黃芪甲苷與三七總皂苷配伍冰片改善大鼠腦缺血再灌注后腎臟損傷的研究

歐典 李艷玲 劉曉丹 黃小平 張偉 王頌 周峰 李佳婷 鄧常清 丁煌

〔摘要〕 目的 觀察黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ）與三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）配伍冰片改善大鼠腦缺血再灌注后腎臟損傷的作用。方法 采用大腦中動脈線栓法建立局灶性腦缺血模型，實驗隨機分為假手術組、模型組、單用冰片組、AST Ⅳ配伍PNS（AP）組、AST Ⅳ與PNS配伍冰片（APB）組，缺血2 h后再灌注48 h，神經功能評分、HE染色和尼氏染色檢測腦組織功能和神經細胞損傷，HE染色檢測腎臟損傷，通過腎臟質量指數(shù)和血肌酐以及血清中尿素氮含量評價腎臟功能，ELISA法檢測血清IL-1β和IL-10含量，免疫組織化學檢測腎組織NF-κB蛋白的表達，Western blot檢測腎組織TLR4和MyD88蛋白的表達。結果 與假手術組比較，模型組神經功能評分和神經細胞損傷率顯著升高（P<0.01），尼氏體數(shù)量顯著減少（P<0.01），同時腎小管水腫、核固縮，腎臟質量指數(shù)降低（P<0.01），血清肌酐和尿素氮含量升高（P<0.01），提示腦缺血再灌注可誘發(fā)腎臟繼發(fā)性損傷。與模型組比較，各藥物組均能不同程度地降低神經功能評分（P<0.01），減少神經細胞損傷率（P<0.01或P<0.05），增加尼氏體數(shù)量（P<0.01），改善腎臟結構損傷，增加腎臟質量指數(shù)（P<0.01或P<0.05），降低血清肌酐和尿素氮含量（P<0.01或P<0.05），以AST Ⅳ與PNS配伍冰片效果最佳。與假手術組比較，模型組血清IL-1β含量升高（P<0.01），腎組織NF-κB、TLR4和MyD88蛋白表達增高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組血清IL-1β含量降低（P<0.01或P<0.05），血清IL-10含量升高（P<0.01或P<0.05），腎臟組織中NF-κB、TLR4和MyD88的蛋白表達降低（P<0.01或P<0.05）。結論 腦缺血后可誘發(fā)腎臟繼發(fā)性損傷，AST Ⅳ和PNS配伍冰片除可減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷外，還可減輕腦缺血后繼發(fā)性腎臟損傷，其作用與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路、抑制腎臟炎癥有關。

〔關鍵詞〕 黃芪甲苷；三七總皂苷；冰片；腦缺血再灌注損傷；腎臟損傷；炎癥反應；NF-κB

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.001

Astragaloside IV and Panax notoginseng saponins combined with Bingpian （Borneolum Syntheticum） in improving renal injury after cerebral ischemia-reperfusion in rats

OU Dian1，2， LI Yanling1，2， LIU Xiaodan1，2， HUANG Xiaoping1，2， ZHANG Wei1，2， WANG Song1，2，

