Expi293F表達重組鱟C因子用于熒光法內(nèi)毒素檢測

柯文鋒,李詩潔,鄭夢林,白仲虎,楊艷坤*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 3(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心,江蘇 無錫,214122)

細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁裂解后釋放的毒素,又稱之為“熱原”,其主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),極微量(1～5 ng/kg體重)進入人體內(nèi)后可導(dǎo)致炎癥、休克、敗血癥、多器官功能衰竭甚至死亡[1]。因其普遍存在環(huán)境中且難以滅活[2],所以高靈敏度的內(nèi)毒素檢測方法是開發(fā)生物制藥產(chǎn)品的關(guān)鍵。自20世紀80年代初以來,鱟試劑已廣泛用于制藥工業(yè)中細菌內(nèi)毒素的檢測。它的檢測原理是鱟試劑中的C因子與內(nèi)毒素特異性結(jié)合,啟動級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致凝固素凝膠的形成,通過光度測定法檢測[3]。鱟試劑具有簡單、快速、靈敏度高等特點[4]。但鱟試劑只能通過收集鱟血淋巴生產(chǎn),以及近年來的海洋環(huán)境惡化、人類肆意捕食[5],導(dǎo)致鱟資源急劇減少,直接從鱟活體分離鱟試劑已經(jīng)受到了很大的限制[6]。

于是人們開發(fā)出不依靠鱟淋巴的新一代檢測內(nèi)毒素的試劑盒——基因重組熒光法[7],采用基因重組技術(shù),在真核細胞表達重組C因子(recombinant factor C,rfc)。C因子是一種絲氨酸蛋白酶原,具有雙鏈結(jié)構(gòu)(圖1),內(nèi)毒素與其重鏈結(jié)合,使輕鏈發(fā)生自剪切[8],從而特異性切割熒光底物。與內(nèi)毒素結(jié)合之后由無活性的蛋白酶原轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白酶[9],識別并催化下游熒光底物產(chǎn)生熒光信號,熒光信號的強度和內(nèi)毒素濃度成正相關(guān),從而定量檢測內(nèi)毒素[10]?；蚬こ讨苽渚哂辛己玫那熬?。但由于表達過程中非常容易引入外源LPS,而鱟C因子又對環(huán)境中的內(nèi)毒素極其敏感,這就大大降低了表達出的天然C因子的活性?？刂票磉_環(huán)節(jié)的內(nèi)毒素難度大,成本高,導(dǎo)致目前市面上商業(yè)化售賣的重組熒光法試劑盒價格非常昂貴,因此構(gòu)建有效的rfc重組表達體系十分必要。

圖1 C因子的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of factor C

因此本課題組克隆了來源于東方鱟(Tachypleustridentatus)中C因子的全基因序列[11],首次在人胚胎腎臟細胞Expi293F中進行了重組表達。經(jīng)檢測,rfc在胞外可溶分泌表達,大小與預(yù)測一致,初始純度為48%,經(jīng)鎳柱純化后的rfc純度達到98%,得率為56%,相比于SF9細胞,蛋白表達量(19.81 mg/L)提高了113%,大大降低了表達成本。具有與內(nèi)毒素結(jié)合并切割熒光底物的生物學(xué)活性。這一表達體系將為重組法試劑盒的開發(fā)提供一條嶄新的途徑,為內(nèi)毒素檢測做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) JM108、Expi293F,ThermoFisher;pcDNA3.4為實驗室保存。

1.1.1 主要試劑

無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖純化試劑盒,康為世紀公司;DNA限制性內(nèi)切酶、Primer STAR Max DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶,Takara公司;MultiF Seamless Assembly Mix,ABclonal公司;蛋白上樣緩沖液Loading Buffer、蛋白電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、蛋白Marker、蛋白膠試劑盒、HRP顯色液,翌生生物公司;HRP標記6×His標簽的單克隆抗體、Flag(DYDKKKK)標簽的多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗,三鷹生物;蛋白純化柱(HisTrap excel),cytiva公司;超濾管,Millipore公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒,碧云天生物公司;重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒,Lonza公司;內(nèi)毒素標準品、無內(nèi)毒素檢查用水,廈門鱟試劑實驗廠有限公司;Expifectamine 293轉(zhuǎn)染試劑、Expi293TM表達培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基Expifectamine Transfection Enhancer 1和Transfection Enhancer 2、Opti-Mem無血清培養(yǎng)基,ThermoFisher公司;其余常見試劑均購自國藥集團。

