溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程理化指標、風味物質(zhì)和微生物群落的影響

李曉陽,汪溢恒,鈕成拓,鄭飛云,王金晶,劉春風,李崎*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

豆瓣醬是中國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品,因其獨特風味深受消費者喜愛[1]。豆瓣醬的生產(chǎn)方式仍大多采用傳統(tǒng)“日曬夜露”發(fā)酵工藝,包括霉菌制曲和開放式自然發(fā)酵2個步驟,這也是豆瓣醬獨特風味形成的關鍵[2]。然而,這種開放式自然發(fā)酵方式依賴當?shù)貧夂蚝蜕a(chǎn)者經(jīng)驗,使得產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性較差,且在不同季節(jié)釀造得到的豆瓣醬品質(zhì)之間存在巨大差異[3]。冬季氣溫較低,微生物的生長和酶水解進程很慢,導致發(fā)酵周期較長且風味相對較差;在夏季較高的溫度下,豆瓣醬發(fā)酵過程中微生物的代謝活動較為旺盛,生產(chǎn)周期更短且產(chǎn)品具有更好的品質(zhì),但是卻存在易腐敗、生物胺含量偏高等問題[4]。由此可見,控制合適的溫度對豆瓣醬發(fā)酵有重要意義。

近年來研究表明,不同季節(jié)豆瓣醬的風味和微生物群落組成存在顯著差異[5]。夏季發(fā)酵豆瓣醬的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類和含量較為豐富,而冬季發(fā)酵醬醅的氨基酸態(tài)氮含量較高。夏季發(fā)酵豆瓣醬中的微生物群落多樣性顯著高于其他季節(jié),且溫度是導致豆瓣醬微生物群落結(jié)構(gòu)與功能季節(jié)性差異化分布的關鍵因素之一[6]。對其他發(fā)酵食品而言,以溫度為代表的環(huán)境因素會塑造其微生物群落結(jié)構(gòu)與功能,進一步影響其產(chǎn)品品質(zhì)[7]。例如,白酒低溫大曲和中溫大曲的淀粉酶活性高于高溫大曲,且發(fā)酵過程中溫度的升高降低了與碳水化合物代謝相關的基因表達[8]。在酸菜發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度升高能增加揮發(fā)性風味化合物的種類,其中明串珠菌和魏斯氏菌以及乳球菌分別在10～15 ℃和20～25 ℃占主導地位[9]。因此,探究溫度對豆瓣醬發(fā)酵的影響可進一步明晰豆瓣醬發(fā)酵背后的科學機理,可為豆瓣醬現(xiàn)代化發(fā)酵過程溫度的選擇提供參考。

本文設置了2組30 ℃和40 ℃恒溫發(fā)酵的豆瓣醬樣品,跟蹤測定了其發(fā)酵過程中的理化指標、風味物質(zhì)、生物胺和微生物群落組成,并與自然發(fā)酵樣品進行比較,揭示了不同溫度下豆瓣醬發(fā)酵過程中品質(zhì)的變化規(guī)律。論文結(jié)果為豆瓣醬發(fā)酵工藝的改良提供了理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

米曲霉(Aspergillusoryzae)3.042,保藏于本實驗室;蠶豆瓣、面粉、食鹽,無錫當?shù)爻?NaOH、鹽酸、甲醛、硫酸銅、酒石酸鈉、三氯乙酸等試劑均為分析純,上海國藥集團;NucleoSpin試劑盒,基因生物技術國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平、pH計,METTLER TOLEDO公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;安捷倫1260高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS),美國安捷倫科技有限公司;磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司;Qubit熒光儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆瓣醬發(fā)酵樣品的設計與制備

