鹽堿脅迫對棉花葉片蛋白質(zhì)組的影響及差異性分析

郭家鑫 葉 揚(yáng) 郭慧娟 閔 偉

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆石河子 832000

棉花是制作紡織品的天然纖維作物, 也是重要的油料作物[1]。棉花的耐鹽閾值雖然很高, 常常作為鹽堿地的先驅(qū)作物[2], 但其生長依然受到鹽堿脅迫的限制。自20世紀(jì)80年代以來, 新疆逐漸成為中國乃至世界上最重要的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)棉花產(chǎn)區(qū)之一[3-4]。但同時新疆土地鹽漬化問題也十分嚴(yán)重, 鹽堿地面積占到耕地總面積的37.72%[5], 給當(dāng)?shù)氐拿藁ㄉa(chǎn)帶來嚴(yán)重不利影響。隨著世界人口的迅速增加, 對纖維和生物能源的需求逐漸增大, 必須將鹽堿和次生鹽堿區(qū)的作物產(chǎn)量提高40%才能滿足這一缺口[6-7]。因此, 開展棉花耐鹽堿機(jī)制研究, 對于提高棉花耐鹽堿性和充分利用豐富的鹽堿地資源提供有力的理論支持, 對大力發(fā)展棉花生產(chǎn)有著重要的意義。

鹽堿脅迫是限制作物生長的重要非生物脅迫之一, 會導(dǎo)致滲透脅迫、離子毒害以及氧化損傷[8-9]。當(dāng)植物處于鹽堿脅迫下時, 它們首先依靠復(fù)雜的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來感知鹽脅迫刺激。植物的信號通路包括激素通路(脫落酸、茉莉酸和乙烯)、IP3信號通路和Ca2+信號通路, 這些信號通路相互關(guān)聯(lián), 將應(yīng)激信號傳遞給基因調(diào)節(jié)器[10]。為了適應(yīng)鹽堿脅迫, 作物需要復(fù)雜的代謝重排和多種代謝途徑之間的相互作用[11-12],例如滲透調(diào)節(jié)、離子穩(wěn)態(tài)以及抗氧化防御系統(tǒng)等耐受機(jī)制[13], 然而這些機(jī)制的運(yùn)作會使作物對能量的需求顯著增加[14-15]。光合作用是將光轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的基本生化過程之一, 對環(huán)境壓力十分敏感[16], 鹽堿脅迫會導(dǎo)致葉綠素生物合成中光合蛋白積累減少[17]。植物葉片的凈光合速率通常隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加而降低[18-19]。植物遭受鹽堿脅迫最明顯的癥狀是誘導(dǎo)葉片黃化和發(fā)育遲緩, 這與金屬離子和磷的沉淀以及組織中離子平衡和pH穩(wěn)態(tài)的失衡有關(guān)[20-21]。理論上講, 增強(qiáng)光合作用和氧化還原產(chǎn)生能量的過程將有助于提高作物的耐鹽性[22]。但是關(guān)于鹽堿脅迫對作物呼吸的影響還存在爭議, 鹽堿脅迫使得呼吸增強(qiáng)或減弱[23], 然而增強(qiáng)呼吸會消耗大量的碳, 就導(dǎo)致參與新生組織的碳減少[24-26]。

雖然人們對棉花的耐鹽堿性進(jìn)行了深入研究,但是鹽堿脅迫對棉花蛋白組的影響及其差異性尚未完全明晰。因此, 本研究以棉花為試驗(yàn)材料, 采用TMT標(biāo)記定量技術(shù), 探究鹽堿脅迫對棉花葉片光合作用、碳水化合物轉(zhuǎn)化酶活性以及蛋白組的影響,闡明鹽堿脅迫下棉花的耐受機(jī)制, 探索棉花幼苗響應(yīng)鹽堿脅迫的分子機(jī)制, 為鹽堿脅迫下棉花的特異蛋白以及相關(guān)基因功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。本研究為耐鹽棉花育種和不同鹽堿地的棉花栽培提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土柱試驗(yàn)于2022年在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站溫室進(jìn)行(44°18′52″N, 86°3′23″E)。供試土壤采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站, 土壤類型為灌耕灰漠土,質(zhì)地為壤土。土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下: 有機(jī)質(zhì)14.5 g kg–1, 全氮1.2 g kg–1, 速效磷11.6 mg kg–1, 速效鉀255 mg kg–1。供試作物為棉花品種為‘魯棉研24號’。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