ZHOU Feng1，2， LI Jiating1，2， DENG Changqing1，2*， DING Huang1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of astragaloside Ⅳ （AST Ⅳ） and Panax notoginseng saponins （PNS） combined with Bingpian （Borneolum Syntheticum） in improving renal injury after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods A focal cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion method. The rats were randomized into sham-operated group， model group， Bingpian （Borneolum Syntheticum） group， AST Ⅳ combined with PNS （AP） group， and AST Ⅳ and PNS combined with Bingpian （Borneolum Syntheticum） （APB） group. After two hours of ischemia， reperfusion was performed for 48 hours. Neurological function was graded. HE staining and Nissl staining were used to determine brain tissue function and nerve cell damage. In addition， HE staining was used to measure renal injury. Renal function was evaluated by renal mass index and the content of creatinine and urea nitrogen in serum. Moreover， the content of IL-1β and IL-10 was checked by ELISA， NF-κB protein expression in the renal tissue was examined by immunohistochemistry method， and TLR4 and MyD88 protein expressions in the renal tissue were determined by Western blot. Results Compared with sham-operated group， the neurological function score and nerve cell injury rate in model group significantly increased （P<0.01）， and the number of Nissl bodies significantly decreased （P<0.01）. Additionally， renal tubular edema and nuclear pyknosis were observed， and renal mass index decreased （P<0.01）. The content of serum creatinine and urea nitrogen increased （P<0.01）. It is suggested that cerebral ischemia-reperfusion can induce secondary renal injury. Compared with model group， all drug groups showed reduced neurological function scores （P<0.01）， decreased nerve cell injury rate （P<0.01 or P<0.05）， increased number of Nissl bodies （P<0.01）， improved renal structural damage， elevated renal mass index （P<0.01 or P<0.05）， and lower content of serum creatinine and urea nitrogen （P<0.01 or P<0.05） to varying degrees. APB group had the best effects in these above changes. Compared with sham-operated group， the content of IL-1β in serum and the protein expression levels of NF-κB， TLR4， and MyD88 in the renal tissue of model group increased （P<0.01）. Compared with model group， all drug groups showed a decrease in the serum IL-1β content （P<0.01 or P<0.05） and protein expression levels of NF-κB， TLR4， and MyD88 in the renal tissue （P<0.01 or P<0.05）， and an increase in the serum IL-10 content （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion Cerebral ischemia-reperfusion can induce secondary renal injury， and APB can not only alleviate brain tissue damage after cerebral ischemia-reperfusion， but also reduce secondary renal injury after it. Its effects are related to the regulation of the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathways and the inhibition of renal inflammation.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 astragaloside Ⅳ; Panax notoginseng saponins; Bingpian （Borneolum Syntheticum）; cerebral ischemia-reperfusion injury; renal injury; inflammatory response; NF-κB

腦缺血后，神經細胞受損，神經功能障礙，同時可并發(fā)多器官功能障礙，其中繼發(fā)性腎臟功能障礙是常見的并發(fā)癥，具有較高的發(fā)病率和致死率[1]。中醫(yī)學認為，“腎者，精之處也”，又謂“腎藏精，精生髓通于腦”，故《管子·水池》以“腎生腦”概之[2]。目前，臨床上主要針對腦缺血原發(fā)部位的損傷進行治療，如溶栓治療、修復神經損傷和促神經再生等，而對缺血再灌注過程中其他并發(fā)器官的損傷和功能障礙沒有進行保護，影響疾病的治療效果和預后效果[3]。

腦缺血再灌注損傷后，缺血缺氧刺激引起交感神經興奮，腎臟血管收縮加劇，出現(xiàn)腎臟缺血缺氧，結構受損，同時大量的白細胞活化，引起炎性介質的大量釋放，產生炎癥因子風暴，進一步加重腎損傷[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ）與三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）配伍冰片可有效改善腦缺血再灌注后的炎性損傷，減輕腦水腫，促進神經細胞的增殖，保護血腦屏障（blood brain barrier，BBB）和神經血管單元結構及功能的完整性[5]。因此，本研究從改善腎臟損傷、減輕腎臟炎癥反應等角度探討AST Ⅳ與PNS配伍冰片對腦缺血再灌注后腎臟的保護作用及可能的作用機制。

1 材料

1.1? 主要藥物

戊巴比妥鈉（批號：86-01-22）購自上海化學試劑采購供應站分裝廠；冰片（左旋龍腦，主要成分為 1，7-三甲基-二環(huán)庚-2-醇，含量86%，批號：20170815）購自湖北俊輝有限公司；AST Ⅳ（質量分數(shù)為98%，批號：AF9102805）、PNS（質量分數(shù)為90%，批號：AF20033002）購自成都埃法生物科技有限公司；依達拉奉注射液（3-甲基-1-苯基-2吡唑啉-5酮，批號：1910142）購自福建天泉藥業(yè)股份有限公司。

1.2? 主要試劑

MCAO栓線（北京西濃科技有限公司，批號2634-A4）；RIPA裂解液（中國cwBio，批號：01408/30450）；BCA蛋白定量試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，批號：A00445）；ECL化學發(fā)光液（美國genview，批號：GE2301）；兔抗大鼠TLR4單克隆抗體（批號：BS91353）、兔抗大鼠MyD88單克隆抗體（批號：BS3521）、兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體（批號：BS9879M）購自美國Bioworld公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（美國Thermo Fisher Scientific，批號：20536-1-AP）；兔抗大鼠二抗（批號：K195909F）和DAB顯色液（批號：2120D0326）購自中杉金橋；HRP標記山羊抗兔IgG二抗（批號：E-AB-1003）、IL-1β（批號：E-EL-R0012c）、IL-10（批號：E-EL-R0016c）酶聯(lián)免疫吸附測定法（Elisa）試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；肌酐（批號：E-BC-K188-M）和尿素氮（批號：E-BC-K183-M）購自中國Elabscience公司。

