控制玉米株高基因PHR1的基因克隆

楊晨曦 周文期,,* 周香艷,* 劉忠祥 周玉乾 劉芥杉 楊彥忠 何海軍 王曉娟 連曉榮 李永生

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅蘭州, 730070; 2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 甘肅蘭州 730070

玉米(ZeamaysL.)是禾本科的一年生草本植物,和小麥、水稻并稱為世界三大谷物。玉米與傳統(tǒng)的糧食作物相比, 具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性, 其營養(yǎng)價值也比較高, 近年來玉米的實(shí)際播種面積在逐步提高, 因此, 不斷提高玉米產(chǎn)量是農(nóng)業(yè)工作者面臨的重要任務(wù)和挑戰(zhàn)[1]。玉米株高(plant height, PH)主要為雄穗軸線頂端向下到地平面的距離; 穗位高(ear height, EH)主要為從玉米底部(露出地面)到果穗第一著生節(jié)的距離。玉米株高和穗位高會影響玉米光合、產(chǎn)量和抗倒伏等生長發(fā)育指標(biāo)。20世紀(jì)60年代, 全球“第一次綠色革命”是在小麥和水稻之中推廣運(yùn)用了矮化品種, 有效的解決了一些植株因倒伏而減產(chǎn)的問題。美國玉米研究與生產(chǎn)的成功經(jīng)驗(yàn)表明, 增加種植密度是提高產(chǎn)量最現(xiàn)實(shí)可行的舉措[2]。但一定的環(huán)境資源在種植密度增加的情況下, 會導(dǎo)致植株易倒伏, 影響植株的品質(zhì), 反而造成產(chǎn)量損失[3], 降低株高對提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。然而, 控制株高和穗位高的遺傳機(jī)理及調(diào)控系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜, 現(xiàn)在仍然有許多問題尚待解決。尤其像小麥、水稻這樣既能有效降低株高和穗位高又沒有明顯減產(chǎn)效應(yīng)的半矮稈基因在玉米遺傳機(jī)理中仍未得到定位。

株高和穗位高與赤霉素、生長素、油菜素內(nèi)酯等一些植物激素息息相關(guān)[4]。目前為止已知的玉米株高基因與植物激素相關(guān)的有BR2、D8、D9、D11、Dt、NA1、NA2等60多個[5-6]。其中D8、D9和Na2對赤霉素不敏感,D8和D9基因編碼DELLA蛋白,為顯性突變;Na2雄穗雌性化, 功能缺失為隱性突變[2]。D11、Dt和Na1對赤霉素較為敏感,D11簇生,花器官發(fā)育異常, 有顯性遺傳因子;Dt莖節(jié)數(shù)量沒有減少, 是節(jié)間長度縮短導(dǎo)致變矮, 為顯性基因;Na1植株極度矮小, 花期延遲, 功能缺失為隱性突變[2,6]。目前被報道的玉米矮稈基因中最有育種利用價值的基因包括BRACHYTIC2, 簡稱為BR2[7]。BR2基因編碼ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 通過生長素極性運(yùn)輸參與玉米株高和穗位高調(diào)控,BR2基因變異可以降低穗部以下的節(jié)間長度, 所以被應(yīng)用于玉米株高矮化育種[8]。本研究發(fā)現(xiàn)一個新玉米矮稈突變材料,將其命名為phr-1, 通過遺傳分析和基因定位, 發(fā)現(xiàn)該突變材料是一個玉米BR2基因的等位突變體,該突變體的發(fā)掘?yàn)榘捰衩子N提供理論基礎(chǔ)和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料玉米自交系KWS39 (來源于德國KWS種業(yè)公司, 簡寫KWS39, 由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供)作為父本, 成熟種子經(jīng)過快中子4.19 Gy的劑量輻照, 方法參考劉忠祥等[9]快中子輻照玉米自交系方法。種植M1代, 嚴(yán)格套袋單株自交, 單穗收獲后, M2代大田種植篩選, 分離突變體, 后代篩選得到株高和穗位降低突變體, 命名為plant heightreducingmutant-1(phr-1)。其中phr-1突變體表現(xiàn)為株高降低, 穗位高下降, 后期結(jié)實(shí)正常, 矮稈表型后代中能穩(wěn)定遺傳。自交系B73,Brachytic2(Br2-1)終止突變體來源: 購自Maize EMS induced Mutant Database (MEMD)突變體庫, 網(wǎng)站http://www.elabcaas.cn/memd[10]。本試驗(yàn)所用到的定位群體為突變體phr-1與B73雜交后的F2群體。

