熱反應(yīng)牛骨香精酶解工藝優(yōu)化及關(guān)鍵氣味化合物鑒定

王海麗, 關(guān) 鑫, 唐 源, 宋煥祿,*, 潘文清, 龔 林, 陳琬盈

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院, 北京 100048;2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司, 湖南 長(zhǎng)沙 410100)

畜禽骨是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的肉類(lèi)加工副產(chǎn)品。隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大、屠宰量的增多,畜禽骨的產(chǎn)量隨之增加,畜禽骨及其相關(guān)副產(chǎn)物的加工與增值利用成為了研究熱點(diǎn)。牛骨素是牛骨的加工粗產(chǎn)物,是牛骨經(jīng)過(guò)粉碎、加熱浸提、過(guò)濾除渣、離心除油、濃縮后制得的牛骨髓抽提物。牛骨素中的優(yōu)質(zhì)蛋白含量高約34%,可溶性固形物含量約50%;根據(jù)制作過(guò)程中是否離心除油,牛骨素可分為濃湯型、清湯型等產(chǎn)品類(lèi)別。近年來(lái),天然香料香精的需求處于不斷上升的趨勢(shì),以牛骨素作為蛋白酶解物來(lái)源,與糖類(lèi)、氨基酸等原料,通過(guò)美拉德反應(yīng)制備的熱反應(yīng)牛骨香精屬于天然產(chǎn)品的范疇,既具有牛肉的獨(dú)特香味,又有骨湯的鮮味,是深受消費(fèi)者喜愛(ài)的復(fù)合調(diào)味料。

蛋白質(zhì)水解是食品工業(yè)中開(kāi)發(fā)肉類(lèi)風(fēng)味香精的重要過(guò)程。在食品生產(chǎn)過(guò)程中,游離氨基酸和多肽可以作為重要的風(fēng)味前體物對(duì)食品質(zhì)量產(chǎn)生影響:一方面其本身能夠呈現(xiàn)一定滋味,而且還能與其他滋味成分交互作用增強(qiáng)或者減弱食品風(fēng)味[1];另一方面可作為風(fēng)味原料或前驅(qū)物直接與糖類(lèi)發(fā)生美拉德反應(yīng),增強(qiáng)香氣[2]。通過(guò)定向控制骨素酶解條件可產(chǎn)生多樣化的目標(biāo)產(chǎn)物,用于開(kāi)發(fā)各種風(fēng)味濃郁、醇厚自然的肉味香精[3]。目前,研究多集中于雞骨素和豬骨素等[4-7],對(duì)于酶解牛骨素制備熱反應(yīng)牛骨香精的研究較少,因此,制備出風(fēng)味醇厚、圓潤(rùn)自然的熱反應(yīng)牛骨香精具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。