1.3? 動物

SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量220～250 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供（動物合格證號：430727211101681162）。由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)[場地許可證號：SYXK（湘）2019-0009]。實驗前適應性喂養(yǎng)7 d，造模前禁食12 h，自由飲水。動物的使用符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定，批準號LLBH-202004290001。

2 方法

2.1? 動物模型的制備

大鼠腹腔注射0.25%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g），待大鼠麻醉后，參照Longa改良法[6]，依次分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，栓線自右側頸總動脈向右側頸內動脈方向插入栓線至推至阻力時停止，固定栓線，術后消毒縫合，栓線阻斷2 h后，拔出部分栓線進行再灌注。對照組大鼠僅分離血管，不進行其余操作。

2.2? 動物分組與給藥

根據(jù)前期實驗結果[5]，動物隨機分為：假手術組、模型組、單用冰片組（15 mg·kg-1）、AST Ⅳ（20 mg·kg-1）+PNS（50 mg·kg-1）（AP）組、AST Ⅳ（20 mg·kg-1）+PNS（50 mg·kg-1）+冰片（15 mg·kg-1）（APB）組及依達拉奉（4 mg·kg-1）組，每組10只大鼠。各藥物組于缺血2 h再灌注0 h開始灌胃，每天1次。依達拉奉組給予依達拉奉腹腔注射和0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL·kg-1灌胃，每天1次。假手術組及模型組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉。再灌注后48 h檢測各指標。

2.3? 檢測指標

2.3.1? 神經功能缺損評分? 參照Longa[6]神經功能評分法進行評分，評分等級分為0分到4分。大鼠造模清醒后每天評分，舍棄掉評分為4分的大鼠。選取大鼠缺血2 h再灌注48 h的評分結果進行分析，評分越低，損傷越輕，評分越高，損傷越重。

2.3.2? HE染色觀察大鼠大腦右側海馬區(qū)病理形態(tài)? 再灌注48 h后，腹腔注射0.25%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，生理鹽水心臟灌注后斷頭取腦，將腦組織或腎組織置于4%多聚甲醛固定后切片，依次經二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，蘇木素伊紅染色后再行乙醇梯度脫水，封片后于顯微鏡下觀察并拍照，觀察腎小管病理變化，采用Image J 軟件分析右側腦組織海馬區(qū)的病理損傷情況，計算相同單位視野下的損傷細胞數(shù)和總細胞數(shù)。細胞損傷率＝損傷細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

2.3.3? 尼氏染色觀察大腦海馬體神經元分布? 再灌注48 h后，同前取腦組織固定后切片，常規(guī)脫水后，1%甲苯胺藍染色40 min，封片后于顯微鏡下觀察并拍照。尼氏小體分布于神經細胞內并被堿性染料染成深藍色。用Image J圖像分析軟件計算大鼠海馬體神經元尼氏小體染色的個數(shù)。

2.3.4? 腎臟質量指數(shù)及血清中肌酐、尿素氮檢測? 再灌注48 h后處死，剝離左側腎臟稱取質量，以大鼠左側腎臟質量與處死前大鼠體重之比作為大鼠的腎臟質量指數(shù)。同時腹主動脈采血。1000 g離心15 min后分離血清，置于-80 ℃冰箱保存，按照Scr和尿素氮試劑盒說明書進行含量測定。

2.3.5? 酶聯(lián)免疫吸附反應檢測血清中IL-1β和IL-10含量? 收集大鼠血清后，用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-1β和IL-10含量，操作按說明書要求。

2.3.6? 免疫組化檢測腎臟組織NF-κB的表達? 再灌注48 h后，取腎臟組織石蠟切片，經脫蠟及抗原修復后，加入NF-κB一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，再加入二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，NF-κB陽性表達為棕黃色，用Image J圖像分析軟件計算相同面積下NF-κB表達的累積光密度值（integral optical density，IOD）作為各組NF-κB的相對表達量，并根據(jù)各實驗組IOD與假手術組IOD的比值進行統(tǒng)計分析。