1.2 突變體篩選及遺傳分析

將KWS39和phr-1種植在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張掖試驗(yàn)場基地。田間隨機(jī)選取KWS39和phr-1各15株, 考察株高、穗位高、節(jié)間數(shù)、各節(jié)間長度等重要性狀。使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。種植phr-1和B73, 雜交得到F1。種植F1, 自交獲得F2種子。種植F2群體。成熟期統(tǒng)計(jì)F2分離群體中正常和矮化植株的分離比并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

1.3 初步定位目的基因

phr-1與B73雜交得到F1群體, F1自交構(gòu)建F2遺傳群體。在分離群體搭建過程中, 子代會根據(jù)表型進(jìn)行選擇, 篩選出突變型子代池和野生型子代池,F2群體中分別選取矮稈突變體和正常植株各60株,等大小打孔取樣, 構(gòu)建混合基因池, 測序深度為20X, 利用BSA (bulk segregant analysis)測序方法篩選可能與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。BSA-seq是可以快速定位并且能較為簡單的尋找到目標(biāo)性狀的一種方法[11]。初步確定目標(biāo)基因所在染色體位置, 將候選基因進(jìn)行初步定位。

1.4 精細(xì)定位并克隆候選基因

依據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://www.maizegdb.org/)中初定位區(qū)段的結(jié)果, 利用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)特異性引物, 開發(fā)新標(biāo)記, 對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位。候選基因的測序依據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫候選基因的基因組序列, 利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物,分別PCR擴(kuò)增KWS39和phr-1的基因組DNA和開放閱讀框(ORF)。PCR反應(yīng)體系為50 μL體積, PCR反應(yīng)體系: 94℃預(yù)變性2 min; 98℃變性10 s, 57℃退火20 s, 72℃延伸2 min 30 s, 循環(huán)數(shù)為35次; 72℃延伸7 min, 最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶,電泳切膠回收; 再將回收正確的產(chǎn)物T-A連接構(gòu)建到T載體中, 隨后將連接產(chǎn)物用DH-5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 用對應(yīng)引物進(jìn)行菌液PCR檢測, 陽性菌液送生工生物工程(上海)公司進(jìn)行測序。利用DNAMANVersion 8.0軟件分析測序結(jié)果, 確定變異位點(diǎn)。

1.5 等位雜交驗(yàn)證

為檢測突變體phr-1是否為BR2基因的等位變異, 從玉米EMS誘變突變體庫中訂購了BR2突變體與phr-1雜交, 2個材料分別做正反交, 鑒定F1代表型與突變體phr-1表型一致。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR

采用Eco (Illumina公司)熒光定量PCR儀, 熒光定量試劑盒(Sigma)進(jìn)行實(shí)時熒光定量實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20 μL體積, PCR反應(yīng)體系: 95℃變性10 s;60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環(huán)數(shù)為40次; 每份樣品重復(fù)3次, 用GAPDH作為內(nèi)參基因(表1), 由2–ΔΔCt方法計(jì)算得出[12]。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體phr-1植株表型分析

快中子誘變后代自交獲得M2和M3代植株, 田間種植篩選, M2代表型鑒定中分離到矮稈突變體phr-1,對phr-1的各類農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果表明該突變體株高及穗位高比對照KWS39極顯著降低(P<0.01),株高降低50.0%, 穗位高降低62.2% (圖1-A～C)。進(jìn)一步對整株的節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)及每節(jié)間長度測量, 發(fā)現(xiàn)KWS39和phr-1總節(jié)間數(shù)相同, 共有11節(jié), 穗上穗下節(jié)數(shù)相同, 但是節(jié)間長度極顯著減小, 莖節(jié)長度不能正常延伸, 導(dǎo)致株高和穗位高比對照降低(圖1-D, E)。

圖1 野生型KWS39和突變體phr-1植株表型Fig. 1 Phenotype of KWS39 (CK) and phr-1 mutant plants

(圖1)

