LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)對植物乳桿菌抵御環(huán)境脅迫的作用

馬佳歌, 譚中美, 田子豪, 吳夢果, 韋 旋, 任 潔, 姜瞻梅,于 微, 侯俊財

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院/乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室, 黑龍江 哈爾濱 150030)

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是一種依賴細(xì)胞密度的細(xì)菌通信系統(tǒng),通過種內(nèi)或種間的信號分子調(diào)節(jié)細(xì)菌行為[1]。細(xì)菌生長階段分泌產(chǎn)生的可溶性自誘導(dǎo)因子(autoinducers,AIs)自由擴(kuò)散到周圍環(huán)境內(nèi),并監(jiān)控群體密度及調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長行為和功能[2]。研究發(fā)現(xiàn),哈氏弧菌(Vibrioharveyi)可分泌信號分子AI-1(autoinducer-1,AI-1)和AI-2(autoin-ducer-2,AI-2)[3]。在革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌中普遍存在的群體感應(yīng)系統(tǒng)為信號分子AI-2介導(dǎo)的LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)[4-5]。

益生乳桿菌因其長期的安全使用歷史及調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制致病菌、預(yù)防感染和腹瀉、改善炎癥性腸病和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等潛在功能而受到廣泛關(guān)注[6]。其中,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,L.plantarum)是農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中常用的益生乳桿菌,其抵御加工、貯藏及胃腸道等環(huán)境脅迫的能力是其在食品工業(yè)中應(yīng)用的前提條件[7]。乳桿菌可通過LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)其益生功效的發(fā)揮,如參與生物膜的形成、細(xì)胞黏附的調(diào)控、抑菌作用的發(fā)揮及環(huán)境脅迫耐受性存活等[8-10]。

目前關(guān)于不同種類環(huán)境脅迫下植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)全面報道的信息有限,闡明LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)在植物乳桿菌中的調(diào)控機(jī)制對開發(fā)穩(wěn)定、高效的益生菌產(chǎn)品具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。因此,本研究擬通過解析不同初始pH值、滲透壓、溫度及營養(yǎng)環(huán)境脅迫下植物乳桿菌1.0328菌密度及代謝產(chǎn)酸情況,分析環(huán)境脅迫下LuxS/AI-2群體感應(yīng)信號分子AI-2活性隨時間的變化規(guī)律,綜合考察環(huán)境脅迫下植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因luxS及pfs表達(dá)水平上的變化規(guī)律,探討LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控植物乳桿菌抵御環(huán)境脅迫的作用機(jī)制,希望為進(jìn)一步改善益生乳桿菌在食品中實(shí)際應(yīng)用的有效性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌KLDS 1.0328,分離篩選于黑龍江省傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中,并保藏在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室;哈氏弧菌(Vibrioharveyi,V.harveyi)BB 170,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所。MRS培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;海生菌2216E培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)菌總RNA試劑盒,北京天根生化科技有限公司;Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?PremixExTaqTM試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;Step One PlusTM型實(shí)時熒光定量PCR儀,美國Life Technologies公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;H1750R型臺式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司;SpectraMax reg iD3型多功能酶標(biāo)儀,上海美谷分子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1培養(yǎng)基配制及菌種的活化

AB培養(yǎng)基配制:MgSO412.3 g/L、NaCl 17.5 g/L、不含維生素的酪蛋白氨基酸2 g/L,使用KOH溶液將pH值調(diào)至7.6,121 ℃高壓滅菌15 min,冷卻至室溫后添加無菌K2HPO4(1 mol/L)10 mL、無菌L-精氨酸(0.1 mol/L)10 mL及無菌甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%)20 mL。

將植物乳桿菌KLDS 1.0328以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)24 h,并連續(xù)活化3次以恢復(fù)菌種活力。哈氏弧菌BB 170以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種到無菌海生菌2216E培養(yǎng)基內(nèi)并以150 r/min在30 ℃條件下有氧培養(yǎng)16 h,活化3代后以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于無菌AB液體培養(yǎng)基內(nèi)備用。