Chiang等[8]研究了內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶酶解處理對(duì)牛骨提取物理化性質(zhì)的影響,結(jié)果證明骨素的酶解在將低值肉制品轉(zhuǎn)化為具有低黏度、無(wú)凝膠特性的高值功能成分方面展示了潛力。Zheng等[9]研究了微波和超聲波對(duì)牛骨蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度、抗氧化活性和風(fēng)味特性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)微波結(jié)合超聲波可以提高牛肉骨粉中蛋白質(zhì)的酶解效果,改善酶解產(chǎn)物的抗氧化性能和風(fēng)味。Dong等[10]從雞骨素中高壓提取蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)雞骨素在酶解8 h后,小分子肽含量與酶解1 h相比增加了74倍,結(jié)果證明雞骨素及其酶解產(chǎn)物是一種新的、潛在的適合各種食品的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。但已有研究均未對(duì)酶解骨素再經(jīng)熱反應(yīng)制得的熱反應(yīng)香精進(jìn)行深入研究。因此,本研究以牛骨素為原料,選用復(fù)合蛋白酶,利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)考察酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶加酶量及復(fù)合酶加酶比例對(duì)酶解液水解度,以及由酶解液與糖、氨基酸等原料經(jīng)美拉德反應(yīng)制備的熱反應(yīng)牛骨香精的感官評(píng)分的影響,并利用高效液相色譜法測(cè)定游離氨基酸質(zhì)量比、利用全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜技術(shù),分析牛骨素酶解前后制備的熱反應(yīng)牛骨香精關(guān)鍵氣味化合物的質(zhì)量比。本研究旨在為熱反應(yīng)牛骨香精工業(yè)化生產(chǎn)中的酶解工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨素(清湯型,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%)、水解植物蛋白(hydrolyzed vegetable protein,HVP),湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;葡萄糖、木糖、半胱氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素,河南興源化工產(chǎn)品有限公司;復(fù)合風(fēng)味蛋白酶FlavourzymeTM500MG(1.0×105U/g)、諾維信復(fù)合蛋白酶ProtamexTM(1.5×105U/g),丹麥諾維信公司;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)試劑、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC),美國(guó)Sigma公司;硼酸鹽緩沖溶液、甲醇、乙腈、磷酸二氫鈉、甲醛、氫氧化鈉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2-甲基-3-庚酮,上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8890A-5977型全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜[配備的一維色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm),二維色譜柱為 DB-17ms(1.85 m×0.18 mm×0.18 μm)]、1200型高效液相色譜,美國(guó)安捷倫公司;Sniff 9100型嗅聞儀,瑞士Brechbuhler公司;BSA124S型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;MP511型pH計(jì),上海雙旭電子有限公司; SA402B型電子舌,日本INSENT公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,北京天林恒泰科技有限公司;CR22N型高速冷凍離心機(jī),天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司;KD-310型凱氏定氮儀,嘉盛(香港)科技有限公司;PEN3型便捷式電子鼻,德國(guó)Airsense公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1酶解液的制備

酶解液的制備參考文獻(xiàn)[11]方法并做出優(yōu)化。將50 g牛骨素加入錐形瓶,于恒溫水浴鍋中加熱,待溫度恒定后加酶,開(kāi)啟電動(dòng)攪拌棒進(jìn)行攪拌,保持恒溫酶解。酶解反應(yīng)結(jié)束后將水浴溫度迅速升至90 ℃,恒溫保持10 min滅酶,制得牛骨素酶解液,冷卻至室溫備用。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.2熱反應(yīng)牛骨香精的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期的方法并進(jìn)行優(yōu)化[12]。稱(chēng)取牛骨素酶解液30.0 g,添加蒸餾水14.0 g、葡萄糖0.5 g、木糖1.0 g、半胱氨酸1.0 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、硫胺素0.5 g和HVP 2.5 g于錐形瓶中,在pH值為7.0、120 ℃條件下反應(yīng)1 h制備熱反應(yīng)牛骨香精,冷卻至室溫備用,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.3水解度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法,對(duì)牛骨素酶解液的水解度進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算方法見(jiàn)式(1)。

(1)

式(1)中,氨基酸態(tài)氮的測(cè)定使用甲醛滴定法,g;總蛋白質(zhì)量的測(cè)定使用凱氏定氮儀,g。

1.3.4熱反應(yīng)牛骨香精的感官評(píng)價(jià)

由北京工商大學(xué)分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室成員(平均年齡為27歲)組成的感官評(píng)價(jià)小組,所有參加的評(píng)價(jià)員均符合ISO 6658、ISO 8586-1和ISO 8586-2要求。實(shí)驗(yàn)前對(duì)氣味屬性和基本五味進(jìn)行4 h的感官訓(xùn)練,對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精的整體風(fēng)味輪廓進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)步驟:準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品于40 mL頂空瓶中,在55 ℃的恒溫金屬浴中加熱。氣味評(píng)價(jià)時(shí)需在相鄰樣品之間間隔5 min,必要時(shí)使用咖啡豆緩解嗅覺(jué)疲勞。滋味評(píng)價(jià)時(shí)將樣品稀釋10倍,并打亂序號(hào),每?jī)蓚€(gè)樣品之間使用純凈水漱口。滋味和氣味的感官評(píng)價(jià)均按照10分制(6個(gè)梯度):未感知為0分,極弱為1～2分,氣味或滋味較弱為3～4分,中等強(qiáng)度感知為5～6分,氣味或滋味感知較強(qiáng)為7～8分,非常強(qiáng)烈為9～10分,感官評(píng)價(jià)使用的參比標(biāo)準(zhǔn)溶液見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)使用的參比標(biāo)準(zhǔn)溶液