對KWS39和phr-1苗期萌芽5 d的幼苗進(jìn)行比較, 二者株高和根系發(fā)育正常, 無顯著變化(圖2-A);田間觀察一直生長到小喇叭口期(七八葉期),phr-1與對照植株均無顯著差異; 大喇叭口期間逐漸表現(xiàn)出差異的矮化表型; 拔節(jié)期直至成熟期, 株高和穗位高差異極顯著。測量成熟期植株phr-1劍葉葉長和葉寬也無明顯差異, 但倒2葉和倒3葉相比CK明顯變窄、變長(圖2-B), 倒3葉葉長差異顯著,P＜0.05 (表3)。由于phr-1莖稈矮化粗壯, 觀察其根系發(fā)育, 次生根比對照更發(fā)達(dá)(圖2-C), 調(diào)查phr-1和KWS39開放授粉的果穗和籽粒性狀, 兩者果穗長、果穗寬、穗行數(shù)、行粒數(shù)、籽粒大小與百粒重?zé)o差異顯著性(圖2-D, E和表2)。說明PHR1基因主效控制玉米株高及穗位高, 對單株產(chǎn)量及百粒重等產(chǎn)量性狀無顯著負(fù)效應(yīng), 對產(chǎn)量沒有顯著影響。

圖2 野生型KWS39和突變體phr-1植株表型Fig. 2 Phenotype of KWS39 (CK) and phr-1 mutant plants

表2 突變體phr-1和野生型KWS39農(nóng)藝性狀分析Tablel 2 Analysis of agronomic traits between KWS39 and phr-1 (mean±SD)

表3 F2分離群體的卡方測驗(yàn)Table 3 Chi-square test of F2 population

2.2 phr-1的突變性狀是由核單基因隱性遺傳變異控制

將phr-1和自交系B73雜交, 收獲F1代植株, F1株高和穗位高與對照相當(dāng)(圖3), 觀察F1自交, 構(gòu)建F2群體, F2后代分離出矮稈突變體, 并對后代野生型植株和突變型植株進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 統(tǒng)計(jì)1000株F2后代植株, 野生型與phr-1植株數(shù)量分別為762株和238株, 卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明野生型與突變體分離比例符合孟德爾單基因隱性遺傳3∶1比例分離, 表明phr-1株高和穗位高降低性狀是由核單基因隱性遺傳變異控制。

圖3 KWS39、phr-1、雜交F1和F2矮稈植株表型Fig. 3 Phenotype of KWS39, phr-1, F1 hybrid plant, and dwarf mutant in F2 plant

2.3 phr-1基因初步定位

為了克隆phr-1突變基因, 利用phr-1與B73雜交構(gòu)建的F2分離群體進(jìn)行初步定位。根據(jù)公共標(biāo)記數(shù)據(jù)庫, 進(jìn)行集團(tuán)分離分析法(bulked segregation analysis, BSA)測序。根據(jù)BSA極端性狀混池測序原理, 提取親本KWS39、phr-1和B73親本各3株, 選擇phr-1×B73 F2子代池株高和穗位最高的植株60株,株高和穗位最低的植株60株, 混池提取其DNA, 建庫進(jìn)行BSA測序。根據(jù)遺傳連鎖交換定律, 子代池的基因型會和表型產(chǎn)生共分離, 反應(yīng)在物理圖譜層面, 與表型連鎖的染色體區(qū)段會和不連鎖的染色體區(qū)間產(chǎn)生穩(wěn)定的SNP-index差異。根據(jù)差異初步確定候選基因區(qū)間位置。差異大小范圍為0～1。若該參數(shù)為0, 代表子代所有測到的Reads都來自野生親本; 若該參數(shù)為1, 代表子代所有Reads都來自突變親本; 該參數(shù)為0.5, 則代表此子代混池中SNP來自2個親本基因組的頻率一致。先將野生型和突變型分離群體2個DNA池篩選多態(tài)引物, 再進(jìn)行全基因組的分析, 初步定位到候選基因區(qū)間, 位于1號染色體Bin1.06位置的約4 Mb區(qū)間內(nèi)(圖4)。