將洗凈蠶豆瓣與溫水浸泡6～8 h,于115 ℃高壓處理15 min。冷卻后的蠶豆與小麥粉按3∶1(質(zhì)量比)混合,接種米曲霉3.042孢子懸液,接種量為1×107CFU/g,在30 ℃、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h得到成曲。將成曲與鹽水按1∶1混合均勻后,平均分裝到9個透明塑料小桶(3 L)。將小桶按每組3個分成3個小組,分別命名為自然溫度發(fā)酵組、30 ℃恒溫發(fā)酵組和40 ℃恒溫發(fā)酵組(下稱自然發(fā)酵組、30 ℃發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組)。自然發(fā)酵組的發(fā)酵條件參照傳統(tǒng)發(fā)酵,而30 ℃發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組分別在30 ℃和40 ℃培養(yǎng)箱中進行。在發(fā)酵前7 d每天進行翻醬,而之后每隔7 d進行翻醬,并收集樣品以備后續(xù)分析。

1.3.2 醬醅理化指標的測定

總酸含量參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定pH計電位滴定法》。氨基酸態(tài)氮含量參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定 酸度計法》。還原糖含量參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定 直接滴定法》。氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。生物胺含量參照GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定 液相色譜法》。

1.3.3 醬醅揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

稱取2 g研磨均勻的豆瓣醬樣品與2 g NaCl和8 mL去離子水混合,并轉(zhuǎn)移到15 mL固相萃取瓶中,同時加入5 μL 2-辛醇溶液作為內(nèi)標。用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS)測定發(fā)酵第49天后的豆瓣醬樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)。樣品在55 ℃水浴預熱30 min后用SPME纖維吸附揮發(fā)物40 min,濃縮的揮發(fā)物通過氣相色譜儀在250 ℃解吸3 min。揮發(fā)性物質(zhì)的分離在DB-WAX毛細管柱上進行,具體條件如下[10]:

色譜條件:毛細管色譜柱型號DB-WAX(30 mm×0.25 mm,0.25 μm),色譜柱首先在50 ℃保持2 min,然后升溫至230 ℃保持12 min,升溫速度為5 ℃/min。載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:電離源EI,發(fā)射流200 μA,驅(qū)電壓0.5 V,電子能量70 eV,離子能量1.8 eV,離子源溫度260 ℃,接口溫度250 ℃,探測器電壓350 V,掃描范圍25～500 amu。

數(shù)據(jù)處理:未知化合物在NIST和Willey譜庫中檢索匹配,僅采用匹配度>700的鑒定結(jié)果,其相對含量采用面積歸一化法進行定量分析[11]。

1.3.4 醬醅微生物群落的擴增子測序

使用NucleoSpin試劑盒提取豆瓣醬醬醅中微生物群落的總DNA,用Qubit熒光儀對DNA進行定量并在1%瓊脂糖凝膠上運行一個等分試樣檢查質(zhì)量。采用引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)分別擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域序列[12]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和標記后完成DNA文庫構(gòu)建,然后應用于Illumina Hiseq 2500平臺進行測序。DNA文庫的測序由武漢華大醫(yī)學檢驗所有限公司完成。使用QIIME軟件將有效序列聚類為相似度為97%的操作分類單元(operational taxon unit,OTU)[13]。使用Greengenes細菌數(shù)據(jù)庫和UNITE真菌數(shù)據(jù)庫對代表性的OTU序列進行注釋。在QIIME中計算出α多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖形繪制采用Excel軟件和Origin 95軟件。相關性分析通過R語言中Hmisc和Corrplot包提供的函數(shù)計算,結(jié)果以圖片形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程理化指標的影響