通過向供試土壤中添加NaCl和Na2CO3+NaHCO3, 將本試驗(yàn)設(shè)置3種鹽堿脅迫類型, 分別為: (1) 對照-非鹽堿土壤(CK); (2) NaCl鹽土(CS);(3) Na2CO3+NaHCO3堿土(AS), 每個處理重復(fù)3次。

在試驗(yàn)開始前, 將供試土壤自然風(fēng)干, 碾碎后過2 mm篩。將NaCl和Na2CO3+NaHCO3(重量比1∶1)溶液加入供試土壤至飽和狀態(tài)(對照加同體積去離子水), 放置1個月使土壤達(dá)到平衡, 至此形成供試鹽漬土。再將處理后土壤風(fēng)干, 碾碎后過篩, 取樣測定含鹽量, 電導(dǎo)率, pH值。具體試驗(yàn)處理及土壤鹽堿類型和鹽堿化程度見表1。

表1 不同處理土壤鹽堿類型和鹽堿化程度Table 1 Type and degree of salinity and alkalinity in soil under different treatments

棉花土柱模擬試驗(yàn)用高60 cm, 直徑35 cm的圓柱容器, 底部密封; 按容重1.25 g cm–3分層裝土50 cm, 每10 cm一層, 每個土柱裝風(fēng)干土60 kg。灌水方式為滴灌, 毛管平鋪在土柱上方, 滴頭固定在土柱頂中心位置, 每個土柱由1個滴頭供水, 灌水量2.5 L pot–1。2020年4月10日播種, 每個土柱播種20株,采用干播濕出, 幼苗生長至2片真葉時, 每個土柱定植6株棉花。為了保證充足的水分供應(yīng), 試驗(yàn)期間采用滴灌的方式定期補(bǔ)充水分, 使土壤含水量保持在田間持水量的60%～80%。試驗(yàn)在播種后60 d結(jié)束。

1.3 樣品采集

在棉花苗期采集樣品, 每個處理各取3株具有代表性的棉花植株, 分成根、莖、葉三部分, 部分葉片樣品用液氮冷凍干燥后用植物粉碎機(jī)(Scientz-48,北京同元聚物科技有限公司)研磨成粉末, 并保存在–80℃冰箱中備用。

1.4 測定方法

1.4.1 生物量的測定 棉花根、莖、葉, 在105℃下殺青30 min, 之后在70℃下烘干至恒重, 稱其干物質(zhì)量。

1.4.2 光合指標(biāo)測定 選取棉花葉片倒三葉, 采用型號為LI-COR 6400植物光合測定儀(美國LI-COR公司生產(chǎn))在下午14:00—14:30, 測定凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal conguctance,Gs)、蒸騰速率(Transpiration rate,Tr)和胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration,Ci)。采用乙醇浸提法[27]測定葉綠素含量。

1.4.3 酶活性的測定 選取棉花葉片倒三葉測定酶酶活性。己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、檸檬酸合酶(CS)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)使用檢測試劑盒測定(上海源桔生物科技中心)。

1.4.4 蛋白提取 取0.4 g棉花葉片倒三葉樣品至2 mL EP管中, 加入800 μL酚提取液混勻, 混勻低溫研磨4 min; 加入800 μL Tris-平衡酚試劑; 反應(yīng)40 min, 每 5 min震搖1次; 5000×g, 4℃離心10 min; 轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中; 加入4倍體積甲醇-乙酸銨,–20℃沉淀過夜; 14,000×g, 4℃離心10 min, 收集沉淀; 加入500 μL甲醇清洗, 14,000×g, 4℃離心10 min,去除上清, 重復(fù)本步驟一次; 加入500 μL丙酮清洗,14,000 ×g, 4℃離心 10 min, 去除上清; 待丙酮揮發(fā)干, 加入500 μL RIPA裂解液復(fù)溶, 打散沉淀, 靜置1 h; 14,000 ×g, 4℃離心 10 min, 取上清。