圖4 phr-1候選基因的連鎖定位圖Fig. 4 Linkage map of phr-1 candidate genes

2.4 PHR1基因精細(xì)定位

根據(jù)Maize GBD (http://www.maizegdb.org/)網(wǎng)站的基因信息對定位區(qū)間內(nèi)的序列進(jìn)行分析, 設(shè)計(jì)多態(tài)性引物, 利用F2分離群體, 提取約500個單株進(jìn)行候選基因的精細(xì)定位, 選擇1號染色體的初步定位區(qū)間附近約40對標(biāo)記, 將候選基因縮小到umc1122和umc1583a兩個標(biāo)記之間(表4)。候選基因更靠近umc1122, 目標(biāo)區(qū)間約 600 kb, 查找該區(qū)間內(nèi)已知基因功能, 發(fā)現(xiàn)存在一個已報道控制玉米株高的關(guān)鍵基因BR2, 表型與該突變體表型非常相似。推測目標(biāo)基因可能是GRMZM2G315375。GRMZM2G315375基因全長6653 bp, CDS序列長4140 bp, 編碼氨基酸序列1380個。為了驗(yàn)證該結(jié)果,在野生型KWS39和突變體phr-1中提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄cDNA測序。參考基因組B73序列設(shè)計(jì)特異性引物, 對GRMZM2G315375基因完整編碼區(qū)擴(kuò)增, 分析候選基因GRMZM2G315375與對照的序列堿基差異, 測序檢測發(fā)現(xiàn)phr-1突變體CDS序列第1636位置堿基發(fā)生突變, 插入了一段165 bp的堿基序列,導(dǎo)致氨基酸編碼錯亂, 在第546位氨基酸由P (脯氨酸)變成Q (谷氨酰胺), 第547位氨基酸變?yōu)榻K止子,蛋白翻譯提前終止(圖5)。查閱已報道的BR2基因變異位點(diǎn), 沒有插入突變導(dǎo)致蛋白翻譯的提前終止。說明phr-1突變體的候選基因可能就是BR2基因,phr-1是BR2基因的一個新的等位突變體。

圖5 BR2轉(zhuǎn)錄本在KWS39和phr-1突變體中的序列分析Fig. 5 Sequence analysis of BR2 transcript between KWS39 and phr-1

表4 初步定位標(biāo)記與表型的交換頻率Table 4 Crossing-over value of preliminary localization markers and phenotypes

2.5 等位突變體雜交后代表型鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BR2基因就是控制phr-1株高和穗位高候選基因。在以B73自交系為誘變背景的EMS突變體庫中訂購了基因號為GRMZM2G315375,BR2基因的1個功能缺失突變體, 命名為br2-1(圖6),測序驗(yàn)證br2-1突變體CDS序列第2382位置堿基發(fā)生突變, 由G變成A, 導(dǎo)致氨基酸編碼過程, 第794位氨基酸由W (色氨酸)變成終止子, 蛋白翻譯提前終止。br2-1株高和穗位高比對照B73極顯著降低,拔節(jié)期生長受阻, 不能正常長高, 但抽雄、散粉及吐絲都正常, 能正常結(jié)實(shí), 單株產(chǎn)量及百粒重等產(chǎn)量性狀無顯著變化, 植株表型與phr-1非常相似, 將phr-1與br2-1進(jìn)行正反交, 觀察了br2-1×phr-1F1植株表型, 株高和穗位高與2個突變體phr-1和br2-1的表型一致(圖6), 測序結(jié)果表明,phr-1的基因變化和突變方式與br2-1單個堿基發(fā)生變異位點(diǎn)完全不同,phr-1是第4個外顯子處, 插入了165 bp的堿基序列, 導(dǎo)致氨基酸編碼的提前終止。因此, 根據(jù)對候選基因全基因測序結(jié)果和兩個等位突變體的雜交等位驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 確定phr-1突變體就是br2-1的一個新等位突變體,phr-1突變基因就是BR2基因。

圖6 等位鑒定突變體F1代表型一致Fig. 6 Generic identification of mutant F1 representative type is consistent

2.6 BR2基因表達(dá)分析

因發(fā)現(xiàn)phr-1突變體是br2-1的等位突變, 在B73、KWS39和突變體phr-1幼苗期和抽雄期采樣進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR (Real-time Quantitative polymerase chain reaction, qPCR)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BR2在phr-1中的相對表達(dá)量均明顯低于對照(圖7), 由于基因突變造成轉(zhuǎn)錄水平的降低, 導(dǎo)致目標(biāo)基因蛋白功能減弱或缺失, 蛋白翻譯提前終止, 不能發(fā)揮正常功能, 致使玉米株高和穗位高極顯著降低。

圖7 BR2基因在4個玉米自交系中的相對表達(dá)Fig. 7 Relative expression pattern of BR2 genes in four maize inbred line leaves

2.7 不同物種中BR2蛋白功能保守性及進(jìn)化分析

在Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/annotation_pseudo_apk.shtml)數(shù)據(jù)庫中查找了GRMZM2G315375在其他物種的同源基因(表5), 在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行Blast比對, 搜索到相應(yīng)基因的氨基酸序列, 使用 DNAMAN軟件構(gòu)建了該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)。

(圖8)

