高。LysoTracker Red和MDC染色發(fā)現(xiàn)軟骨細胞中自噬泡的生成隨著地塞米松濃度的升高而增加。mTOR信號通路上的p70S6K和4EBP1的磷酸化均被地塞米松抑制。更重要的是，地塞米松可以引起軟骨細胞的衰老，而使用3-MA抑制自噬后，細胞進一步衰老。結論:糖皮質激素激活軟骨細胞中的自噬，并同時誘導軟骨細胞的衰老，而自噬在這過程中對細胞的衰老可能具有代償性的保護作用。同時糖皮質激素抑制mTOR信號通路，可能與自噬的激活相關。

糖皮質激素;軟骨細胞;自噬;衰老

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of glucocorticoid on autophagy and senescence in the chondrocytes.METHODS: The collagen II in the normal chondrocytes isolated from the SD rats was checked.After stimulation with glucocorticoid，LysoTracker Red staining，MDC staining and Western blot were used to detect the level of autophagy in the chondrocytes.The mTOR pathway related molecules were investigated by Western blot.Cell senescence was analyzed by SA-β-gal staining.RESULTS: A dose-dependent increase in the number of autophagic vacuoles was observed in the dexamethasone-treated chondrocytes，which was demonstrated by the LysoTracker Red and MDC staining.The expression of LC3-II and beclin-1 was increased by dexamethasone，especially in the cells treated with dexamethasone for 4 d.However，P62 expression was decreased.SA-β-gal staining showed that the percentage of cell senescence was increased by dexamethasone.Surprisingly，the cell senescence induced by dexamethasone was exacerbated by the autophagic inhibitor 3-MA.CONCLUSION: Autophagy induced by dexamethasone protects chondrocyte from senescence.The mTOR pathway may be involved in the autophagy activation.

［KEY WORDS］Glucocorticoids; Chondrocyte; Autophagy; Senescence

骨關節(jié)炎是骨科常見的疾病，在美國25歲以上人群的骨性關節(jié)炎發(fā)病率約14%，每年近40萬骨性關節(jié)炎患者住院［1］。臨床上，局部關節(jié)腔內注射糖皮質激素可以明顯緩解骨關節(jié)炎，具有顯著的抗炎、止痛和減輕膝關節(jié)功能障礙的作用，但是長期、反復注射糖皮質激素又會干擾軟骨細胞代謝，加速軟骨細胞凋亡壞死，最終加重骨關節(jié)炎病情。骨關節(jié)炎是與年齡密切相關的疾病，細胞衰老是關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要參與因素，然而糖皮質激素對軟骨細胞衰老的影響尚缺乏研究。

自噬被認為是軟骨細胞的自我保護機制，且外源性激發(fā)自噬亦可以保護軟骨細胞和關節(jié)軟骨［2-3］，但是糖皮質激素對軟骨細胞自噬水平的調節(jié)作用，以及自噬對細胞衰老的具體作用仍然未知。本文擬使用地塞米松(dexamethasone，DEX)作用軟骨細胞，并檢測自噬與衰老指標以了解糖皮質激素對軟骨細胞衰老和自噬的影響，以及自噬在其中所扮演的作用。

材料和方法

1實驗試劑與材料

地塞米松、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、胎牛血清和青/鏈雙抗購自Sigma; DMEM-F12培養(yǎng)基、0. 25%胰蛋白酶、II型膠原酶和MDC熒光染料均購自Gibco;細胞裂解液、PMSF、SDS上樣緩沖液、總蛋白提取和BCA蛋白分析試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜和Lyso-Tracker Red試劑盒均購自江蘇碧云天公司;兔抗鼠多克隆抗體、II型膠原、LC3、beclin-1、P62、p-p70S6K、p70S6K、p-4EBP1、4EBP1、β-actin購自CST;細胞培養(yǎng)瓶和多孔板購自Corning。

2關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)和處理

30只雄性SD大鼠(3月齡，250～300 g)，使用10%水合氯醛(3. 5 mL/kg)麻醉后安樂死。整體取出膝關節(jié)，在顯微鏡下分離膝關節(jié)軟骨組織。首先使用0. 25%胰酶消化30 min，再使用0. 1% II型膠原酶在37℃消化軟骨組織4 h，再使用200目的濾網(wǎng)過濾細胞。軟骨細胞培養(yǎng)在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的高糖DMEM(1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素) 在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞融合到80%～90%的時候，使用0. 25%的含EDTA的胰酶進行消化傳代。本實驗所有的細胞均為軟骨細胞第2代。