1.3.2菌體密度的測定及無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備

以菌液在600 nm波長下的吸光度OD600表示菌體密度。取待測菌液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min,采用2 mol/L NaOH將上清液的pH值調(diào)節(jié)至6.5。用0.22 μm的濾膜過濾得到排酸后的無細(xì)胞發(fā)酵上清液(cell-free supernatant,CFS)。將哈氏弧菌BB 170以2%的接種量接種到無菌AB培養(yǎng)基內(nèi),150 r/min、30 ℃有氧培養(yǎng)16 h,4 ℃、4 000 r/min離心10 min,以0.22 μm濾膜過濾所得的上清液為陽性對照;AB培養(yǎng)基以0.22 μm濾膜過濾為陰性對照;將MRS培養(yǎng)基以0.22 μm濾膜過濾為介質(zhì)對照。所有樣品-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3信號分子AI-2活性的測定

將已活化好的哈氏弧菌BB 170以2%的接種量接種到無菌AB培養(yǎng)基內(nèi),在搖床175 r/min、30 ℃條件下有氧培養(yǎng)16 h,以無菌AB培養(yǎng)基將哈氏弧菌BB 170菌液按體積比1∶5 000稀釋。將待測樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品以及介質(zhì)對照樣品分別與經(jīng)過了5 000倍稀釋的哈氏弧菌BB 170菌液,按體積比1∶100混合后于175 r/min、30 ℃下共孵育[11]。當(dāng)AB培養(yǎng)基熒光強(qiáng)度最小時,于490 nm波長化學(xué)發(fā)光模式下測定熒光強(qiáng)度,以相對熒光強(qiáng)度表示信號分子AI-2的活性。

1.3.4LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平測定

通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)內(nèi)已有的植物乳桿菌luxS、pfs基因?qū)?yīng)的全序列,以16S rRNA基因為內(nèi)參基因,Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物,經(jīng)上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。使用總RNA試劑盒提取菌體總RNA。除去基因組DNA,以總RNA為模板,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,參考SYBR?PremixExTaqTM試劑盒,配制實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,共計40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因luxS及pfs的轉(zhuǎn)錄情況。

表1 引物序列信息

1.3.5LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)對植物乳桿菌抵御環(huán)境脅迫能力的測定

1)酸減脅迫。分別使用1 mol/L HCl或NaOH將MRS培養(yǎng)基調(diào)整至初始pH值分別為3.5、5.0、8.0、9.0,初始pH值為6.4±0.2的原MRS培養(yǎng)基為對照組。2)滲透壓脅迫。配制添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、3.0%、6.0% 的NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的MRS培養(yǎng)基,未添加鹽的MRS培養(yǎng)基為對照組。3)溫度脅迫。分別在25、30、37、45、50 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)溫度37 ℃為對照組。4)營養(yǎng)脅迫。以質(zhì)量濃度0.85 g/100 mL的無菌生理鹽水將MRS培養(yǎng)基分別稀釋至體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%,原MRS培養(yǎng)基為對照組。每隔4 h測定菌液在600 nm下的吸光度及可滴定酸度,并制備CFS測定AI-2信號分子活性,培養(yǎng)8 h時分析luxS及pfs的轉(zhuǎn)錄差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 26.0軟件的單因素方差分析及Tukey檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05代表數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿脅迫對菌體代謝及群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

圖1顯示了酸堿脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產(chǎn)酸、產(chǎn)AI-2信號分子及群體感應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。由圖1(a)可知,當(dāng)面臨初始pH值為3.5的環(huán)境脅迫時,植物乳桿菌KLDS 1.0328可較為緩慢地生長但容易死亡,而初始pH值為8.0的實(shí)驗組在培養(yǎng)了16～20 h時的菌體密度顯著高于對照組及其他pH值組(P<0.05),這是由于較高的初始pH值延緩了乳酸導(dǎo)致的pH值降低和酸脅迫。由圖1(b)可知,pH 3.5及pH 9.0組植物乳桿菌KLDS 1.0328的生長及產(chǎn)酸性能均受到明顯抑制。對于初始pH值為9.0的堿脅迫,菌體的生長遭到抑制,培養(yǎng)4～12 h時,相同單位量的菌體信號分子AI-2的釋放相較于對照組受到明顯抑制,而12 h后相對熒光強(qiáng)度則迅速增高,這可能是因為菌體代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸進(jìn)一步中和了培養(yǎng)基內(nèi)的堿[圖1(c)]。由圖1(d)可知,與pH值為6.4的對照組相比,pH值為3.5的酸脅迫下luxS及pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)到最高(P<0.05)。此外,當(dāng)初始pH值為8.0及9.0時,植物乳桿菌KLDS 1.0328luxS基因受到堿脅迫的誘導(dǎo)作用,其轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。在pH值為3.5的重度酸脅迫下,信號分子AI-2誘導(dǎo)的相對熒光強(qiáng)度顯著增加,這意味著信號分子AI-2的調(diào)控可能主要受到強(qiáng)酸的刺激。相似地,曾有研究報道了在pH值為3.5的條件下,發(fā)酵乳桿菌易受到脅迫并通過群體感應(yīng)系統(tǒng)以生物被膜形成率更高的形式存活[12]。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養(yǎng)時間之間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養(yǎng)時間不同脅迫處理組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.2 滲透壓脅迫對菌體代謝及群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