表5 BR2在不同物種中的基因編號及功能注釋Table 5 Genetic code and function annotation of BR2 in different species

結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在水稻、擬南芥、玉米和高粱4個物種中的同源性為55.61%, 氨基酸序列重復(fù)較低,但是將玉米和高粱中序列進(jìn)行比對, 同源性高達(dá)93.91%, 具有非常高的相似性(圖8-A), 同源樹和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明AtBR2和OsBR2在進(jìn)化上相對保守(圖8-B, C)。而玉米和高粱中BR2蛋白同源關(guān)系更近。以上結(jié)果說明玉米中ZmBR2與高粱中SbBR2具有更保守的氨基酸序列和進(jìn)化關(guān)系, 發(fā)揮相似的功能。

3 討論

BSA-Seq和BSR-Seq都是快速定位突變體候選基因的重要方法[13]。BSA-Seq是將2組DNA個體分別混合形成2個DNA池, 將這2個DNA池進(jìn)行2組群體在多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率比較, 考察是否有較為明顯的差異, 通過高密度分子標(biāo)記再進(jìn)行SNP的計(jì)算, 篩選出性狀相關(guān)聯(lián)的基因。BSR-Seq是轉(zhuǎn)錄組測序及集群分離分析法[11]。這2種方法定位基因簡單且快速, 并且節(jié)約成本, 得到了廣泛的應(yīng)用[14-15]。Han等通過BSA方法快速將一個玉米多性狀突變體muw定位到2號染色體靠近著絲粒的位置,發(fā)現(xiàn)該位置存在一個大概5 Mb的片段缺失[16]。Cai等發(fā)現(xiàn)了一個控制玉米籽粒發(fā)育的突變體emp10,通過BSA方法定位到1號染色體末端位置且成功克隆目標(biāo)基因[17]。本研究采用野生型和突變體各60株, 運(yùn)用BSA快速將phr-1定位到BR2基因1號染色體末端的4 Mb區(qū)間內(nèi)。

圖位克隆(map-based cloning)又稱定位克隆, 通過選用合適的分子標(biāo)記對功能基因組中相對穩(wěn)定的基因篩選DNA文庫, 根據(jù)遺傳連鎖原理通過染色體逐漸縮小目標(biāo)基因所在區(qū)間, 進(jìn)而克隆候選基因,最后再進(jìn)行功能驗(yàn)證[18]。圖位克隆作為基因克隆的方法之一, 在基因分離和克隆研究中得到了許多具有實(shí)際價值的基因在植物性狀研究中。牛靜等[19]利用圖位克隆方法克隆了水稻株型基因RAD1和RAD2,驗(yàn)證該基因功能與生長素響應(yīng)基因OsFH5等位。周文期等[20-21]利用圖位克隆方法, 克隆到控制水稻葉表皮形態(tài)建成相關(guān)基因LPL2和LPL3, 單基因功能缺陷導(dǎo)致水稻對干旱和鹽脅迫響應(yīng)更敏感。呂洪坤等[22]通過圖位克隆的方法得到玉米d2003矮稈基因,通過序列分析和等位性檢驗(yàn)表明是Vp8的等位基因。張素梅等[23]通過圖位克隆發(fā)現(xiàn)了一個玉米矮稈基因Dt, 并通過 RNA 干擾、過表達(dá)載體載體轉(zhuǎn)化驗(yàn)證了Dt基因具有矮化功能。

玉米株高和穗位高決定著玉米的抗倒伏性和種植密度, 是影響玉米品質(zhì)和產(chǎn)量的重要性狀之一[24]。因此, 研究控制玉米株高和穗位高的分子遺傳機(jī)制具有十分重要的理論和應(yīng)用價值。前人在植物株高和穗位高研究中發(fā)現(xiàn)并克隆多個主效位點(diǎn), 同時也證明了株高和穗位高之間互相關(guān)聯(lián)[2]。本研究通過對野生型KWS39和突變體phr-1的株高、穗位高、節(jié)間長度等多個農(nóng)藝性狀的考察, 發(fā)現(xiàn)突變體phr-1成熟期相比于KWS39的株高穗位高極顯著降低。與前人研究進(jìn)行比較, 在1號染色體Bin1.06區(qū)間內(nèi)存在一個控制玉米株高和穗位高的BR2基因, 通過與突變體br2-1的等位鑒定, 確定phr-1是一個br2-1新等位變異突變體。BR2基因很早就被認(rèn)為是最具有價值的玉米矮化基因。