感官評(píng)分的計(jì)算見(jiàn)式(2)。

感官評(píng)分=0.6×(0.5×肉香分+0.3×烤香分+
0.2×焦糖香分+0.2×辛香分-0.1×酸味分-0.1×
焦煳味分)+0.4×(0.5×鮮味分+0.5×咸味分+
0.2×甜味分-0.1×苦味分-0.1×酸味分)。

(2)

1.3.5牛骨素酶解工藝的優(yōu)化

1.3.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

控制其他條件不變,依次考察酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)、復(fù)合酶加酶量(750、1 000、1 250、1 500、1 750 U/g) 、復(fù)合酶加酶比例[復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的加酶量(以酶活計(jì))∶復(fù)合蛋白酶的加酶量(以酶活計(jì))為1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2]對(duì)牛骨素酶解液水解度和制備的熱反應(yīng)牛骨香精感官評(píng)分的影響。

1.3.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶加酶量和復(fù)合酶加酶比例(復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的加酶量:復(fù)合蛋白酶的加酶量)4個(gè)因素作為自變量,以不同條件下制備的熱反應(yīng)牛骨香精感官評(píng)分為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。采用Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定較優(yōu)的酶解條件。

1.3.6游離氨基酸的測(cè)定

1.3.6.1 游離氨基酸的定性和定量

游離氨基酸的定性和定量方法參考文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行。利用高效液相色譜,采用安捷倫的柱前衍生法對(duì)牛骨素、酶解液、熱反應(yīng)牛骨香精中的16種游離氨基酸進(jìn)行定量分析。分別取2 g牛骨素、酶解液、熱反應(yīng)牛骨香精加入6 g 0.1 mol/L的HCl,在4 ℃、10 000 r/min離心15 min,取上清液,過(guò)0.45 μm尼龍濾膜,待儀器檢測(cè),每個(gè)樣品做3次平行,結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

測(cè)定條件。色譜柱為Zorbax Eclipse-AAA (4.6 mm×150 mm×5 μm), 流動(dòng)相A為40 mmol/L的NaH2PO4溶液,pH值為7.8; 流動(dòng)相B為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10,流速為1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為338 nm,柱溫設(shè)置為45 ℃。梯度洗脫程序?yàn)? min,0流動(dòng)相B;1.9 min,0流動(dòng)相B;18.1 min,37%流動(dòng)相B;23.2 min,37%流動(dòng)相B;24.0 min,100%流動(dòng)相B;26.0 min,100%流動(dòng)相B;27.0 min,0流動(dòng)相B;30.0 min,0流動(dòng)相B。

1.3.6.2 游離氨基酸滋味活性值的計(jì)算

參考文獻(xiàn)[15]方法測(cè)定游離氨基酸。利用滋味活性值(taste activity value, TAV)判斷呈味氨基酸對(duì)牛骨素、酶解液、熱反應(yīng)牛骨香精滋味的影響。TAV的計(jì)算見(jiàn)式(3)。

(3)

式(3)中,CX表示味覺(jué)成分的質(zhì)量比,mg/100g;R表示味覺(jué)成分的識(shí)別閾值,mg/100 g。

1.3.7氣味輪廓的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]方法使用電子鼻對(duì)牛骨素、酶解液測(cè)定氣味輪廓。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5 mL于40 mL頂空瓶中,55 ℃條件下加熱30 min,然后依次用電子鼻對(duì)揮發(fā)性氣味進(jìn)行分析檢測(cè),電子鼻載氣為干燥空氣,設(shè)置測(cè)試時(shí)間為300 s,清洗時(shí)間為100 s,每組樣品做3個(gè)平行。