氨基酸態(tài)氮、還原糖含量和總酸含量被認為是評價豆瓣醬品質(zhì)的主要指標[14]。如圖1-A所示,自然發(fā)酵組和30 ℃發(fā)酵組醬醅的氨基酸氮含量在發(fā)酵初期逐漸增加,然后分別穩(wěn)定在約0.95、0.92 g/100 g。40 ℃發(fā)酵組的氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵第35天達到最高(1.02 g/100 g),然后下降到約0.80 g/100 g。如圖1-B所示,3組醬醅的還原糖含量在發(fā)酵過程中均持續(xù)上升,最終分別達到11.70、12.10、12.07 g/100 g。如圖1-C所示,3組豆瓣醬樣品中的總酸含量在發(fā)酵過程中持續(xù)上升40 ℃發(fā)酵組醬醅的總酸濃度(3.36 g/100 g)顯著高于30 ℃發(fā)酵組(2.46 g/100 g)和自然溫度發(fā)酵(2.06 g/100 g)。此外,3組醬醅樣品的pH值持續(xù)下降,其中40 ℃發(fā)酵組的pH值最低(圖1-D)。氨基酸態(tài)氮含量越高標志著豆瓣醬的品質(zhì)越好,而還原糖在發(fā)酵過程中能促進微生物的生長代謝,同時作為美拉德反應底物促進豆瓣醬的色澤和風味化合物形成[15]?？偹釢舛雀叩头磻水a(chǎn)酸微生物在發(fā)酵過程中的數(shù)量以及是否存在雜菌污染等情況[16]?？偹釢舛冗^高說明微生物群落組成可能失衡,進而導致產(chǎn)品質(zhì)量不達標[17]。由此可見,相對較高溫度有利于豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮和還原糖在發(fā)酵前中期的積累,但同時會顯著提高醬醅總酸含量。

A-氨基酸態(tài)氮;B-還原糖;C-總酸;D-pH值圖1 不同溫度豆瓣醬發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸和pH值的變化Fig.1 Changes of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid and pH values during broad bean paste fermentation at different temperatures

2.2 溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的影響

2.2.1 溫度對醬醅游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸是豆瓣醬滋味的重要貢獻物質(zhì)[18]。根據(jù)理化指標檢測結(jié)果,在發(fā)酵第7、35、49天豆瓣醬的氨基酸態(tài)氮含量有顯著變化,因此分析檢測了上述豆瓣醬樣品的游離氨基酸含量。如圖2所示,在發(fā)酵過程中自然發(fā)酵組和30 ℃發(fā)酵組的總游離氨基酸含量均呈現(xiàn)增加趨勢,而40 ℃發(fā)酵組的游離氨基酸含量先增加后減少,與氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢一致。盡管在發(fā)酵前期恒溫發(fā)酵組的氨基酸總量高于自然發(fā)酵組,在發(fā)酵結(jié)束后自然發(fā)酵組的游離氨基酸含量(6.54 g/100 g)高于30 ℃發(fā)酵組(5.68 g/100 g)和40 ℃發(fā)酵組(4.86 g/100 g)。醬醅氨基酸主要來源于微生物分泌蛋白酶對底物蛋白質(zhì)的降解,而在發(fā)酵過程中其會同時作為氮源和風味前體物質(zhì)被微生物利用[19]。3種不同發(fā)酵溫度會導致發(fā)酵過程中微生物群落產(chǎn)酶及代謝特征發(fā)生變化,最終導致了醬醅中游離氨基酸含量的差異。

圖2 不同溫度豆瓣醬發(fā)酵過程中游離氨基酸的變化Fig.2 Changes of free amino acids during broad bean paste fermentation at different temperatures

2.2.2 溫度對醬醅揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及含量的影響

測定了自然發(fā)酵組、30 ℃發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組所得醬醅的風味物質(zhì)種類及含量。如圖3-A所示,在40 ℃發(fā)酵組醬醅中共檢出57種揮發(fā)性風味物質(zhì),略多于自然發(fā)酵組(55種)和30 ℃發(fā)酵組(56種)。其中,恒溫發(fā)酵組的酯類和醛類物質(zhì)多于自然發(fā)酵組,而醇類種類更少。如圖3-B所示,40 ℃發(fā)酵組醬醅的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量為25.65 mg/kg,顯著高于自然發(fā)酵組(16.74 mg/kg)和30 ℃發(fā)酵組(20.14 mg/kg)。其中,40 ℃發(fā)酵組(9.68、7.34、2.60 mg/kg)和30 ℃發(fā)酵組(10.47、3.10、1.79 mg/kg)的醇類、醛類和酯類物質(zhì)含量顯著高于自然發(fā)酵組(8.73、0.78、0.69 mg/kg),而其酮類物質(zhì)(1.03、1.39 mg/kg)含量低于自然發(fā)酵組(2.68 mg/kg)。醇類通常呈現(xiàn)出宜人的香氣和甜味,是酯化反應的前體且可進一步氧化成醛類和酸類等[20],而酯類不僅可以賦予產(chǎn)品特殊的酯味,還可以掩蓋游離氨基脂肪酸所引起的不愉悅味道[21]。恒溫發(fā)酵過程中,醬醅所處溫度較高,其微生物代謝活動較為旺盛,因此產(chǎn)生了更多的揮發(fā)性風味物質(zhì)[22]。

