基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因編輯突變體的分析

上官小霞 楊琴莉 李換麗

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所, 山西運(yùn)城 044000

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物、動(dòng)物和真菌中, 是繼MYB家族之后的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族。bHLH轉(zhuǎn)錄因子不僅普遍參與植物的生長發(fā)育和代謝過程[1-2]、各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)如油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids,BR)[3]、茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]等過程,而且在植物對非生物脅迫, 如干旱、鹽、寒冷、缺鐵等逆境反應(yīng)中也起重要作用[5-8]。

bHLH蛋白保守結(jié)構(gòu)域由50～60個(gè)氨基酸組成,包含2個(gè)功能不同的區(qū)域, 即N末端堿性區(qū)域(basic)和C末端螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)區(qū)域。堿性區(qū)域可以識別和結(jié)合DNA, HLH區(qū)域包含2個(gè)α螺旋, 可以相互作用形成同源或異源二聚體, 從而與靶基因啟動(dòng)子的不同部位結(jié)合進(jìn)而對基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用[9]。部分HLH蛋白因?yàn)槿笔A性區(qū)域, 不能與DNA結(jié)合, 但可以通過與bHLH蛋白結(jié)合形成異源二聚體發(fā)揮功能[9]。四倍體陸地棉中包含432個(gè)bHLH/HLH轉(zhuǎn)錄因子[10], 其中385個(gè)為典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 數(shù)量遠(yuǎn)大于擬南芥(166個(gè))、水稻(167個(gè))、馬鈴薯(124個(gè))、小麥(225個(gè))、玉米(206個(gè))[11]等其他植(作)物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量, 表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在棉花生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在棉花的430多個(gè)bHLH/HLH轉(zhuǎn)錄因子中, 有77個(gè)在棉花纖維發(fā)育過程中相對高表達(dá)[12], 暗示這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能參與了對棉花纖維發(fā)育的調(diào)控。我們先前的研究表明, 棉花中一個(gè)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因GhDEL65在調(diào)控植物表皮細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用[13]。野生型擬南芥中表達(dá)GhDEL65基因可以顯著增加植株表皮毛數(shù)量, 棉花中過量表達(dá)該基因也可以促進(jìn)纖維細(xì)胞的伸長。GhDEL65可能通過與棉花R2R3 MYB以及WD40蛋白相互作用形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合體調(diào)控纖維細(xì)胞的發(fā)育[13]。GhPRE1基因編碼一個(gè)非典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 僅含有HLH區(qū)域, 在棉花快速伸長期高表達(dá)。棉花中過量表達(dá)該基因, 可顯著促進(jìn)纖維細(xì)胞伸長[14]。GhbHLH18基因在纖維發(fā)育過程中起負(fù)調(diào)控作用, 通過激活過氧化物酶介導(dǎo)的木質(zhì)素代謝來負(fù)調(diào)控棉纖維的品質(zhì),GhbHLH18基因敲除的棉花纖維長度和強(qiáng)度皆比對照明顯增加[15]。棉花體內(nèi)的多個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受不同激素的誘導(dǎo), 表明這些bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能通過激素信號途徑對棉花纖維發(fā)育進(jìn)行調(diào)控[12,16]。GhFP1作為一個(gè)正向的棉纖維發(fā)育調(diào)控因子, 通過激活BR的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 參與控制纖維的伸長。過量表達(dá)GhFP1的轉(zhuǎn)基因棉花的纖維長度明顯長于對照, 而抑制GhFP1基因的表達(dá)則阻礙了纖維的伸長[16]。相對于野生型的纖維, 轉(zhuǎn)基因纖維中的BR含量明顯改變。此外, GhFP1蛋白可以直接與GhDWF4和GhCPD基因的啟動(dòng)子結(jié)合, 激活這些BR相關(guān)基因的表達(dá)[16]。