1.3.8滋味輪廓的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]方法使用電子舌對(duì)牛骨素、酶解液測(cè)定滋味輪廓。準(zhǔn)確移取20 mL樣品于燒杯中,按照1∶4加入蒸餾水,以10 000 r/min離心15 min后通過(guò)0.45 μm濾膜抽濾至澄清,分別取30 mL樣品放于電子舌專(zhuān)用杯中進(jìn)行檢測(cè),采樣時(shí)間為120 s,每組樣品檢測(cè)4次。

1.3.9關(guān)鍵氣味化合物的鑒定

1.3.9.1 揮發(fā)性氣味化合物的測(cè)定

參考Wang等[18]的方法,利用全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC×GC-O-MS)對(duì)牛骨素、酶解液分別制備的熱反應(yīng)牛骨香精的揮發(fā)性氣味化合物進(jìn)行測(cè)定。

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g樣品于20 mL干凈無(wú)異味的頂空瓶中,加入1 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的內(nèi)標(biāo)化合物2-甲基-3-庚酮(溶于正己烷),蓋好瓶蓋。設(shè)置自動(dòng)化進(jìn)樣程序,使樣品在55 ℃的條件下平衡20 min,插入萃取頭吸附40 min,在250 ℃條件下解析8 min。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

氣相條件。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃,保持3 min,以3 ℃/min的速率升至230 ℃,保持5 min,調(diào)制周期為3.5 s,進(jìn)樣口溫度為250 ℃。高純氦氣作為載氣,進(jìn)樣分流比為2∶1,分流流量為2 mL/min。

質(zhì)譜條件。離子源溫度為230 ℃,電子轟擊源為70 eV,質(zhì)譜掃描范圍為全掃描,m/z范圍為40～500 u,四極桿溫度為150 ℃,檢測(cè)器溫度為250 ℃。

1.3.9.2 揮發(fā)性氣味化合物的定性定量分析

揮發(fā)性氣味化合物由質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)結(jié)果、化合物保留指數(shù)(retention index,RI)和氣味(odor,O)描述共同確定,化合物的質(zhì)譜結(jié)果通過(guò)Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00和NIST 17數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)結(jié)構(gòu)和匹配度檢索鑒定,匹配度一般要求超過(guò)700,然后根據(jù)正構(gòu)烷烴(C7～C30)獲得保留指數(shù)對(duì)化合物二次鑒定[19]。用內(nèi)標(biāo)化合物2-甲基-3-庚酮對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精中的揮發(fā)性氣味化合物進(jìn)行半定量,計(jì)算方法見(jiàn)式(4)。

(4)

式(4)中,CX為待測(cè)化合物的質(zhì)量比,ng/g;CO為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度,0.816 μg/μL;AX為待測(cè)揮發(fā)性氣味化合物的峰面積;AO為內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積;m為樣品的質(zhì)量,g;V為內(nèi)標(biāo)的體積,μL。

1.3.9.3 關(guān)鍵氣味化合物的氣味活性值計(jì)算

使用氣味活性值(odor activity value,OAV)評(píng)估關(guān)鍵氣味化合物對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精整體香氣的貢獻(xiàn)。OAV值計(jì)算方法見(jiàn)式(5)。

(5)

式(5)中,Ci表示揮發(fā)性氣味化合物的質(zhì)量比,ng/g;OTi表示該化合物在水中的閾值,ng/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019和Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)酶解液的水解度和牛骨素制備的熱反應(yīng)牛骨香精的感官評(píng)分進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”,采用Design-Expert V8.0.6軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛骨素酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同酶解條件對(duì)酶解液水解度和制備熱反應(yīng)牛骨香精感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖1。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