在DEX處理之前，用1% FBS培養(yǎng)基處理12 h，按地塞米松濃度分為5組: 0 mg/L、0. 1 mg/L、1 mg/ L、25 mg/L、50 mg/L組，作用時間分別為2 d、4 d和6 d。3-MA與地塞米松混合分為4組:正常對照(control)組、3-MA(10 mmol/L)組、3-MA + DEX(25 mg/L)組和DEX。因為本實驗所涉及的地塞米松是使用培養(yǎng)基和無水乙醇進行配置，以上對照組中，均加入1 mL/L的無水乙醇作為對照。

3實驗方法

3.1LysoTracker Red染色細胞以2×105的密度鋪在24孔板上，以上述不同濃度的地塞米松處理細胞4 d后。使用新鮮的培養(yǎng)基洗滌細胞3遍，使用培養(yǎng)基將LysoTracker Red稀釋成66 mmol/L，滴加1 mL后，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。使用PBS洗滌3遍后，在倒置熒光顯微鏡下使用綠色濾光片觀察細胞的染色情況。

3.2MDC染色在體外研究中，MDC是被廣泛地用來標記細胞中自噬囊泡的水平。與LysoTracker Red染色相似，處理關節(jié)軟骨細胞后使用PBS清洗3遍后，在不固定軟骨細胞的情況下，使用0. 05 mmol/L MDC在37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。PBS洗滌細胞3次，直接在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，使用紫外激發(fā)光。為了觀察細胞的自噬率，上述染色后的細胞再上流式細胞儀進行檢測。

3.3Western blot將處理過的細胞用PBS洗滌，常規(guī)裂解提取蛋白，使用BCA試劑盒測算總蛋白濃度并制成蛋白樣品。上樣量為30 μg，總體積是20 μL，使用12%的分離膠分離蛋白后，將LC3目的蛋白轉至0. 22 μm大小的PVDF膜上，而beclin-1、p62和內參照則轉至0. 45 μm的膜上。300 mA恒流轉膜，LC3轉移20 min，beclin-1轉移55 min，而P62轉移90 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗滌3次，每次5 min。LC3、beclin-1和p62的I抗均1∶1 000稀釋。膜洗凈后放在I抗中，4℃搖床孵育過夜。再次使用TBST洗滌3次，取出膜后放置在II抗中，II抗使用5%脫脂奶粉稀釋(1∶5 000)，37℃室溫2 h。取出膜后再使用上述方法洗滌。預先將ECL試劑A液、B液等體積混合，制成反應液后，滴加至PVDF膜上，使液體覆蓋到整張膜。將滴加了發(fā)光液的膜轉移至化學發(fā)光顯像儀。

3.4β-半乳糖苷酶染色25 mg/L的地塞米松處理軟骨細胞24 h、48 h和72 h，使用試劑盒中β-半乳糖苷酶的固定液在室溫下固定15 min。PBS清洗3遍，使用β-半乳糖苷酶染液染色12 h，β-半乳糖苷酶染液含有1 g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、5 mol/L鐵氰化鉀、150 mmol/L氯化鈉和2 mmol/L氯化鎂。染色后在倒置顯微鏡下觀察細胞，在200倍的放大情況下觀察陽性細胞在總細胞中的百分比。

4統(tǒng)計學處理

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16. 0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較用Turkey’s方法進行檢測，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1軟骨細胞的鑒定

在相差顯微鏡下觀察，關節(jié)軟骨細胞呈現(xiàn)多邊形和星形，且細胞胞質中含有豐富的顆粒。甲苯胺藍和阿利辛染色分別將細胞染成紫色和淺藍色，這說明細胞中含有豐富的蛋白多糖，II膠原的免疫組化表明細胞中含有大量的II型膠原，并主要分布在細胞核周圍，上述結果證明該細胞為能分泌蛋白多糖和II型膠原的關節(jié)軟骨細胞，見圖1。

Figure 1.The culture and identification of nucleus pulposus cells.A: the observation of the cells under phasecontrast microscopy; B: Toluidine blue staining; C: Alcian blue staining; D: immunochemistry for collagen II.圖1　軟骨細胞的培養(yǎng)和鑒定

2糖皮質激素促進關節(jié)軟骨細胞中自噬泡合成

為了解糖皮質激素是否可以促進軟骨細胞發(fā)生自噬，我們使用不同濃度的地塞米松作用軟骨細胞4 d，并使用LysoTracker Red染色和MDC染色觀察軟骨細胞中的自噬泡。對照情況下，僅有少量的軟骨細胞LysoTracker Red染色呈現(xiàn)陽性，但是隨著地塞米松濃度的增大，呈LysoTracker Red染色陽性的細胞越來越多。在50 mg/L的地塞米松作用4 d后，大部分的軟骨細胞的LysoTracker Red的染色呈陽性，說明地塞米松可以促進軟骨細胞自噬泡的合成，見圖2。