不同滲透壓脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產(chǎn)酸、產(chǎn)AI-2信號分子及群體感應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響見圖2。由圖2(a)可知,隨著鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加帶來培養(yǎng)基滲透壓逐漸增大,植物乳桿菌KLDS 1.0328的最大菌體密度逐漸降低,且各處理組均顯著低于未經(jīng)脅迫的對照組(P<0.05)。在較高的總鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(6.0%)下,菌體的生長緩慢。Gandhi和Shah[13]也曾揭示了,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%的NaCl可引起益生菌的細(xì)胞酯酶活性等代謝活性受到抑制,損傷細(xì)胞膜完整性,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。前期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NaCl部分被KCl替代時,植物乳桿菌菌體的損傷及黏附能力均存在一定的改善[7]。因此,本研究采用3.0% NaCl+3.0% KCl替代6.0% NaCl,旨在進(jìn)一步探索LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)在植物乳桿菌KLDS 1.0328抵御不同種類高滲透壓脅迫下的潛在作用。研究結(jié)果表明,采用KCl部分替代NaCl,與只添加NaCl的MRS培養(yǎng)基相比,未顯著提高可滴定酸度[圖2(b)],而在培養(yǎng)12～20 h時顯著提高了菌體密度(P<0.05),這表明了KCl在高滲環(huán)境中對菌體具有潛在的保護(hù)作用[14]。由圖2(c)可知,處于較強(qiáng)滲透壓脅迫下,信號分子AI-2的活性明顯受到抑制,且KCl替代滲透壓脅迫組中信號分子AI-2活性比未替代前更強(qiáng)。Lin等[15]曾證實(shí),清酒乳桿菌及植物乳桿菌遭受發(fā)酵相關(guān)高濃度硝酸鹽脅迫時,LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)luxS基因的轉(zhuǎn)錄顯著增加,表明luxS介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)通過AI-2活性的變化參與了乳桿菌的脅迫應(yīng)激反應(yīng),并在高滲脅迫適應(yīng)及微生物演替中起重要調(diào)控作用。此外,當(dāng)菌體處于質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的NaCl及以上的滲透壓脅迫時,基因luxS與pfs的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)[圖2(d)]。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養(yǎng)時間之間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養(yǎng)時間不同脅迫處理組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.3 溫度脅迫對菌體代謝及群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

溫度脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產(chǎn)酸、產(chǎn)AI-2信號分子及群體感應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響見圖3。由圖3(a)可知,低于最適溫度的 25 ℃處理能夠?qū)е戮w的生長及代謝受抑制,而45 ℃輕度高溫脅迫在培養(yǎng)初期可促進(jìn)菌體的增殖及產(chǎn)酸代謝,重度高溫脅迫則會對菌體生長代謝造成不利影響。由圖3(b)可知,于37 ℃下培養(yǎng)植物乳桿菌KLDS 1.0328的產(chǎn)酸能力較強(qiáng),而處于25 ℃及50 ℃時,菌體的產(chǎn)酸能力明顯受到抑制。輕度低溫脅迫穩(wěn)定期及輕度高溫脅迫培養(yǎng)初期,信號分子AI-2活性顯著提高;更強(qiáng)程度的溫度脅迫下,信號分子AI-2活性受到顯著抑制[圖3(c)]。低溫脅迫誘導(dǎo)促使luxS及pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),而pfs基因的轉(zhuǎn)錄受高溫脅迫的影響較小[圖3(d)]。這與Gu等[3]的研究結(jié)果相似,發(fā)酵乳桿菌2-1的群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄在較低溫度(23、30 ℃)脅迫下顯著上調(diào),而在44 ℃下基因的轉(zhuǎn)錄與未脅迫相比無顯著差異(P>0.05)。曾有研究報道了溫度脅迫適應(yīng)誘發(fā)的交叉保護(hù)能夠提升菌體面臨異種環(huán)境脅迫時的存活率[16-17]。此外,Liu等[18]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)luxS基因可提高類植物乳桿菌L-ZS9群體感應(yīng)信號分子AI-2的產(chǎn)量,luxS的過表達(dá)改善了菌株的耐熱性及膽鹽耐受性。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養(yǎng)時間之間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養(yǎng)時間不同脅迫處理組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.4 營養(yǎng)脅迫對菌體代謝及群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