酶解效果可以由水解度反映,水解度越高,釋放的化合物越多[20]。DH的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定較復(fù)雜,本研究用式(1)的計(jì)算值進(jìn)行粗略估算。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的較適酶解溫度均為50～55 ℃,45～65 ℃,隨著酶解溫度的升高,水解度和感官評(píng)分先上升后下降,50 ℃時(shí)水解度較高,肉香味厚重,當(dāng)酶解溫度高于較適溫度后,酶活性降低或者部分活性喪失,水解度和感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)。酶解時(shí)間為4 h時(shí)制備的熱反應(yīng)牛骨香精感官評(píng)分較高,肉味濃厚,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),感官評(píng)分逐漸降低,可能是由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),分解出的氨基酸與其他成分發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生了不良?xì)馕丁?～6 h水解度無(wú)明顯差異,推測(cè)是因?yàn)榈孜锱c酶活性位點(diǎn)基本完全結(jié)合,無(wú)多余的酶活位點(diǎn)參與反應(yīng),考慮到節(jié)能,選擇4 h為較優(yōu)酶解時(shí)間。復(fù)合酶加酶量為750～1 250 U/g時(shí),酶解液水解度和熱反應(yīng)牛骨香精的感官評(píng)分顯著增加(P<0.05)且與復(fù)合酶加酶量呈正相關(guān),但加酶量繼續(xù)增加時(shí),水解度和感官評(píng)分逐漸減緩但差異不顯著,這是因?yàn)榈孜镆欢〞r(shí),隨著加酶量的不斷增加,沒(méi)有過(guò)多的底物與酶結(jié)合,且過(guò)量的酶反而會(huì)抑制酶反應(yīng)的進(jìn)行,因此,較適復(fù)合酶加酶量為1 250 U/g。復(fù)合酶加酶量一定,隨著復(fù)合風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的加酶比例逐漸增加,當(dāng)復(fù)合風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶加酶比例為3∶2時(shí)感官評(píng)分與水解度達(dá)到較大值,當(dāng)復(fù)合酶加酶比例繼續(xù)增加時(shí),感官評(píng)分和水解度呈明顯下降趨勢(shì),這與復(fù)合蛋白酶單獨(dú)作用時(shí)水解度大于復(fù)合風(fēng)味蛋白酶單獨(dú)作用有關(guān),因此隨著復(fù)合風(fēng)味蛋白酶比重的繼續(xù)增加會(huì)降低酶解液水解度。

2.1.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析見(jiàn)表2和圖2。

圖2 不同的酶解因素交互作用對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of interaction of different enzymatic hydrolysis factors on sensory score of thermal reaction bovine bone flavoring

表2 酶解工藝優(yōu)化的響應(yīng)面結(jié)果

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到二次多項(xiàng)回歸方程為y=8.06+0.17A+0.38B-0.3C+0.013D-0.16AB-0.23AC+0.12AD-0.32BC+0.18BD+0.025CD-0.28A2-0.4B2-0.99C2-0.2D2。

因素間相互作用的強(qiáng)弱可以通過(guò)響應(yīng)曲面反映,響應(yīng)面呈凸形,表明因素之間的交互作用較強(qiáng),作用顯著。由圖2可知,隨著各因素值的增加,感官評(píng)分呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(shì),當(dāng)各因素達(dá)到一定值繼續(xù)增加時(shí),響應(yīng)值逐漸降低,說(shuō)明熱反應(yīng)牛骨香精的感官評(píng)分與酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶加酶量、復(fù)合酶加酶比例之間呈非線(xiàn)性關(guān)系。只有在特定的酶解條件下制備熱反應(yīng)牛骨香精,感官評(píng)分才會(huì)有較大值。通過(guò)模型得到的較優(yōu)條件為酶解溫度50 ℃、時(shí)間4 h、復(fù)合酶加酶量1 250 U/g、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的加酶比例為3∶2,感官評(píng)分為8.24分,進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后,感官評(píng)分為8.17分,與理論值無(wú)顯著性差異,說(shuō)明該工藝具有可行性。