綜合以前的研究報(bào)道可知, bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控棉花纖維細(xì)胞分化及發(fā)育方面發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。但相對于棉花中龐大的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族以及70多個(gè)在纖維發(fā)育過程中相對高表達(dá)的bHLH基因, 目前僅有幾個(gè)與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能被深入解析, 相關(guān)研究報(bào)道還相對較少。本文對棉花GhbHLH71轉(zhuǎn)錄因子的基本信息及生物學(xué)功能進(jìn)行了初步的分析研究, 為進(jìn)一步解析bHLH轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長發(fā)育方面的調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 陸地棉R15以及基因編輯棉花于人工氣候室或試驗(yàn)田種植, 人工氣候室栽培條件為(28±2)℃, 光照16 h。棉花開花后掛牌標(biāo)記當(dāng)日盛開的花朵, 根據(jù)試驗(yàn)需要收集不同發(fā)育期的胚珠和纖維?；ò?、雄蕊、雌蕊取開花當(dāng)天的材料, 葉片為生長2個(gè)月左右的植株嫩葉, 液氮冷凍, –70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體、菌株、試劑 棉花基因編輯載體為GhU6-7 (圖1), 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張獻(xiàn)龍老師實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。靶標(biāo)基因的sgRNA (small guide RNA, sgRNA)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后插入載體GhU6-7啟動(dòng)子后的2個(gè)BsaI位點(diǎn)之間。該載體中包含Cas9基因和NPTII篩選標(biāo)記基因, 可用于轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定。大腸桿菌菌株(Escherichiacoli) DH5α和農(nóng)桿菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 棉花基因編輯載體示意圖Fig. 1 Sketch image of gene editing vector in cotton

PCR檢測試劑盒2×Hieff PCR Master Mix (with Dye)購自上海翊圣生物科技有限公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、Real-time PCR試劑盒TransStrat Green qPCR SuperMix、連接試劑盒pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;多糖多酚RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 棉花轉(zhuǎn)化 棉花基因轉(zhuǎn)化受體品種為R15,以5～7 d無菌苗下胚軸為外植體, 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 具體的轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。

1.2.2 DNA提取及轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定 采用CTAB法提取棉花葉片DNA。轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定以載體上的Cas9基因作為參考。根據(jù)Cas9基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR檢測引物: Cas9-787-F和Cas9-1550-R,序列見表1, 擴(kuò)增片段大小約為750 bp。PCR反應(yīng)體系: 2×Hieff PCR Master Mix 10 μL, 2條引物各1 μL,DNA模板1 μL, 補(bǔ)水至總體積20 μL。檢測樣品包含不同基因編輯株系, 同時(shí)用轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒作為PCR檢測正對照。

1.2.3 編輯位點(diǎn)突變檢測 參照GhbHLH71基因的基因組DNA (gDNA)序列, 在包含2個(gè)gRNA位點(diǎn)的上下游約250～300 bp處設(shè)計(jì)引物CRS25-F和CRS25-R (表1), 以不同T0或T2基因編輯突變體葉片的gDNA為模板, 擴(kuò)增目的片段, PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后, 進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化, 涂板, 具體方法參考試劑盒說明書進(jìn)行。待平板上長出單克隆后, 挑取不同單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定, 每個(gè)轉(zhuǎn)化子挑選5～8個(gè)陽性單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序, 采用DNAstar和chromas軟件或clustalW軟件對序列進(jìn)行分析。

編輯位點(diǎn)突變的純合鑒定采用Hi-TOM基因編輯突變檢測技術(shù)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所研發(fā))進(jìn)行檢測。在第1個(gè)sgRNA上下游分別設(shè)計(jì)引物CRS25-Hi-F和CRS25-Hi-R, 正向引物前段加搭橋序列5'-ggagtgagtacggtgtgc-3', 反向引物前段加搭橋序列5'-gagttggatgctggatgg-3', 引物序列見表1。以不同T2代基因編輯突變體葉片的gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送中國水稻研究所進(jìn)行檢測, 測序數(shù)據(jù)通過Hi-TOM在線分析網(wǎng)站(https://www.hi-tom.net/hi-tom/)進(jìn)行下載及分析。