1.1.2 培養(yǎng)基

2×YT液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,自然pH;

2×YT固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,瓊脂粉15,自然pH。

1.2 實驗方法

1.2.1 rfc基因的克隆與載體的構(gòu)建

根據(jù)Uniprot網(wǎng)站(https://beta.uniprot.org/uniprotkb/P28175/entry)注釋的rfc的信號肽氨基酸序列,為rfc的前25個氨基酸(MVLASFLVSGLVLGILAQQMRPVQS),猜測此信號肽會影響C因子在Expi293F細胞中的分泌,故使用實驗室保存的信號肽序列替換掉原始信號肽。使用表1中的引物rfcF和rfcR,以合成的人源密碼子優(yōu)化后的質(zhì)粒pTT5-rfc為模板,用高保真DNA聚合酶Primer STAR進行PCR擴增。擴增程序為:98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)35次;72 ℃延伸5 min,擴增后的產(chǎn)物通過瓊脂糖核酸電泳檢測,并通過膠回收試劑盒純化回收,獲得不帶信號肽的rfc片段;以實驗室保存的pcDNA3.4載體(含信號肽序列:MGWSCIILFLVATATGVHS)為模板,rfcXF和rfcXR為引物,進行PCR擴增,延伸時間為1 min,其他程序與上述程序一致,擴增后的產(chǎn)物通過瓊脂糖核酸電泳檢測,并通過膠回收試劑盒純化回收,獲得具有與rfc片段兩端有共同20 bp的同源臂的線性化載體。將rfc片段與線性化的載體pcDNA3.4用同源重組酶重組,重組體系為:3 μL片段+2 μL載體+5 μL ABI克隆酶,50 ℃保溫40 min。將重組產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至JM108感受態(tài)細胞中,涂板至含有氨芐青霉素的2×YT固體平板,挑取6個轉(zhuǎn)化子為模板,以rfcJF和rfcJR為引物,用TaqDNA聚合酶進行菌落PCR初步驗證,挑選2個核酸電泳檢測為陽性的轉(zhuǎn)化子,送金唯智公司進行測序,測序正確的菌株轉(zhuǎn)接到2×YT液體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)過夜培養(yǎng),按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒,得到重組質(zhì)粒pcDNA3.4-rfc。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染表達rfc

傳代培養(yǎng)并擴增Expi293F細胞,直至細胞密度達到約3～5×106個活細胞/mL,然后轉(zhuǎn)染前1 d將Expi293F細胞接種至2.5～3×106個活細胞每毫升的最終密度,讓細胞過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當天測定活細胞密度和存活率,活細胞密度和活細胞百分比應(yīng)分別為4.5～5.5×106個和≥95%。然后進行轉(zhuǎn)染,將37 ℃溫育后的Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋質(zhì)粒DNA(1.0 μg/mL細胞體積)與轉(zhuǎn)染試劑Expifectamine 293,室溫孵育5 min,向稀釋后的質(zhì)粒DNA中加入稀釋后的Expifectamine 293試劑,然后通過旋轉(zhuǎn)或倒置混合,室溫下孵育復(fù)合物10～20 min,將復(fù)合物緩慢轉(zhuǎn)移到細胞中,在添加過程中輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,然后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),8% CO2,120 r/min,37 ℃,轉(zhuǎn)染18～22 h后添加Transfection Enhancer 1和Transfection Enhancer 2,繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.2.3 重組rfc的鑒定與純化