2.3.7? Westren blot檢測腎臟組織中TLR4、MyD88蛋白的表達? 再灌注48 h后，取腎臟組織加裂解液研磨，離心后取上清，用BCA法測定蛋白濃度，變性后電泳再濕轉，洗膜后封閉，滴加TLR4（1∶500）、MyD88（1∶500）、β-actin（1∶500）一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次后，滴加HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL法顯色。用Image J分析條帶IOD，以TLR4、MyD88條帶IOD值與β-actin條帶IOD值的比值作為TLR4、MyD88蛋白的相對表達量。

2.4? 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用“ｘ±s”表示。各組計量資料比較采用單因素方差分析，檢驗正態(tài)性和方差齊性，滿足正態(tài)性后，方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett＇s T3檢驗。

3 結果

3.1? 藥物對神經功能損傷的影響

與假手術組比較，模型組神經功能評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組均能不同程度的降低神經功能評分（P<0.01）；與APB組比較，單用冰片組和AP組神經功能評分增高（P＜0.01或P<0.05）。詳見圖1。

3.2? 藥物對海馬區(qū)神經細胞損傷的影響

鏡下可見，假手術組海馬區(qū)神經細胞排列規(guī)則，胞核飽滿，核仁清晰可見，染色質分布均勻，可見極少數(shù)細胞核固縮、神經細胞壞死，損傷率較低。與假手術組比較，模型組海馬區(qū)神經細胞核固縮或嗜酸樣變性，核仁不清晰，損傷率顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組均能不同程度的降低海馬區(qū)神經細胞損傷（P＜0.05或P＜0.01），且APB組神經細胞損傷率顯著低于冰片組和AP組（P＜0.05）。詳見圖2。

3.3? 藥物對海馬區(qū)神經細胞形態(tài)的影響

尼氏小體分布于神經細胞胞質或樹突內，由許多平行排列的粗面內質網和散在于其間的游離核糖體所組成，是神經元內合成蛋白質的主要部位，被甲苯胺藍等堿性染料染成深藍色。假手術組可見細胞染色均勻，排列整齊緊密。與假手術組比較，模型組海馬區(qū)神經細胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，細胞著色變淺，排列稀疏散亂，尼氏小體數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組均能不同程度的增加尼氏體數(shù)量（P＜0.01），且APB組的尼氏小體數(shù)量顯著高于單用冰片組和AP組（P＜0.01或P<0.05）。詳見圖3。

3.4? 藥物對腎臟結構損傷的影響

模型組鏡下可見管壁上皮呈扁平狀，組織局部炎癥浸潤，管腔內可見蛋白樣物沉積，以及大量嗜酸性蛋白樣物質積聚，形狀如“甲狀腺濾泡樣”結構，腎小管結構破壞，小管上皮細胞水腫，擴張的腎小管旁間質纖維組織少量增生。腎小動脈和腎小靜脈擴張淤血。各藥物組可不同程度的改善腎臟損傷，減輕腎小管水腫，減少炎癥細胞侵潤。詳見圖4。

3.5? 藥物對腎臟質量指數(shù)、血清肌酐和血清中尿素氮的影響

與假手術組比較，模型組腎臟質量指數(shù)顯著降低（P＜0.01）、肌酐含量顯著升高（P＜0.01）、尿素氮含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組均能不同程度增加腎臟質量指數(shù)（P<0.01或P<0.05），降低血清肌酐含量（P<0.01），降低血清尿素氮含量（P<0.01或P<0.05），且APB增加腎臟質量指數(shù)的作用顯著強于單用冰片和AP組（P＜0.05），APB降低肌酐的作用顯著強于單用冰片和AP組（P＜0.05），APB降低尿素氮的作用顯著強于單用冰片和AP組（P＜0.05）。詳見圖5。

3.6? 藥物對血清炎癥因子IL-1β和IL-10的影響

與假手術組比較，模型組血清中IL-1β含量升高（P＜0.01），IL-10含量升高（P>0.05）。與模型組比較，AP組和APB組能不同程度降低血清IL-1β含量（P＜0.01或P＜0.05）、升高血清IL-10含量（P＜0.01或P＜0.05）；且APB組降低血清IL-1β含量的作用強于單用冰片組和AP組（P＜0.05）。詳見圖6。