玉米的株型會直接影響光照與有效輻射, 從而影響光合效率和產(chǎn)量。如果植株高而纖細(xì)則會因?yàn)閷飧偁幃a(chǎn)生倒伏問題[25]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)株高與植株體內(nèi)物質(zhì)積累呈現(xiàn)正相關(guān), 并且矮株具有更高效的將物質(zhì)轉(zhuǎn)化為籽粒的效率, 但是如果植株極端變矮,常常也會伴隨一些不良性狀, 進(jìn)而影響產(chǎn)量[12]。雖然種植密度的增加是提高玉米產(chǎn)量的重要方向, 而高密度種植對玉米株型有著更高的要求條件, 株高和穗位過高容易發(fā)生倒伏, 也不能極度矮化, 降低了產(chǎn)量[2]。通過phr-1與KWS39的田間農(nóng)藝性狀比較,phr-1株高及穗位高相比對照, 極顯著降低, 但不影響產(chǎn)量。phr-1的綜合性狀表明, 矮稈相較于高稈有利于通風(fēng)和光照, 更適宜高密度種植[26]。前人研究也表明, 優(yōu)良的綜合性狀使BR2基因在矮稈育種過程中發(fā)揮了重要作用, 其等位基因在生產(chǎn)上也被廣泛應(yīng)用[27]。因此, 在玉米育種中對矮稈基因的發(fā)掘及功能解析越來越受重視, 利用理化誘變等不同方法, 創(chuàng)造或篩選新矮稈種質(zhì)資源, 克隆株高和穗位高基因?qū)τ衩追N質(zhì)創(chuàng)新及生產(chǎn)應(yīng)用都具有非常重要的意義[28-30]。

br2-1植株矮小, 節(jié)間數(shù)不變、但節(jié)間長度縮小,葉片直立, 綠色保持時間長。前人經(jīng)過對不同突變體的鑒定、QTL定位以及圖位克隆等方法, 多個BR2等位突變體被鑒定和應(yīng)用[28]。從玉米B73得到等位突變體br2-23, 該突變體在BR2基因的第5外顯子上發(fā)生了8 bp的堿基缺失, 編碼氨基酸因?yàn)橐拼a造成了200個氨基酸的缺失, 進(jìn)一步影響了生長素的運(yùn)輸而導(dǎo)致的植株矮化性狀[31]。同樣從B73中分離到矮稈材料NC238和br2進(jìn)行等位雜交, 發(fā)現(xiàn)雜交的F1代沒有野生型的高稈表型, 推測NC238是BR2的一個等位突變體, 通過測序發(fā)現(xiàn)該突變體在BR2第4內(nèi)含子上插入了一個572 bp的微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE), 造成了ZMABCB1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[32]。對玉米subr2進(jìn)行等位基因分析及定位時發(fā)現(xiàn), 在矮稈親本52220中BR2基因的最后一個外顯子上缺失了241 bp, 導(dǎo)致其編碼蛋白中NTP激酶結(jié)構(gòu)域失去功能, 該突變體不僅降低了玉米穗位高和株高, 還可以少量增加莖稈直徑, 具備理想株型的增產(chǎn)潛能[33]。將突變體中BR2基因變異位點(diǎn)導(dǎo)入到正常植株, 可以通過縮短節(jié)間的長度來降低株高, 節(jié)間和葉片數(shù)目不會受其影響, 且導(dǎo)入系材料葉片保持綠色時間更久。另外, 研究表明BR2作為生長素的代謝途徑的關(guān)鍵基因, 不僅可以促進(jìn)玉米的生長, 還會影響葉片的夾角[31]。符合高密度種植的理想株型的一個重要方面是葉片直立, 夾角減小, 所以這些都表明在玉米改良的進(jìn)程中BR2基因都具有相當(dāng)大的應(yīng)用價值[31-32]。在本研究中, 突變體phr-1株高和穗位高極顯著降低, 其他部位發(fā)育正常, 正常結(jié)實(shí), 百粒重?zé)o顯著差異, 推測該基因在玉米株型育種中可能有著重要的應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究旨在定位玉米矮稈基因PHR1, 并初步闡明其生物學(xué)功能。通過等位雜交實(shí)驗(yàn)證明了phr-1突變體就是br2-1的一個新等位突變體, 候選基因就是BR2基因。該研究豐富了BR2的遺傳材料并為株高性狀的遺傳改良提供重要的理論依據(jù)和基因資源。