1.2.4 RNA提取及qRT-PCR檢測 采用多酚多糖RNA提取試劑盒提取不同組織RNA, 具體步驟參考試劑盒說明書。使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系: 1 μL RNA(～1 μg), 1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶, 1 μL oligo Dt, 1 μL gDNA Remover, 10 μL 2×反應(yīng)緩沖液, 補(bǔ)水至20 μL。42℃反應(yīng)30 min, 85℃反應(yīng)15 s, 加水稀釋3～5倍后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用嵌合熒光法進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測。反應(yīng)體系為20 μL, 包含2×TransStrat Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 8 μL、引物bHLH71-RT-F和bHLH71-RT-F (表1)各0.5 μL、Template 1 μL。以棉花Histone3基因(AF024716)作為內(nèi)參, 引物序列見表1, PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)依照不同基因的表達(dá)強(qiáng)弱而定。試驗(yàn)重復(fù)3次, 取各組數(shù)據(jù)的平均值和方差, 采用Rotor-Gene Q Software (Corbett Research, NSW,澳大利亞)進(jìn)行基因表達(dá)量分析, 采用Microsoft Excel 2016繪制圖表。

1.2.5 蛋白序列分析 利用ExPaSy (http://www.expasy.org/)在線工具對GhbHLH71蛋白的分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)進(jìn)行分析。利用NCBI中的在線工具Conserved Domain Search Service (CD Search)對GhbHLH71蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因棉花纖維品質(zhì)分析 大田種植不同突變體T1代和T2株系, 每個(gè)株系種植2～4個(gè)株行, 同時(shí)種植R15材料作為對照。于生長期通過卡那霉素檢測[17]和Cas9基因的PCR檢測分析確定不同突變體的陽性植株。收獲期于每個(gè)突變株系的不同株行挑選單株進(jìn)行纖維長度檢測, 集中采收每個(gè)單株中部吐絮的棉鈴, 每株采收鈴數(shù)大于5個(gè), 每個(gè)棉鈴隨機(jī)挑選3～4粒帶纖維的種子, 手工測量纖維長度, 每株共計(jì)檢測20粒種子, 每個(gè)突變體各統(tǒng)計(jì)10株以上, 利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行差異顯著性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhbHLH71基因的克隆和表達(dá)特征分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GhbHLH71基因的cDNA序列(LOC107946837)設(shè)計(jì)引物, 從陸地棉R15的葉片中分離到該基因的cDNA序列, 測序并經(jīng)序列比對, 所獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的GhbHLH71基因序列100%相同。GhbHLH71基因cDNA全長996 bp, 編碼331個(gè)氨基酸。對GhbHLH71蛋白序列及其理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn), 該蛋白相對分子質(zhì)量為37.59 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為8.38, 氨基酸組成中含量最高的是Leu(L), 占10.0%。該蛋白含有一個(gè)典型的bHLH保守結(jié)構(gòu)域(圖2), 為棉花bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。從陸地棉R15葉片DNA中擴(kuò)增到該基因的gDNA序列并與cDNA序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn), 該基因gDNA序列全長2172 bp, 包含3個(gè)外顯子。在第1個(gè)外顯子內(nèi)設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA序列用于后續(xù)的CRISPR/Cas9基因編輯研究。

圖2 GhbHLH71蛋白氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域Fig. 2 Amino acid sequence and conserved domain of GhbHLH71 protein

本研究檢測了GhbHLH71基因在四倍體陸地棉R15不同組織和棉纖維不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況(圖3),GhbHLH71基因在棉花纖維快速伸長期3～12 DPA表達(dá)量相對較高, 而在同期發(fā)育的胚珠中表達(dá)量則相對較低, 棉花葉片中的表達(dá)量相對高于花器官不同組織。暗示棉花中GhbHLH71基因可能在棉花纖維快速伸長過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖3 GhbHLH71基因在棉花不同組織的表達(dá)特征分析Fig. 3 Relative expression pattern of GhbHLH71 gene in different cotton tissue