1.4.5 蛋白質(zhì)檢測 每個樣品取2 μg總肽, 經(jīng)nano-UPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1200進(jìn)行分離后聯(lián)用配備納升離子源的質(zhì)譜儀(Q Exactive HFX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。色譜分離采用100 μID ×15 cm反相色譜柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 μm, Dr. Maisch)進(jìn)行。流動相采用乙腈-水-甲酸體系, 其中流動相A為0.1%甲酸-98%水溶液(乙腈為2%), B相為0.1%甲酸-80%乙腈溶液(水為20%)。色譜柱以100%的A相平衡后, 樣品由自動進(jìn)樣器直接上樣到色譜柱, 再經(jīng)色譜柱梯度分離, 流速300 nL min–1, 梯度時長90 min。流動相B比例: 2%～5%持續(xù)2 min, 5%～22%持續(xù)68 min, 22%～45%持續(xù)16 min, 45%～95%持續(xù)2 min,95%持續(xù)2 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù), 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析, 差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan’s法(P<0.05)?；诨虮倔w(GO)富集分析(http://www.geneontology.org/)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的功能分類。使用京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/)對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了途徑富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫和堿脅迫對棉花生物量的影響

鹽堿脅迫顯著降低棉花生物量(表2)。與CK相比, CS葉、莖、根和總生物量分別顯著降低49.4%、59.7%、37.9%和51.1%; AS葉、莖、根和總生物量分別顯著降低48.2%、60.2%、39.1%和50.9%。

表2 鹽脅迫和堿脅迫對棉花生物量的影響Table 2 Effects of salt stress and alkali stress on cotton biomass

2.2 不同鹽堿脅迫對棉花光合作用的影響

鹽脅迫顯著抑制了棉花光合作用, 而堿脅迫對棉花光合作用無顯著影響(圖1)。與CK相比, CS的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率分別顯著降低57.2%、70.8%、22.8%和70.2%; AS葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度分別增加2.1%、9.7%和3.6%, 蒸騰速率降低3.6%, 但不顯著。鹽脅迫顯著降低棉花葉片葉綠素含量, 但是堿脅迫對棉花葉片葉綠素含量無顯著影響。與CK相比, CS的葉綠素a和葉綠素b含量分別顯著降低54.2%和53.0%; AS葉綠素a和葉綠素b含量無顯著變化。

圖1 鹽脅迫和堿脅迫對棉花光合作用的影響Fig. 1 Effects of salt stress and alkali stress on cotton photosynthesis

2.3 棉花葉片中差異表達(dá)蛋白的篩選與鑒定

在蛋白組數(shù)據(jù)主成分分析中, 前2個主成分分別解釋了26.5%和22.5%的差異(圖2)。同一處理的樣本聚到一起, 樣本的重復(fù)性較好, 且各處理間區(qū)分度較大, 鹽脅迫、堿脅迫與對照存在顯著差異。

圖2 鹽脅迫和堿脅迫下棉花葉片中表達(dá)蛋白的主坐標(biāo)分析Fig. 2 Principal coordinate analysis of protein expression in cotton leaves under salt and alkali stresses

由圖3可知, 在CS中共檢測到4706種蛋白質(zhì),其中206種蛋白質(zhì)上調(diào), 252種蛋白質(zhì)下調(diào), 4248種蛋白質(zhì)無顯著變化; 在AS中共檢測到4706種蛋白質(zhì), 其中133種蛋白質(zhì)上調(diào), 107種蛋白質(zhì)下調(diào), 4466種蛋白質(zhì)無顯著變化。

圖3 棉花葉片中表達(dá)蛋白火山圖Fig. 3 Volcanic graph of proteins expressed in cotton leaves

2.4 差異表達(dá)蛋白的GO注釋富集分析

對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋(圖4)發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下, 在細(xì)胞組分中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外, 在分子功能中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為RNA結(jié)合、裂解酶活性、異構(gòu)酶活性和mRNA結(jié)合, 在生物過程中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為有機(jī)氮化合物生物合成過程、氧乙酸代謝過程、有機(jī)酸代謝過程和羧酸代謝過程(圖4-A)。堿脅迫下, 在細(xì)胞組分中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為胞內(nèi)液、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì), 在分子功能中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)成分和翻譯因子活性以及RNA結(jié)合, 在生物過程中多數(shù)差異表達(dá)蛋白注釋的條目為細(xì)胞生物合成過程、有機(jī)物生物合成過程、有機(jī)氮化合物生物合成過程和細(xì)胞酰胺代謝過程(圖4-B)。

(圖4)