2.2 牛骨素、酶解液及熱反應(yīng)牛骨香精中游離氨基酸的變化

牛骨素、酶解液及熱反應(yīng)牛骨香精中游離氨基酸的質(zhì)量比變化見(jiàn)表3。

表3 牛骨素、酶解液、熱反應(yīng)牛骨香精中游離氨基酸的質(zhì)量比、閾值、TAV值

游離氨基酸具有鮮味、甜味、苦味、無(wú)味等呈味特征[21], TAV用來(lái)表征化合物滋味活性的大小。

酶解液中除組氨酸和丙氨酸外,所有游離氨基酸的TAV相對(duì)于酶解前均顯著提升。鮮味氨基酸在酶解液中質(zhì)量比較高,丙氨酸雖然主要提供甜味,但是與鮮味氨基酸具有協(xié)同提鮮的作用[22]。酶解液中苦味氨基酸約占游離氨基酸總質(zhì)量比的一半,這與Kong等[23]的研究結(jié)果相似,其指出苦味氨基酸是雞肉酶解液中的主要氨基酸。另外,有研究表明,苦味氨基酸通常不具備味覺(jué)活性,苯丙氨酸和酪氨酸是苦味氨基酸也是芳香族氨基酸,當(dāng)芳香族氨基酸閾值高于含量時(shí),可以提高酶解液的鮮味和甜味[24]。由于美拉德反應(yīng)過(guò)程的消耗,大部分氨基酸質(zhì)量比均顯著性降低,推測(cè)這部分氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌匾某饰段镔|(zhì)[25],甜味氨基酸總量增加,可能與美拉德過(guò)程中涉及的Strecker降解、羰氨反應(yīng)和肽降解等反應(yīng)有關(guān)。熱反應(yīng)牛骨香精相較于酶解液所有苦味氨基酸質(zhì)量比均減少且TAV值均小于1,這與李嬌等[26]的研究一致,他們發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)可以改善酶解液的滋味并改變氨基酸的組成和比例。因此,經(jīng)酶解大量的呈味氨基酸被釋放出來(lái),美拉德反應(yīng)可以幫助減少酶解液中的苦味,增加鮮味和甜味,使熱反應(yīng)牛骨香精的滋味得到改善。

2.3 牛骨素酶解前后的氣味輪廓分析結(jié)果

電子鼻分析牛骨素、酶解液的氣味輪廓主成分分析(principal component analysis,PCA)和雷達(dá)圖見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知,PC1為86.8%,PC2為9.1%,貢獻(xiàn)率之和接近95.9%,說(shuō)明兩個(gè)主成分能夠反映樣品之間的綜合信息。 PC1的方差貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于PC2,表明PC1軸向右距離越大,樣品差異性越大。兩個(gè)樣品在橫坐標(biāo)上距離相對(duì)較近,但相互間無(wú)重疊部分,說(shuō)明兩個(gè)樣品的揮發(fā)性物質(zhì)有一定差異。由圖3(b)可看出R3、R4、R5、R9變化幾乎無(wú)影響,說(shuō)明酶解后氨類(lèi)、氫化物、有機(jī)硫化物、短鏈烷烴芳香等化合物的種類(lèi)和含量變化不大。牛骨素和酶解液R2(對(duì)氮氧化物靈敏)、R8(對(duì)乙醇、部分芳香化合物靈敏)和R10(對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴類(lèi)化合物靈敏)的響應(yīng)值變化較為明顯,推測(cè)這3個(gè)感應(yīng)器是區(qū)分兩個(gè)樣品的重要指標(biāo)。說(shuō)明在酶解后,酶解液產(chǎn)生更多的氮氧化物,同時(shí)使牛骨素烷烴類(lèi)中具有不愉快氣味化合物的含量降低,在一定程度上可以改善牛骨素的整體風(fēng)味。

圖3 牛骨素和酶解液電子鼻響應(yīng)值的PCA和雷達(dá)圖Fig.3 PCA and radar plot of electronic nose response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.4 牛骨素酶解前后的滋味輪廓分析結(jié)果