2.2 GhbHLH71基因編輯突變體的獲得及陽性鑒定

為進(jìn)一步了解GhbHLH71基因在棉花生長發(fā)育及纖維細(xì)胞分化及伸長過程中的作用, 本研究構(gòu)建了該基因的CRISPS/Cas9基因編輯載體, 以陸地棉R15的無菌苗下胚軸為外植體, 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化, 經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、愈傷增殖培養(yǎng)、胚性愈傷誘導(dǎo)、幼胚分化成苗等過程, 最終獲得11株T0代植株。提取這11個(gè)株系葉片DNA, 用Cas9基因特異引物進(jìn)行T0代植株的陽性檢測(圖4), 1#、2#、4#、7#、8#、11#共6株Cas9基因的PCR檢測結(jié)果為陽性。T0代陽性植株于人工氣候室種植, 后續(xù)的基因突變檢測分析及纖維表型分析皆圍繞這6個(gè)株系進(jìn)行。

圖4 不同T0代再生植株的Cas9基因的PCR檢測Fig. 4 Cas9 PCR amplification assay of different T0 regeneration plants

2.3 GhbHLH71基因編輯株系突變位點(diǎn)檢測分析

本研究對GhbHLH71的基因編輯共設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA位點(diǎn)(圖5-A), 皆位于第1個(gè)外顯子中, 2個(gè)位點(diǎn)之間相距178 bp。在GhbHLH71基因sgRNA1位點(diǎn)上游和sgRNA2位點(diǎn)下游分別設(shè)計(jì)正向和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及突變位點(diǎn)檢測分析, 結(jié)果如圖5所示。6個(gè)陽性T0基因編輯株系中, 1#、7#、8#、11# 4個(gè)株系的2個(gè)sgRNA位點(diǎn)皆發(fā)生突變, 通過插入或缺失不同的堿基數(shù), 造成GhbHLH71蛋白譯碼突變或翻譯提前終止, 從而喪失了生物學(xué)功能。2#和4# 2個(gè)株系測序結(jié)果顯示sgRNA1位置的序列與野生型一致, 未發(fā)生任何突變, 僅sgRNA2位點(diǎn)發(fā)生了不同程度的缺失突變。棉花為異源四倍體植物,本研究中設(shè)計(jì)的sgRNA1位點(diǎn)20個(gè)bp序列中A和D基因組存在1個(gè)堿基的差異(圖5-A中紅色標(biāo)記),載體序列設(shè)為D基因組的序列。對T0轉(zhuǎn)化子進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測發(fā)現(xiàn), 所檢測株系中1#株系sgRNA1位點(diǎn)的突變發(fā)生在A基因組, 7#、8#、11# 3個(gè)株系sgRNA1位點(diǎn)突變發(fā)生在D基因組。對異源四倍體棉花進(jìn)行基因編輯時(shí)sgRNA設(shè)計(jì)的基本原則之一是A組和D組的序列完全一致, 二是CG含量在40%～60%之間[18-19], 這樣有利于提高sgRNA編輯效率。本研究對GhbHLH71進(jìn)行編輯的sgRNA1位點(diǎn)A組和D組存在1個(gè)堿基的差異, 造成sgRNA1的編輯效率明顯低于sgRNA2。對T0代不同突變體的檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)同一株系A(chǔ)、D基因組皆被編輯突變的現(xiàn)象, 需要種植后代進(jìn)行進(jìn)一步的檢測分析。

圖5 不同T0株系GhbHLH71基因CRISPR/Cas9編輯效率檢測Fig. 5 CRISPR/Cas9 editing effect of GhbHLH71 gene in different T0 regeneration lines