2.5 差異表達(dá)蛋白的KEGG注釋富集分析

通過對差異表達(dá)蛋白顯著富集的代謝通路進(jìn)行分析, 可以了解哪些通路在不同鹽堿脅迫下發(fā)生了顯著改變(圖5)。前10條顯著富集的KEGG通路如圖所示, 鹽脅迫下分別為: 苯并氮雜類生物合成、光合作用、mRNA監(jiān)控途徑、剪接體、核糖體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、萜類骨架生物合成、產(chǎn)熱、氨基酸生物合成和化學(xué)致癌-活性氧物種(圖5-A)。堿脅迫下分別為: 苯并氮雜類生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、核糖體、單萜生物合成、苯丙醇生物合成、硒化合物代謝、萜類骨架生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、泛酸和CoA生物合成和氨基酸的生物合成(圖5-B)。

(圖5)

2.5.1 鹽堿脅迫對碳固定和能量代謝的影響 通過分析KGEE富集通路中的差異表達(dá)蛋白, 我們發(fā)現(xiàn)光合作用中petB、petF、psaD、psaF、psbA、psbB、psbC和psbO共8個蛋白在鹽脅迫下表達(dá)減少, 而PsbS在堿脅迫下表達(dá)增加(圖6)。CS葉片中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、檸檬酸合酶、谷氨酸脫氫酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別顯著增加13.8%、14.4%、4.7%、4.5%、36.6%和12.9%; AS葉片中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、蘋果酸脫氫酶、檸檬酸合酶、谷氨酸脫氫酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性分別顯著增加4.8%、38.8%、15.1%、4.3%、3.4%、15.2%和21.1%。同樣在蛋白組數(shù)據(jù)中也篩選出相關(guān)蛋白, 且其變化趨勢與酶活性基本相同。

圖6 鹽脅迫和堿脅迫對棉花光合作用和碳轉(zhuǎn)化蛋白的影響Fig. 6 Effects of salt stress and alkali stress on photosynthesis and carbon transforming protein in cotton

不同鹽堿脅迫對棉花葉片能量代謝的影響如表3所示, 在CS處理下, A0A7J9KP33、A0A7J9MR64和A0A7J9M5F7等19個差異表達(dá)蛋白在2-氧代羧酸代謝和氧化磷酸化等5條能量代謝途徑中顯著富集, 其中15個差異表達(dá)蛋白上調(diào), 4個差異表達(dá)蛋白下調(diào); 在AS處理下, A0A7J9KP33、A0A7J9M6Q9和A0A7J9L982等9個差異表達(dá)蛋白在2-氧代羧酸代謝和脂肪酸代謝等4條能量代謝途徑顯著富集, 其中6個差異表達(dá)蛋白上調(diào), 3個差異表達(dá)蛋白下調(diào)。

表3 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片能量代謝的影響Table 3 Effects of salt stress and alkali stress on energy metabolism of cotton leaves

2.5.2 鹽堿脅迫對氨基酸代謝的影響 鹽堿脅迫下氨基酸代謝途徑都顯著富集(表4)。鹽脅迫下A0A7J9LV20、A0A7J9KNK6和A0A7J9N2J2等20個差異表達(dá)蛋白在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等6條氨基酸代謝途徑中顯著富集, 其中13個差異表達(dá)蛋白上調(diào), 7個差異表達(dá)蛋白下調(diào); 在AS處理下,A0A7J9KP33、A0A7J9M6Q9和A0A7J9L982等17個DEPs在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等5條氨基酸代謝途徑顯著富集, 其中11個差異表達(dá)蛋白上調(diào),6個差異表達(dá)蛋白下調(diào)。

表4 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片氨基酸代謝的影響Table 4 Effects of salt stress and alkali stress on amino acid metabolism in cotton leaves

2.5.3 鹽堿脅迫對蛋白代謝的影響 鹽脅迫顯著影響棉花的蛋白代謝(圖7)。在翻譯過程中鑒定出A0A7J9LL71、A0A7J9KLS8和A0A7J9L4K0等17種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白, A0A7J9L9A3、A0A7J9MWW3和A0A7J9KLG5等7種上調(diào)的差異表達(dá)蛋白。在復(fù)制和修復(fù)過程中鑒定出A0A7J9MXY4、A0A7J9NCX9和A0A7J9L4L7三種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白。在轉(zhuǎn)錄過程中鑒定出A0A7J9MIT1、A0A7J9M695和A0A7J9MD18等14種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白,A0A7J9MWW3和A0A7J9NCB8兩種上調(diào)的差異表達(dá)蛋白, 在折疊、分類和降解過程中鑒定出A0A7J9MGF0、A0A7J9KSZ2和A0A7J9NCX9等4種下調(diào)的DEPs, A0A7J9MJ25、A0A7J9M3Z4和A0A7J9LI11等9種上調(diào)的差異表達(dá)蛋白。