2.2.3 醬醅風味品評

對自然發(fā)酵組、30 ℃發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組所得醬醅進行風味品評。如圖3-C所示,40 ℃發(fā)酵組有強烈的醬香(7分)和焙烤香(8分),顯著高于自然發(fā)酵組(3分、1分)和30 ℃發(fā)酵組(4.5分、4分)。30 ℃發(fā)酵組的果香和醇香評分(7分和6分)最高,然而其同時具有較高的刺激性氣味。上述結(jié)果表明,溫度對豆瓣醬風味形成有顯著影響。恒溫發(fā)酵能有效提升豆瓣醬中果香、醇香和醬香,賦予豆瓣醬一定的焙烤香氣,但是同時會提升刺激性氣味的形成。

2.3 溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程中生物胺含量的影響

生物胺是微生物以氨基酸為前體合成的含氮低分子量有機堿,是一種機體必須的內(nèi)源性組分。但是,過量生物胺的攝入也會造成食物中毒[23]。因此,考察了溫度對豆瓣醬生物胺含量的影響。如圖4所示,在3組豆瓣醬樣品中共檢測出8種生物胺(腐胺、苯乙胺、組胺、酪胺、精胺、亞精胺、色胺和尸胺),其中腐胺和苯乙胺含量顯著高于其他6種生物胺(P<0.01)。40 ℃發(fā)酵組總生物胺濃度在第28天達到最高(76.91 mg/100 g),顯著高于自然發(fā)酵組和30 ℃發(fā)酵組樣品總胺最高含量(53.09、55.41 mg/100 g)。發(fā)酵結(jié)束后,40 ℃發(fā)酵組樣品的總生物胺濃度為54.10 mg/100 g,依舊高于其他2組(45.22、43.52 mg/100 g)。除尸胺、精胺和亞精胺外,2個恒溫發(fā)酵組樣品的生物胺含量均高于自然發(fā)酵組。上述結(jié)果表明,溫度的提升促進了醬醅中生物胺的形成。

2.4 溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過擴增子測序揭示了不同溫度對豆瓣醬發(fā)酵過程中細菌和真菌群落多樣性及其組成的影響。如圖5-A所示,豆瓣醬中細菌群落的豐富度Chao1指數(shù)在自然發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組中先降后升,在30 ℃發(fā)酵組中先升后降。細菌群落的Shannon指數(shù)在3個發(fā)酵組中均呈下降趨勢。恒溫發(fā)酵組的細菌群落豐富度和多樣性均低于自然發(fā)酵組,可能是由于恒溫條件無法滿足各種細菌的溫度要求,對細菌生長有較大影響。3個發(fā)酵組的真菌群落豐富度和多樣性無明顯差別,且在發(fā)酵過程中無明顯變化,表明溫度對豆瓣醬真菌群落多樣性影響較小。