電子舌分析牛骨素、酶解液的滋味輪廓主成分分析(PCA)和雷達(dá)圖見(jiàn)圖4。由圖4(a)可知PC1為77.1%,PC2為22.5%,貢獻(xiàn)率之和為99.6%,說(shuō)明酶解前后兩個(gè)樣品的滋味存在顯著性差異。通過(guò)電子舌對(duì)牛骨素和酶解液中的4種基本味(酸、苦、咸、鮮)以及濃厚味、澀味進(jìn)行滋味分析。由圖4(b)可知,酶解后鮮味值較大,酶解使鮮味氨基酸大量釋放,這與游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果相符。濃厚味、咸味的響應(yīng)值增加,可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解后產(chǎn)生了具有咸味或類(lèi)似咸味作用的肽[27]。酸味響應(yīng)值小于-30,說(shuō)明樣品中無(wú)該味道[28]。苦味響應(yīng)值降低但無(wú)明顯變化,分析其原因,一方面可能是因?yàn)槊附膺^(guò)程中使用的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶包含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性,可用來(lái)降低水解產(chǎn)物的苦味肽鏈,將其徹底降解為氨基酸;另一方面可能與苦味氨基酸不具備味覺(jué)活性,苦味易被其他味道掩蓋有關(guān)。

圖4 牛骨素和酶解液電子舌響應(yīng)值的PCA和雷達(dá)圖Fig.4 PCA and radar plot of electronic tongue response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.5 熱反應(yīng)牛骨香精關(guān)鍵氣味化合物的鑒定結(jié)果

牛骨素、酶解液分別制備熱反應(yīng)牛骨香精的特征風(fēng)味二維譜圖見(jiàn)圖5。運(yùn)用GC×GC-O-MS對(duì)牛骨素、酶解液分別制備的熱反應(yīng)牛骨香精進(jìn)行色譜分析,結(jié)合嗅聞檢測(cè),共鑒定出揮發(fā)性化合物164種,包含27種醛類(lèi)、30種酮類(lèi)、12種醇類(lèi)、16種酸類(lèi)、7種含硫化合物、10種酯類(lèi)、18種吡嗪類(lèi)、10種呋喃類(lèi)、6種噻唑類(lèi)、4種噻吩類(lèi)和24種其他類(lèi)化合物,其中74種是氣味活性化合物。牛骨素制備熱反應(yīng)牛骨香精樣品鑒定出145種揮發(fā)性化合物,酶解液制備熱反應(yīng)牛骨香精鑒定出129種揮發(fā)性化合物。

圖5 牛骨素和酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精的全二維氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜Fig.5 GC×GC-O-MS of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

牛骨素和酶解液分別制備熱反應(yīng)牛骨香精中揮發(fā)性氣味化合物的質(zhì)量比和關(guān)鍵氣味化合物的OAV見(jiàn)表4和表5。已鑒別出的物質(zhì)中,酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精產(chǎn)物中酸類(lèi)物質(zhì)總質(zhì)量比顯著增加,可能是由于氨基酸降解后經(jīng)過(guò)氧化或還原作用產(chǎn)生,也可能是由飽和脂肪酸本身氧化降解產(chǎn)生[29],牛骨素經(jīng)酶解后發(fā)生美拉德反應(yīng)生成了乙酸,乙酸具有強(qiáng)烈刺激性氣味,屬于低級(jí)飽和酸,雖然酸類(lèi)化合物閾值較大,但酸類(lèi)化合物與其他香氣成分之間具有協(xié)同效應(yīng),可以使熱反應(yīng)牛骨香精整體氣味更加豐富和強(qiáng)烈。醛類(lèi)物質(zhì)與其他類(lèi)型化合物相比,總質(zhì)量比較高,酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中產(chǎn)生了(E,E)-2,4-癸二烯醛,其閾值很低,OAV大于7,具有油味和雞肉香味,對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精的脂肪氣息具有貢獻(xiàn)作用。酮類(lèi)化合物種類(lèi)雖然較多,但其閾值相對(duì)較高,因此對(duì)熱反應(yīng)牛骨香精風(fēng)味的貢獻(xiàn)并不突出,然而有些酮類(lèi)是形成雜環(huán)類(lèi)化合物的重要中間體,對(duì)肉香味的形成有著必不可少的作用[30],4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮呈現(xiàn)焦糖氣息,具有明顯的增香增甜效果。含硫化合物主要來(lái)自美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物或者氨基酸的熱解,是決定肉味的關(guān)鍵物質(zhì),酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中產(chǎn)生了2-甲基-3-呋喃硫醇、糠基甲基硫醚和甲基糠基二硫醚這幾種典型的肉香味化合物。含硫化合物閾值一般較低,因此這些化合物的產(chǎn)生對(duì)香精整體的肉香味特征形成具有重要的作用,這也是酶解液比牛骨素制備的熱反應(yīng)牛骨香精肉香味更濃郁突出的原因之一。呋喃類(lèi)化合物通常在焦糖化和糖降解過(guò)程中產(chǎn)生,能增加熱反應(yīng)牛骨香精的焦糖味,對(duì)整體香氣有較好的修飾作用。噻吩和噻唑類(lèi)主要由硫胺素降解產(chǎn)生,是肉制品中主要的香氣化合物。