圖7 鹽脅迫對蛋白代謝的影響Fig. 7 Effect of salt stress on protein metabolism

堿脅迫下, 在轉(zhuǎn)錄過程中鑒定出A0A7J9MB34、A0A7J9MKZ2和A0A7J9LPI7等4種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白, 只鑒定出A0A7J9MB34上調(diào)。在折疊、分類和降解過程中只鑒定出A0A7J9KVF5、A0A7J9LPI7和A0A7J9MAQ0等4種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白。在翻譯過程中鑒定出A0A7J9N9C7、A0A7J9M8X9和A0A7J9LZC0等5種下調(diào)的差異表達(dá)蛋白, A0A7J9KSH5、A0A7J9L5N4和A0A7J9MB54等14種上調(diào)的差異表達(dá)蛋白(圖8)。

2.5.4 鹽堿脅迫對棉花葉片信號傳導(dǎo)的影響 鹽堿脅迫對棉花葉片信號傳導(dǎo)的影響如表5所示。CS處理富集了AMPK信號通路和MAPK信號通路等5條信號傳導(dǎo)途徑, AS只富集了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和mTOR信號通路兩條信號傳導(dǎo)途徑。在CS處理下,AMPK信號通路中A0A7J9L324和A0A7J9MBY1蛋白顯著上調(diào), mTOR信號通路中A0A7J9LJA3和A0A7J9MBY1蛋白顯著上調(diào), 在其他3條信號傳導(dǎo)途徑中都篩選出2個差異表達(dá)蛋白(1個上調(diào), 1個下調(diào))。在AS處理下, 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中篩選出A0A7J9LIK5和A0A7J9MIA1兩個顯著上調(diào)的蛋白,mTOR信號通路中篩選出A0A7J9LJA3和A0A7J9MBY1兩個顯著上調(diào)的蛋白。

表5 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片信號傳導(dǎo)的影響Table 5 Effects of salt stress and alkali stress on signal transduction in cotton leaves

3 討論

鹽堿脅迫嚴(yán)重抑制作物生長發(fā)育, 為了抵御鹽堿脅迫, 植物進(jìn)化出離子穩(wěn)態(tài)、滲透調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)和復(fù)雜代謝過程等機(jī)制[9]。為進(jìn)一步探討棉花適應(yīng)鹽堿脅迫的機(jī)制, 我們從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度進(jìn)行分析。結(jié)果顯示, 鹽脅迫和堿脅迫下分別有458和240種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著改變。但是從亞細(xì)胞定位分析來看, 鹽堿脅迫對棉花的影響差異不顯著,變化最明顯的位置均為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源分類后發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫和堿脅迫下大多數(shù)差異表達(dá)蛋白參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶, 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生, 氨基酸運(yùn)輸和代謝以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制, 而參與能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換的蛋白為鹽脅迫特有, 參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝的蛋白為堿脅迫特有。通過KEGG分析我們發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白主要參與糖類代謝, 蛋白質(zhì)修飾, 氨基酸代謝, TCA循環(huán), 細(xì)胞壁合成, 盡管葉片中有一些相同的通路參與耐鹽和耐堿脅迫, 但它們可能在同一代謝途徑中觸發(fā)不同的蛋白質(zhì), 下面將進(jìn)一步討論這些鹽反應(yīng)蛋白的分子功能和主要代謝途徑。