進一步從屬水平分析了3個發(fā)酵組中微生物群落結(jié)構(gòu)組成。圖6為3個發(fā)酵組中相對豐度>0.5%的細菌和真菌群落組成。在所有樣品細菌群落中,Bacillus屬和Staphylococcus屬均占據(jù)優(yōu)勢地位。除自然發(fā)酵組發(fā)酵第7天樣品外,其余醬醅樣品中Bacillus屬和Staphylococcus屬占細菌總數(shù)的相對豐度均>80%,且隨發(fā)酵溫度的升高持續(xù)上升。在40 ℃發(fā)酵組第49天樣品中上述兩屬的相對豐度綜合高達97.10%。40 ℃發(fā)酵組在發(fā)酵過程中Bacillus屬的相對豐度從35.88%上升到89.80%,而Staphylococcus屬的相對豐度從51.35%下降到7.30%。30 ℃發(fā)酵組中Bacillus屬的相對豐度先升后降,而Staphylococcus屬的相對豐度先降后升。與恒溫發(fā)酵組相比,自然發(fā)酵組中Staphylococcus屬的相對豐度始終低于Bacillus屬,可能是由于在30 ℃下Bacillus屬比Staphylococcus屬有更好的生長能力。此外,在3個組中均發(fā)現(xiàn)了Klebsiella屬和Salmonella屬微生物,但是其相對豐度隨發(fā)酵溫度的升高明顯降低。由于Klebsiella屬和Salmonella屬均為食源性致病菌,提高溫度進行發(fā)酵能有效抑制上述微生物屬在豆瓣醬中的生長,因此更有利于食品安全。分析了3個組的真菌群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)所有樣品中主導真菌均為Aspergillus屬,其余真菌屬所占相對豐度極低。

A-細菌Chao1;B-細菌Shannon;C-真菌Chao1;D-真菌Shannon圖5 不同溫度發(fā)酵過程中細菌和真菌的豐富度和多樣性變化Fig.5 Changes in the evenness and diversity of bacteria and fungi during fermentation at different temperatures

A-細菌;B-真菌群落圖6 不同溫度發(fā)酵過程中細菌和真菌群落的相對豐度變化Fig.6 Changes of the relative abundance of bacterial and fungal communities during fermentation at different temperatures

2.5 豆瓣醬微生物與理化指標和風味物質(zhì)之間的相關性分析

為揭示豆瓣醬微生物群落對醬醅理化指標和風味物質(zhì)形成的影響,分析了豆瓣醬主要微生物屬與相應物質(zhì)間的相關性。如圖7所示,Pantoea屬與所有物質(zhì)間呈顯著負相關,而Aspergillus屬與總酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)和生物胺含量呈負相關。Bacillus屬與總酸、揮發(fā)性風味物質(zhì)和生物胺含量呈正相關,而Staphylococcus屬與氨基酸態(tài)氮、還原糖、總酸、游離氨基酸和生物胺含量均呈正相關。Bacillus屬在豆瓣醬發(fā)酵過程中促進游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成,也是生物胺累積的主要微生物[24],而Staphylococcus屬能促進氨基酸和酸性物質(zhì)的產(chǎn)生[25]。溫度升高使得豆瓣醬中Bacillus屬和Staphylococcus屬的相對豐度大幅提高,使得恒溫發(fā)酵組中總酸、生物胺和揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量高于自然發(fā)酵組。

圖7 豆瓣醬中重要微生物屬與理化指標和風味 物質(zhì)之間的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between key microbial genera and physicochemical parameters and flavor compounds in broad bean paste

3 結(jié)論

和自然發(fā)酵組相比,30 ℃發(fā)酵組和40 ℃發(fā)酵組有利于發(fā)酵前中期的氨基酸態(tài)氮和還原糖的積累,同時會促進酸性物質(zhì)的形成。此外,更高的發(fā)酵溫度會產(chǎn)生更高濃度的游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì),但同時會積累更多生物胺。溫度的升高對細菌群落結(jié)構(gòu)影響較大,而對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小。上述結(jié)果說明提高發(fā)酵溫度可以加快豆瓣醬發(fā)酵進程,但是同樣也導致部分不利結(jié)果,因此后續(xù)需進一步考察溫度的變化對豆瓣醬發(fā)酵的影響。