2.4 GhbHLH71基因編輯突變體的表型分析

種植不同T0代基因編輯株系的T1代苗, 觀察GhbHLH71基因編輯突變對棉花生長發(fā)育的影響。本研究所用基因編輯載體的篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PTII基因, 所以在T1代棉花營養(yǎng)生長期間, 首先通過田間卡那霉素涂抹試驗(yàn)篩選陽性植株, 然后通過Cas9基因的PCR檢測分析確定不同株系T1代陽性植株并做好標(biāo)記進(jìn)行觀察。在整個(gè)棉花生長發(fā)育期, 不同基因編輯突變體株系棉花的生長情況、開花時(shí)間、結(jié)鈴及吐絮等性狀與對照相比皆無明顯的差異。收獲期單株采收不同植株中部棉鈴進(jìn)行纖維檢測分析,每個(gè)株系檢測10個(gè)以上單株。檢測結(jié)果顯示(圖6-A):6個(gè)基因編輯株系的棉花纖維長度與對照相比皆顯著變短, 其中纖維變短最為明顯的為4#株系, 其纖維長度(22.69 mm)與對照(30.31 mm)相比, 縮短比率達(dá)25%, 表明GhbHLH71基因主要參與對棉花纖維細(xì)胞伸長的調(diào)控。

圖6 不同T1、T2代GhbHLH71基因編輯株系纖維表型分析Fig. 6 Fiber phenotype of different GhbHLH71 T1 and T2 gene editing lines

挑選了T1代株系中纖維較短的4#、8#、11# 3個(gè)株系種植T2代植株進(jìn)行后代的遺傳分析, 結(jié)果見圖6-B, 3個(gè)突變體株系的T2代表型與T1代相似, 與對照相比, 僅纖維細(xì)胞的伸長受到明顯影響, 3個(gè)株系的纖維長度皆明顯短于對照, 表明突變GhbHLH71基因造成的纖維變短的表型可以穩(wěn)定遺傳。其中,4#、8#株系的纖維與對照相比, T1和T2兩代材料的纖維縮短比例皆達(dá)20%以上。

挑選纖維較短的4#和8# 2個(gè)株系的T2代突變材料, 進(jìn)行靶位點(diǎn)不同基因組的編輯情況分析, 檢測編輯位點(diǎn)的突變是否純合。每個(gè)株系選取5個(gè)單株, 用引物CRS25-F和CRS25-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 連入載體后每株挑8個(gè)單克隆進(jìn)行測序。檢測結(jié)果表明, 這2個(gè)株系T2代皆檢測到A和D基因組皆突變的植株。圖7顯示了每個(gè)T2單株各2個(gè)具有代表性的檢測結(jié)果, 其中8-2、8-4、8-5、4-3在挑選的8個(gè)單克隆中檢測到A、D基因組皆發(fā)生突變, 說明這4株突變體材料已經(jīng)純合。其余單株僅檢測到D基因組突變, 其原因一是可能突變僅發(fā)生在D基因組,二是因?yàn)镻CR擴(kuò)增是以四倍體棉花gDNA為模板,而PCR擴(kuò)增所用引物為A/D基因組通用, 挑選的單克隆比較隨機(jī), 沒挑選到A基因組片段。

為了進(jìn)一步分析T2代突變材料的基因編輯情況,本研究采用Hi-TOM檢測技術(shù)對4#和8#株系的不同植株進(jìn)行了高通量測序, 2個(gè)株系各檢測15株, 每株檢測5000 reads, 相當(dāng)于5000個(gè)單克隆。2個(gè)株系所檢測的30個(gè)單株編輯位點(diǎn)皆發(fā)生了突變, 4#和8#株系分別獲得10株和12株A、D基因組皆突變的植株。表2顯示了部分植株的Hi-TOM檢測結(jié)果, 其中已經(jīng)過濾掉突變比例小于5%的樣品。Hi-TOM檢測結(jié)果表明GhbHLH71基因編輯突變體T2代已經(jīng)獲得純合植株。

表2 T2代株系的Hi-TOM編輯突變檢測Table 2 Hi-TOM editing mutations detection in T2 generation lines