3.1 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片光合作用的影響

鹽堿脅迫顯著抑制了棉花生長, 生物量存在不同程度的降低。光合作用是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能增加生物量的重要生化過程[16]。鹽脅迫顯著抑制了棉花的光合作用, 而堿脅迫對光合作用無抑制作用甚至還有促進(jìn)光合作用的趨勢, 但大多數(shù)研究認(rèn)為堿脅迫會抑制光合作用[28-29]。葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要場所, 通過對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫下葉綠體和葉綠體膜中發(fā)現(xiàn)77個差異表達(dá)蛋白, 堿脅迫下發(fā)現(xiàn)了50個, 同樣在KEGG分析中發(fā)現(xiàn)光合作用是鹽脅迫下變化最大的代謝通路之一。結(jié)果顯示, 屬于析氧復(fù)合物的psbA、psbB、psbC和psbO在鹽脅迫下表達(dá)顯著減少, 而OEC是PSII蛋白復(fù)合體重要的組成部分[30], 這將嚴(yán)重限制棉花葉片的光捕獲過程, 但有研究顯示鹽脅迫對OEC活性并沒有顯著影響[31]。同時psaD和psaF表達(dá)的減少可能會降低棉花對光的利用效率[32],petB和petF的下調(diào)減少了電子轉(zhuǎn)移, 影響了ATP和NADPH的形成[33]。這無疑是鹽脅迫抑制光合作用的重要原因, 但堿脅迫下與光和作用相關(guān)的蛋白并沒有顯著降低表達(dá), 反而PsbS表達(dá)增加。這說明堿脅迫下棉花生物量降低并不是因?yàn)楣夂袭a(chǎn)物減少,而是因?yàn)楣夂袭a(chǎn)物用于自身組織生產(chǎn)的比例減少,轉(zhuǎn)而行使其他功能。

3.2 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片碳水化合物和能量代謝的影響

植物的生長發(fā)育和應(yīng)對脅迫需要大量能量[34-35]。碳水化合物和能量代謝對于植物耐鹽堿脅迫的反應(yīng)至關(guān)重要, 因?yàn)樗鼈兛梢钥焖僬{(diào)整代謝過程, 為植物提供足夠的能量來應(yīng)對脅迫[36-38]。己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解過程中的限速酶,鹽堿脅迫都顯著增加了上述酶的活性, 這表明糖代謝過程在鹽堿脅迫下都顯著增強(qiáng), 為棉花提供更多的能量和其他代謝途徑的底物。大多數(shù)研究都認(rèn)為糖代謝被是不同非生物脅迫下的共同反應(yīng), 對于植物適應(yīng)環(huán)境脅迫起著至關(guān)重要的作用[39-40]。另一方面, 丙酮酸激酶表達(dá)增加促進(jìn)了草酰乙酸和蘋果酸的轉(zhuǎn)化積累, 同樣有研究顯示堿脅迫顯著促進(jìn)丙酮酸激酶的上調(diào)[41]。TCA循環(huán)為氨基酸生物合成和能量代謝提供了必需的前體, 并且在響應(yīng)非生物應(yīng)激源方面也起著關(guān)鍵作用[42]。研究發(fā)現(xiàn), 鹽堿脅迫促進(jìn)了參與TCA循環(huán)的檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶活性。檸檬酸合酶是TCA循環(huán)中的第一個限速酶, 它活性的提高促進(jìn)了草酰乙酸和乙酰輔酶A縮合產(chǎn)生檸檬酸和用于ATP生產(chǎn)的CoA。蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸和草酰乙酸之間可逆的相互轉(zhuǎn)化, 能夠?qū)⑻O果酸脫氫轉(zhuǎn)化為草酰乙酸或?qū)⒉蒗Ｒ宜徇€原成蘋果酸, 但主要趨向于蘋果酸的合成[43-44], 蘋果酸作為TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物為作物生長發(fā)育提供能量, 對于提高作物耐鹽性具有重要作用。除此之外我們發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下氧化磷酸化、2-氧羧酸代謝和脂肪酸代謝等提供能量的代謝過程顯著富集。在氧化磷酸化代謝中ATP合酶亞單位γ (A0A7J9LUR9)等8個蛋白顯著表達(dá), 促進(jìn)了ATP的形成。在2-氧羧酸代謝中乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶(A0A7J9KP33)等3個蛋白顯著上調(diào), 脂肪酸代謝中β-酮?；?[?；d體蛋白]合酶I(A0A7J9M364)等3個蛋白表達(dá)上調(diào)。呼吸作用的增強(qiáng)會消耗大量的碳, 就導(dǎo)致參與新生組織的碳減少[45]。但是淀粉和蔗糖代謝被抑制, 磷酸蔗糖合酶表達(dá)下降, 這就導(dǎo)致棉花生產(chǎn)蔗糖的能力降低。堿脅迫下棉花的能量代謝雖然發(fā)生富集, 但并沒有表現(xiàn)出強(qiáng)化還是減弱, 只有丁酸代謝和硫代謝表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)。所以鹽脅迫下棉花呼吸消耗有機(jī)物的量大于堿脅迫。之前我們的研究表明, 堿脅迫下,棉花根系中有機(jī)酸明顯積累, 因此光合產(chǎn)物可能運(yùn)往根部合成有機(jī)酸[46]。