表4 牛骨素和酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中的揮發(fā)性氣味化合物

續(xù)表4

表5 牛骨素和酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中關(guān)鍵氣味化合物的OAV Tab.5 OAV of key odor compounds of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

此外,由表5可知,牛骨素和酶解液所制備熱反應(yīng)牛骨香精產(chǎn)物中OAV>1的關(guān)鍵氣味化合物共有22種,包括醛類(lèi)6種、酮類(lèi)2種、醇類(lèi)1種、酯類(lèi)2種、吡嗪類(lèi)3種、呋喃類(lèi)2種、烯類(lèi)2種、含硫化合物4種。主要差異為牛骨素制備的熱反應(yīng)牛骨香精產(chǎn)物以果味、焦糖、烤香味為主,酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精具有更多的脂肪、肉味氣息,含硫化合物種類(lèi)較多且貢獻(xiàn)較高,主要貢獻(xiàn)硫黃味、肉味和蔥香味。其次是醛類(lèi)化合物,主要貢獻(xiàn)果香、花香、脂肪味。此外,酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精產(chǎn)物中新產(chǎn)生了β-石竹烯,OAV>1,增強(qiáng)了香料、辛香味,使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香氣的豐富度與整體強(qiáng)度得以提升。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化熱反應(yīng)牛骨香精的酶解工藝,較佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、時(shí)間4 h、復(fù)合酶加酶量1 250 U/g、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的加酶比例為1∶1。利用高效液相色譜分析牛骨素、酶解液和熱反應(yīng)牛骨香精中的游離氨基酸,發(fā)現(xiàn)酶解液中釋放出大量的呈味氨基酸,酶解液中谷氨酸、纈氨酸、精氨酸和酪氨酸的TAV大于1,鮮味和甜味突出;熱反應(yīng)牛骨香精中的所有苦味氨基酸質(zhì)量比減少,使熱反應(yīng)牛骨香精的滋味得到改善。通過(guò)電子鼻和電子舌分析牛骨素、酶解液的氣味和滋味輪廓,發(fā)現(xiàn)酶解液中氮氧化物的氣味特征增強(qiáng),且酶解液中的鮮味、濃厚味、咸味響應(yīng)值更高。利用GC×GC-O-MS測(cè)定牛骨素、酶解液所制備熱反應(yīng)牛骨香精中的揮發(fā)性氣味化合物,共鑒定出164種揮發(fā)性化合物,牛骨素制備的熱反應(yīng)牛骨香精有145種揮發(fā)性氣味化合物, OAV>1的關(guān)鍵氣味化合物有17種,主要貢獻(xiàn)烤香味、果味和甜香味;酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中共鑒定出129種揮發(fā)性化合物,有17種關(guān)鍵氣味化合物,但脂肪味、肉香味和蔥香味更明顯,與牛骨素制備的熱反應(yīng)牛骨香精中的關(guān)鍵氣味化合物相比,酶解液制備的熱反應(yīng)牛骨香精中新產(chǎn)生了(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-甲基-3-呋喃硫醇、甲基糠基二硫醚、己酸甲硫醇酯和β-石竹烯5種關(guān)鍵氣味化合物。后續(xù)將進(jìn)一步研究酶解液中的其他呈味物質(zhì),分離鑒定其滋味肽,探索風(fēng)味的形成機(jī)制,為牛骨素在呈味調(diào)味料中的開(kāi)發(fā)提供參考。