與LysoTracker Red染色相似，在正常對照組，只有少數(shù)細胞可以吸收MDC染色，因此只有少量細胞含有高亮的點狀熒光，但是隨著地塞米松濃度的增加，含有高亮點狀自噬泡的軟骨細胞逐漸增多。將MDC染色后的軟骨細胞使用流式細胞儀進行檢測，1 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的地塞米松作用4 d后，自噬的發(fā)生率與對照組相比明顯升高(P＜0. 05)。在50 mg/L組，自噬的發(fā)生率平均為56. 74%，見圖3。

Figure 2.The LysoTracker Red staining of chondrocytes treated with dexamethasone at different concentrations.An dose-dependent increase in the intensity of LysoTracker Red staining in chondrocytes stimulated with dexamethasone was found.圖2　軟骨細胞的LysoTracker Red染色

Figure 3.The MDC staining and flow cytometry analysis of chondrocytes treated with dexamethasone.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖3　軟骨細胞的MDC染色和流式細胞儀檢測結果

3糖皮質激素上調自噬相關蛋白

為了進一步分析糖皮質激素對關節(jié)軟骨細胞自噬的調節(jié)作用，我們使用Western blot法分析地塞米松作用軟骨細胞后LC3、beclin-1和p62的表達水平。當?shù)厝姿勺饔密浌羌毎? d后，不同組之間的LC3-II/β-actin的區(qū)別并不明顯;但是在作用4 d后，LC3-II/β-actin的水平隨著地塞米松劑量的增加明顯升高;而在作用6 d后，高濃度(50 mg/L)地塞米松組的LC3-II/β-actin水平出現(xiàn)了一定的下降。而p62 和beclin-1表達的變化基本與LC3-II的變化一致，但p62在作用2 d的時候就已經(jīng)隨著地塞米松濃度的增加而逐漸的下降，見圖4。

4糖皮質激素抑制mTOR信號通路

自噬的激活機制主要涉及到mTOR依賴和非mTOR依賴的信號通路，p70S6K和4EBP1是mTOR下游的信號分子。1 mg/L和25 mg/L的地塞米松作用后，p-p70S6K和p-4EBP1的表達水平相對于對照組明顯降低，這說明在糖皮質激素的作用下，mTOR信號通路被抑制，見圖5。

5糖皮質激素及自噬對軟骨細胞衰老的作用

隨著25 mg/L的糖皮質激素作用時間的延長，關節(jié)軟骨細胞的β-半乳糖苷酶陽性率明顯升高，作用72 h后最高。由于細胞的衰老，β-半乳糖苷酶陽性的細胞胞漿中染成藍色。但是使用3-MA與地塞米松共同作用軟骨細胞72 h，3-MA抑制自噬水平后，軟骨細胞中β-半乳糖苷酶的陽性率相對于單純糖皮質激素的明顯升高，并且單純的3-MA并沒有引起陽性細胞的增多，見圖6。

討論

在本研究中，我們證實了糖皮質激素可以通過抑制mTOR信號通路激活關節(jié)軟骨細胞中的自噬，同時糖皮質激素可以引起軟骨細胞的衰老，而自噬對于糖皮質激素作用下的細胞的衰老具有一定的抑制作用，抑制自噬后，細胞的衰老反而加劇。

糖皮質激素被廣泛地用于治療骨關節(jié)炎引起的各種癥狀，但是長期、反復的使用往往帶來各種不同的并發(fā)癥［4-5］，更重要的是糖皮質激素會引起軟骨細胞的凋亡，阻止軟骨細胞的生長和降低軟骨細胞的活性［5-6］。軟骨細胞凋亡會引起軟骨中細胞數(shù)量的減少，并減少細胞外基質如蛋白多糖和II型膠原的合成的減少，因此軟骨細胞的凋亡是骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素［7-8］。而自噬與凋亡相似，亦是程序性細胞死亡，雖然有研究報道糖皮質激素可以促進軟骨細胞自噬［9］，但是其具體作為以及激活機制尚不明確。

Figure 4.The expression of autophagy-related protein in chondrocytes treated with dexamethasone (DEX).Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖4　軟骨細胞中自噬相關蛋白的表達