3.3 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片氨基酸的生物合成和代謝的影響

氨基酸生物合成和新陳代謝對于植物生長, 發(fā)育和對應(yīng)激源的反應(yīng)至關(guān)重要[47]。結(jié)果顯示, 谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶在鹽堿脅迫下的活性顯著增加, 利用糖酵解和檸檬酸循環(huán)提供的碳骨架酮酸為兩大氨基酸家族提供了充足的谷氨酸和天冬氨酸。一方面氨基酸作為重要的相容溶質(zhì), 增強(qiáng)氨基酸的合成對棉花滲透調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性具有重要作用[48]。此外, 氨基酸可作為抗氧化劑清除植物細(xì)胞中的自由基, 從而促進(jìn)耐鹽植物在鹽脅迫下的生長[21]。氨基酸還在某些代謝途徑中充當(dāng)最終代謝物的中間體, 以及參與多種代謝途徑和其他生理和生化途徑的調(diào)節(jié), 從而影響植物中的許多生理過程[49]。鹽脅迫和堿脅迫都促進(jìn)了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是蛋白質(zhì)合成的重要組成部分, 位于許多生長激素和次級代謝物的上游, 對于抵抗鹽堿脅迫具有重要作用[50]。酪氨酸也是許多具有不同生理作用的特殊代謝物的前體, 例如非蛋白質(zhì)氨基酸、引誘劑和防御化合物[51]。色氨酸是合成大量生物活性分子中必不可少的氨基酸, 在植物生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)的調(diào)控中起著舉足輕重的作用[52]。雖然鹽堿脅迫都促進(jìn)了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成來, 但是其影響的蛋白卻不盡相同。鹽脅迫和堿脅迫都是因?yàn)檩祯姿岷颂腔D(zhuǎn)移酶(A0A7J9LV20)、色氨酸合酶(A0A7J9N2J2)和精氨酸脫水酶的表達(dá)增加, 但是精氨酸脫水酶似乎有點(diǎn)不同, 鹽脅迫是精氨酸脫水酶(A0A7J9N2E0)而堿脅迫是精氨酸脫水酶(A0A7J9MCV6)。除此之外, 鹽脅迫還促進(jìn)了精氨酸的生物合成, 堿脅迫促進(jìn)了纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的合成。精氨酸合成多胺, 參與植物對脅迫的反應(yīng)[53], 異亮氨酸作為滲透調(diào)節(jié)因子在植物逆境抵抗中起著關(guān)鍵作用, 在能量不足的情況下, 異亮氨酸分解代謝會直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)[54]。氨基酸作為生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì),保證氨基酸合成和代謝的正常進(jìn)行是保證作物生存的基礎(chǔ), 因此氨基酸代謝和合成在鹽堿脅迫下都得到了促進(jìn), 也是光和作用產(chǎn)物的重要去處。

3.4 鹽脅迫和堿脅迫對蛋白代謝的影響

遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和修復(fù)是響應(yīng)和適應(yīng)鹽堿脅迫的關(guān)鍵過程[55]。鹽脅迫下, 剪接體和RNA聚合酶中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的14種蛋白質(zhì)全部下調(diào),其中包括富含絲氨酸/精氨酸的核磷酸蛋白(SR蛋白)。SR蛋白在前體mRNA的剪接機(jī)制中發(fā)揮著特有的調(diào)控作用, 而SR蛋白的下調(diào)降低了靶基因和其他剪接因子的剪接效率[56-57]。在真核生物中, 前體mRNA的剪切是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制, 同一個前體mRNA經(jīng)過一系列的加工過程可以形成不同的成熟mRNA, 從而翻譯出很多功能不同的蛋白質(zhì),因此鹽脅迫對SR蛋白表達(dá)的抑制可能會破壞剪接體復(fù)合物的穩(wěn)定性, 在一定程度上準(zhǔn)確識別剪接位點(diǎn)從而特異性表達(dá)對耐鹽性有重要作用的蛋白[58]。在翻譯過程中, 我們觀測到mRNA監(jiān)測途徑、氨酰tRNA生物合成和核質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的14種蛋白質(zhì)全部下調(diào), 在核糖體中檢測到的12種蛋白質(zhì)卻表現(xiàn)出不同的變化趨勢, 但是下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)量占到7種。這意味著棉花的轉(zhuǎn)錄和翻譯在鹽脅迫下受到抑制。在復(fù)制和修復(fù)過程中鑒定出的4種蛋白質(zhì)全部下調(diào)。堿脅迫下, 鑒定出與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的5種蛋白質(zhì)全部位于剪接體中, 而且4種下調(diào)。鑒定出與翻譯相關(guān)的19種蛋白質(zhì)全部位于核糖體中, 14種上調(diào)。這表明堿脅迫抑制了棉花葉片的轉(zhuǎn)錄, 但促進(jìn)了棉花葉片的翻譯。