圖4顯示了營養(yǎng)脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產(chǎn)酸、產(chǎn)AI-2信號分子及群體感應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。隨著營養(yǎng)缺乏脅迫程度的提高,植物乳桿菌KLDS 1.0328的生長及產(chǎn)酸性能均受到明顯抑制[圖4(a)和圖4(b)]。同時,由圖4(c)可知,營養(yǎng)脅迫的程度越強(qiáng),誘導(dǎo)產(chǎn)生的信號分子AI-2越多。此外,更為嚴(yán)酷的營養(yǎng)脅迫提高了luxS及pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平[圖4(d)]。曾有研究證實(shí)了植物乳桿菌B21的菌體形態(tài)和細(xì)胞膜脂肪酸組成及含量的改變可作為其適應(yīng)缺乏葡萄糖及吐溫-80營養(yǎng)脅迫的有效策略[19]。植物乳桿菌KLDS 1.0328信號分子AI-2的活性變化與luxS及pfs基因的轉(zhuǎn)錄水平變化并不是完全對應(yīng)的,這可能是由于轉(zhuǎn)錄水平測定的為8 h的數(shù)據(jù),所以轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)與不同培養(yǎng)時間下信號分子AI-2的活性不符。此外,由于luxS及pfs基因編碼的蛋白質(zhì)不但能夠介入信號分子AI-2的生物合成路徑,還可能在環(huán)境脅迫下介入菌體的其他代謝通路,并以脅迫應(yīng)激蛋白的形式在惡劣的環(huán)境條件下誘導(dǎo)表達(dá)的進(jìn)化。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養(yǎng)時間之間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養(yǎng)時間不同脅迫處理組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本研究對酸堿、滲透壓、溫度及營養(yǎng)匱乏脅迫條件下植物乳桿菌KLDS 1.0328的LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行了分析,信號分子AI-2分泌的抑制與初始pH值為8.0、9.0的堿脅迫,25 ℃低溫、50 ℃高溫,質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0% NaCl、3.0% NaCl+3.0% KCl的高滲透壓脅迫相關(guān);而AI-2活性的增強(qiáng)可由初始pH值為3.5、5.0的酸脅迫,45 ℃高溫,營養(yǎng)物質(zhì)稀釋至體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%的營養(yǎng)脅迫引起。經(jīng)初始pH值為3.5、9.0,25、30 ℃低溫,6.0%NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的高滲透壓以及20%的MRS培養(yǎng)基營養(yǎng)脅迫處理后,luxS及pfs的轉(zhuǎn)錄均達(dá)較高水平。因此,不同環(huán)境脅迫條件下LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)存在不同程度的變化,并參與了該菌株的抗逆過程。植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的增強(qiáng),可作為其抵御多種環(huán)境脅迫策略的新起點(diǎn)。然而,目前乳桿菌中LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控路徑的揭示仍是該研究領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)。應(yīng)在此基礎(chǔ)上采用高通量技術(shù)進(jìn)一步在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)以及代謝組學(xué)等現(xiàn)代分子生物學(xué)層面分析及驗證環(huán)境脅迫下菌體的適應(yīng)機(jī)制,系統(tǒng)分析菌體脅迫應(yīng)答的機(jī)理。研究結(jié)果旨在為闡明LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)改善益生乳桿菌對惡劣環(huán)境脅迫的抗逆機(jī)制,并為促進(jìn)益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。