3.7? 藥物對腎臟NF-κB表達的影響

與假手術組比較，模型組中腎臟NF-κB表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，AP組和APB組能不同程度降低腎臟組織中NF-κB的表達（P＜0.01或P＜0.05）。且APB降低腎臟組織中NF-κB蛋白表達的作用同AP相當（P>0.05）。詳見圖7。

3.8? 藥物對腎臟組織中TLR4、MyD88蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組中腎臟組織TLR4、MyD88蛋白含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，AP和APB組能不同程度降低腎臟TLR4蛋白的表達（P＜0.01或P＜0.05）。詳見圖8。

4 討論

腦缺血再灌注后繼發(fā)性腎臟損傷是臨床常見的并發(fā)癥[7-9]，可影響腦缺血后的住院時間和死亡率，由于腎臟和大腦是高灌注器官，存在血流動力學聯(lián)系，且都處于較大的血流灌注中，在機體血壓變化過程中通過自身調節(jié)維持恒定的灌注量。腦缺血后，毒性物質如氧自由基、興奮性氨基酸和細胞內鈣超載、白細胞激活后過度聚集等多種因素的堆積，并在疾病進展中，級聯(lián)反應不斷擴大損傷、毒性物質不斷輸送到腎臟等部位、神經體液調節(jié)以及炎癥介質釋放等造成繼發(fā)性腎損傷[10-11]。缺血再灌注后體內誘發(fā)的炎癥反應，可引起炎癥細胞的激活和促炎細胞因子的過度分泌，引發(fā)腎臟炎癥級聯(lián)反應，加重腎臟損傷和腦損傷，血清中肌酐和尿素氮含量變化是腎臟功能變化的重要觀察指標[12-13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，AST Ⅳ與PNS配伍冰片能不同程度降低腦缺血再灌注后BBB通透性，減輕腦水腫，對抗腦組織損傷，其機制可能與協(xié)同抑制腦缺血后緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin等蛋白表達下調，從而保護BBB有關。本研究從神經功能缺損評分、腦組織海馬區(qū)神經細胞損傷率和腦組織海馬區(qū)尼氏體染色等方面探討AST Ⅳ與PNS配伍冰片抗腦缺血再灌注損傷的作用，從腎臟形態(tài)改變、腎臟質量指數(shù)、血肌酐和尿素氮含量等方面綜合評價AST Ⅳ與PNS配伍冰片改善腦缺血再灌注后腎臟損傷的情況。結果提示腦缺血后可誘發(fā)腎臟繼發(fā)性損傷，單用冰片組、AP組、APB組除可減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷外，還可減輕腦缺血后繼發(fā)性腎臟損傷，且APB效果最佳。

炎癥侵潤是腎臟受損的啟動因素[17]。腦缺血再灌注損傷后，小膠質細胞激活，促炎因子IL-1β等釋放增多，抗炎因子IL-10等早期增加不明顯，產生的炎癥介質可通過血液循環(huán)，擴散至腎臟乃至全身，引起腎損傷[18]。NF-κB是參與炎癥反應、引起腎損傷和腎功能下降的重要通路，NF-κB入核增加，進入細胞核內的NF-κB與DNA結合，啟動相關基因轉錄，釋放促炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、細胞間黏附分子-1以及活性氧自由基等，啟動免疫應答反應，加重腎損傷[19]。本研究從大鼠血清中IL-1β和IL-10蛋白表達、腎臟組織中NF-κB蛋白的表達評價腦缺血再灌注后腎臟的炎癥反應，結果提示炎癥反應是引起腎臟繼發(fā)性損傷的主要原因，APB可通過抑制炎癥反應發(fā)揮腎臟保護作用。

腦缺血再灌注后，腎臟損傷引起TLR4表達增高，通過募集下游髓樣分化蛋白MyD88，與MyD88結合后形成TLR-MyD88復合體，激活相關信號激酶，活化下游不同的信號通路，釋放出潛伏的NF-κB二聚體，啟動炎癥反應[20]。本研究結果提示APB可抑制腎臟炎癥反應，減輕腎損傷，其機制可能是通過TLR4、MyD88和NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，腦缺血后可誘發(fā)腎臟繼發(fā)性損傷，AST Ⅳ和PNS配伍冰片除可減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷外，還可減輕腦缺血后繼發(fā)性腎臟損傷，其作用與調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路、抑制腎臟炎癥有關。通過本研究，可為AST Ⅳ與PNS配伍冰片的臨床應用和進一步開發(fā)提供科學和實驗依據(jù)。

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