鹽堿脅迫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯誤表達(dá), 而維持蛋白質(zhì)的功能構(gòu)象和去除有害的蛋白質(zhì)對于細(xì)胞在各種非生物脅迫下的存活也至關(guān)重要, 因此植物會表達(dá)特定蛋白質(zhì)將異常蛋白質(zhì)重新折疊、分類或降解[59]。在本研究中, 鹽脅迫顯著促進(jìn)了棉花葉片中蛋白質(zhì)的折疊、分類和降解, 共鑒定出13種與其相關(guān)的蛋白質(zhì), 其中有9種上調(diào), 分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng), RNA降解途徑和蛋白質(zhì)出口途徑中。堿脅迫下顯著抑制了棉花葉片中蛋白質(zhì)的折疊、分類和降解, 鑒定出4種下調(diào)的與其相關(guān)蛋白質(zhì), 且全富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工過程。

3.5 鹽脅迫和堿脅迫對棉花葉片信號傳導(dǎo)的影響

當(dāng)植物暴露在鹽堿脅迫下時, 不同響應(yīng)信號通路被激活以抵抗損害。鹽脅迫下, AMPK信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、Apelin信號通路和mTOR 信號通路等途徑顯著富集。AMPK 信號通路參與細(xì)胞能量傳感和穩(wěn)態(tài)控制[60], 通路中PRKAB(A0A7J9L324)和CAB39(A0A7J9MBY1)上調(diào)可能使棉花更合理的調(diào)控能量代謝和分配, mTOR信號通路中ATPeV1D(A0A7J9LJA3)和CAB39(A0A7J9MBY1)顯著上調(diào)。AMPK在缺乏營養(yǎng)或能量時被激活并對細(xì)胞生長進(jìn)行制動, 而mTOR在能量或營養(yǎng)充足時被激活, 促進(jìn)合成代謝活動加速細(xì)胞生長, 雖然它們都與營養(yǎng)感知和能量相關(guān), 但作用卻是相互對立的, 這說明鹽脅迫下棉花的能量代謝更加復(fù)雜多變, 但正是它倆之間的微妙平衡確保了棉花能夠生長[61]。堿脅迫下植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和mTOR 信號通路途徑顯著富集, 植物激素信號傳導(dǎo)中AHP(A0A7J9LIK5)調(diào)節(jié)玉米素激活細(xì)胞分裂芽啟動, mTOR通路同樣促進(jìn)合成代謝和加速細(xì)胞生長, 說明堿脅迫提高了棉花葉片細(xì)胞的活性。

4 結(jié)論

鹽脅迫和堿脅迫均抑制棉花生長, 但是鹽堿脅迫對棉花蛋白組的影響不同。鹽脅迫下, 與光合作用相關(guān)的蛋白表達(dá)減少, 光合作用被顯著抑制, 但是糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸合成和代謝、2-氧代羧酸代謝、氧化磷酸化和脂肪酸代謝增強(qiáng), 轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制和修復(fù)被抑制, 蛋白質(zhì)折疊、分類和降解被促進(jìn), AMPK信號通路、mTOR信號通路被激活。堿脅迫對棉花光合作用無顯著影響, 但是糖酵解、TCA循環(huán)、氨基酸合成和代謝、2-氧代羧酸代謝和硫代謝增強(qiáng), 轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)折疊、分類和降解被抑制, 翻譯被促進(jìn), mTOR信號通路和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活。鹽脅迫下棉花消耗更多的光合產(chǎn)物產(chǎn)生能量用于抵抗鹽害, 堿脅迫下更多的光合產(chǎn)物可能運(yùn)往根部合成有機(jī)酸。