自噬不僅與細胞的凋亡有密切關系，而且有減輕骨關節(jié)炎的作用［3］。自噬是細胞清除細胞中錯構蛋白質和失去功能的細胞及大分子的一種必要的細胞維持自身穩(wěn)態(tài)平衡的機制［10］。當細胞受到外界環(huán)境的刺激、處于應激狀態(tài)或者是受到細菌的侵襲的時候，大多數(shù)哺乳動物的細胞質中會產(chǎn)生雙層膜的結構，成為自噬體，自噬體將細胞質中的蛋白質和細胞器包繞起來，溶酶體結合形成自噬溶酶體，從而利用溶酶體中的酶將這些細胞器和蛋白質進行降解，為細胞提供能量和氨基酸，從而保護細胞［11］。在體外，軟骨細胞中的自噬可以抑制細胞的凋亡，并且可以阻止IL-1β引起的細胞外基質的降解［12］，而在體內研究中，不論是腹腔注射雷帕霉素還是關節(jié)腔內局部注射雷帕霉素來促進軟骨細胞中的自噬水平，均可以緩解關節(jié)軟骨退變的進展［2］。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)地塞米松可以顯著地促進軟骨細胞中的自噬水平，我們推測這可能是軟骨細胞對地塞米松應激的一種代償性作用。

激活自噬關鍵的“開關”往往是在mTOR復合物1中的mTOR分子，根據(jù)這一現(xiàn)象，自噬激活的通路也主要分為mTOR依賴性和mTOR非依賴性［13］。抑制mTOR后可以引起細胞中自噬的一系列過程。mTOR下游的信號分子主要為p70S6K和4EBP1。我們發(fā)現(xiàn)糖皮質激素可以顯著抑制軟骨細胞中p70S6K和4EBP1磷酸化水平，說明糖皮質激素激活軟骨細胞中的自噬與其抑制mTOR信號通路有關。相似的是，治療關節(jié)軟骨的葡萄糖氨也是通過抑制mTOR信號通路激活自噬的［14］。這說明軟骨細胞中mTOR信號通路可能是自噬激活的主要信號通路。

糖皮質激素可以引起多種細胞的生長阻滯并抑制細胞的活性，Poulsen等［15］發(fā)現(xiàn)糖皮質激素可以引起肌腱細胞的生長周期阻滯，并誘發(fā)細胞衰老，但是糖皮質激素是否可以引起軟骨細胞的衰老目前仍然未見報道。當細胞生長發(fā)生停滯的時候，其既可以是靜止狀態(tài)也可以是細胞發(fā)生衰老。細胞發(fā)生衰老的時候，細胞擴增能力喪失但是細胞的體積仍然增大，導致衰老的細胞相對正常細胞更加肥大［16］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)地塞米松也可以促進關節(jié)軟骨細胞的衰老，并且隨著時間的延長作用更加明顯。因為軟骨細胞的衰老參與了骨關節(jié)炎的進展，因此長期使用糖皮質激素引起的軟骨細胞的衰老可能是其引起關節(jié)軟骨變性、壞死的作用機制之一。

自噬與細胞的衰老密切相關，但是目前關于兩者之間的關系尚未有統(tǒng)一的意見。Kamalakannan等［17］發(fā)現(xiàn)自噬可以阻止熱休克蛋白引起的單核細胞衰老，但是在肺支氣管上皮細胞中，自噬又介導了氧化應激引起的細胞衰老。而在關節(jié)軟骨細胞中，我們使用3-MA抑制自噬水平發(fā)現(xiàn)細胞的衰老反而進一步加重，這說明糖皮質激素作用下細胞自噬可能是代償性延緩細胞衰老。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)糖皮質激素不僅可以通過抑制mTOR信號通路激活軟骨細胞自噬，而且會誘發(fā)細胞衰老，并且自噬具有延緩細胞衰老作用，這或許為臨床上防治糖皮質激素的并發(fā)癥提供新的思路。

Figure 5.The protein levels of mTOR pathway molecules in the chondrocytes treated with dexamethasone (DEX).Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs 0 mg/L.圖5　糖皮質激素對軟骨細胞mTOR信號通路的作用

Figure 6.β-galactosidase (β-Gal) staining of chondrocytes treated with glucocorticoids and/or 3-MA.Mean±SD.n =3.△△P＜0. 01 vs control;＊＊P＜0. 01 vs DEX.圖6　軟骨細胞的β-半乳糖苷酶染色

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(責任編輯:陳妙玲，余小慧)

Effect of glucocorticoid induced autophagy on senescence in chondrocytes

XUE En-xing1，ZHANG Xue2，CHEN Cheng-wang1，ZHANG Yu1
(1Department of Joint Surgery，2Operating Room，Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China.E-mail: xueenxing@163.com)

R363; R339. 3+8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.002

1000-4718(2015)10-1737-07

2015-04-20

2015-06-05

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