3 討論

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的棉花基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和完善, 為棉花基因功能研究提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)[19-22]。越來越多的棉花功能基因通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被鑒定或解析[21-24]。本文通過基因編輯技術(shù)對陸地棉GhbHLH71的基因功能進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn), 該基因主要在棉花纖維細(xì)胞伸長方面起調(diào)控作用,GhbHLH71基因編輯株系棉花纖維長度與對照相比明顯變短。但本文對于該基因調(diào)控棉花纖維伸長的分子機(jī)制缺乏進(jìn)一步的分析研究。該基因參與的激素信號途徑、上游調(diào)控因子、下游靶基因的選擇、相互作用蛋白等都是我們需要深入研究的方向, 這些研究將有助于我們較全面地了解該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄因子在棉花纖維細(xì)胞的分化與伸長過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25-26], 其中的一些關(guān)鍵的調(diào)控因子如GhHOX3、GhMYB25-Like等對纖維細(xì)胞分化與伸長起決定性的調(diào)控作用。棉花中降低GhHOX3基因的表達(dá), 棉花纖維細(xì)胞伸長完全受到抑制[27], 降低GhMYB25-Like基因的表達(dá), 則完全抑制纖維細(xì)胞的分化與起始[28]。突變GhbHLH71基因雖然對棉花纖維的伸長造成一定的影響, 但相對于GhHOX3、GhMYB25-Like等關(guān)鍵因子來說,GhbHLH71基因突變對纖維發(fā)育的影響效果相對較小。棉花中有77個(gè)bHLH家族基因在棉花纖維發(fā)育過程的中表達(dá)量相對較高[12], 這些bHLH/HLH轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在功能冗余。因此利用基因編輯技術(shù)突變棉花GhbHLH71基因, 雖然棉花纖維發(fā)育受到了一定的影響, 但其分化與伸長并為完全被抑制。

棉花中bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目眾多, 功能多樣。除調(diào)控棉花纖維發(fā)育的功能外, bHLH轉(zhuǎn)錄因子也被報(bào)道參與棉花生長發(fā)育、次生代謝、逆境響應(yīng)等過程[29-33]。GoPGF基因編碼一個(gè)典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子, 在調(diào)控棉花表皮細(xì)胞腺體發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用, 該因子突變會(huì)導(dǎo)致棉花表皮腺體發(fā)育完全被抑制[29]。棉花中GhbHLH1基因的表達(dá)主要富集在7 DPA纖維中, 并且其表達(dá)水平受脫落酸(abscisic acid, ABA)和干旱處理的誘導(dǎo)[30], 另一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子GhbHLH130的表達(dá)也受干旱、高鹽、低溫以及外源ABA的顯著誘導(dǎo)[31], 表明這2個(gè)基因可能作為調(diào)控基因參與棉花對逆境的響應(yīng)[30-31]。GhBEE1-Like基因編碼一個(gè)核定位的bHLH蛋白,其表達(dá)可以被BR誘導(dǎo), 在調(diào)控棉花花藥開裂方面發(fā)揮重要作用[32]。棉花中過表達(dá)GhbHLH171基因,可以激活JA合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá), 從而提高棉花對大麗輪枝菌V.dahliae的耐受性[32]。隨著植物生物技術(shù)以及基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展, 棉花中越來越多的bHLH/HLH轉(zhuǎn)錄因子的功能將會(huì)被解析, bHLH/HLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控棉花生長發(fā)育特別是棉花纖維細(xì)胞的生長發(fā)育以及抗逆調(diào)控機(jī)制將會(huì)越來越清晰, 這對棉花高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆新種質(zhì)材料的創(chuàng)制以及棉花分子設(shè)計(jì)育種具有重要的理論及實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 創(chuàng)制了棉花GhbHLH71基因編輯突變體, 并對其表型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明GhbHLH71基因主要在棉花纖維細(xì)胞伸長過程中起調(diào)控作用, 該基因的突變會(huì)導(dǎo)致棉花纖維長度與對照相比明顯變短。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明GhbHLH71的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及全面解析棉花纖維發(fā)育的分子機(jī)理提供了理論參考。