發(fā)酵7 d后將細胞培養(yǎng)液以2 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液分別進行還原條件下和非還原條件下的SDS-PAGE,然后做Western Blot(WB)檢測,重鏈檢測一抗為抗Flag標簽(DYKDDDK)兔單克隆抗體,二抗為HRP標記的羊抗兔抗體,輕鏈檢測為HRP標記的抗6×His標簽多克隆抗體。純化采用鎳離子親和層析柱,先用平衡緩沖液平衡5個柱體積(column volume,CV),樣品過柱后,用含有20 mmol/L咪唑的洗雜緩沖液沖洗3 CV的雜蛋白,然后用含有500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。最后用粒徑為30 kDa的超濾管除鹽,用不含咪唑的平衡緩沖液反復(fù)稀釋離心,直至咪唑終濃度小于5 mmol/L。

1.2.4 蛋白含量的測定

蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定,按照說明書步驟配好工作液,加入不同濃度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)標準品,37 ℃放置30 min,在A562nm下測定吸光值,繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算出純化后的蛋白濃度。

1.2.5 去除內(nèi)毒素

按照內(nèi)毒素去除柱說明書步驟操作,1%(質(zhì)量分數(shù))的脫氧膽酸鈉溶液清洗5個柱體積后,用無內(nèi)毒素檢查用水清洗3個柱體積后,將樣品過柱,待流出一個柱體積的液體后,收集蛋白,-20 ℃保存蛋白。

1.2.6 熒光法檢測rfc活性

利用動態(tài)熒光法檢測rfc的活性。首先按照細菌內(nèi)毒素標準品說明書,將內(nèi)毒素稀釋為1 EU/mL,在96孔板中每孔加入100 μL內(nèi)毒素(0.5 EU/mL)、50 μL試劑盒中的熒光底物,3個復(fù)孔,再分別加入50 μL純化后的rfc、50 μL試劑盒中的C因子(陽性對照),50 μL Expi293F細胞培養(yǎng)上清液(陰性對照)。設(shè)置熒光酶標儀孵育溫度37 ℃,激發(fā)波長360 nm,發(fā)射波長460 nm,分別記錄初始時的熒光值與1 h后的熒光值,并計算相對熒光差值(relative fluorescence units,ΔRFU)。

1.2.7 熒光法檢測rfc結(jié)合內(nèi)毒素

將內(nèi)毒素標準品配制為0.25、0.5、1、2、4、10 EU/mL,在96孔板中每孔加入內(nèi)毒素標準品100 μL(每個濃度3個復(fù)孔)、50 μL純化后的rfc、50 μL熒光底物,陰性對照孔為100 μL的無熱原水,按照上述程序記錄初始與1 h后的熒光值并計算ΔRFU。

2 結(jié)果與分析

2.1 Expi293F細胞表達載體的構(gòu)建

pcDNA-3.4-rfc質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后(圖2),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM108感受態(tài)細胞中,挑取陽性菌落進行菌落PCR驗證以及測序正確后,接種到液體培養(yǎng)基2×YT中,37 ℃過夜培養(yǎng),按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書步驟抽提質(zhì)粒。

a-pcDNA3.4-rfc質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析; b-pcDNA3.4-rfc載體圖譜圖2 rfc基因的克隆與載體的構(gòu)建Fig.2 Cloning and vector construction of rfc

2.2 rfc的表達與純化

將抽提的質(zhì)粒pcDNA-3.4-rfc利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至50 mL懸浮細胞Expi293F中,7 d后離心收獲培養(yǎng)上清液,WB檢測蛋白表達情況。WB結(jié)果如圖3 所示,培養(yǎng)上清液中的rfc在非還原性條件下,大小為預(yù)測全長128 kDa,在還原條件下,rfc因其蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)含鏈間二硫鍵而斷開,蛋白重鏈帶Flag標簽,WB檢測與預(yù)測大小80 kDa一致(圖3-a),蛋白輕鏈帶6×His標簽,WB檢測與預(yù)測大小48 kDa一致(圖3-b),故Expi293F成功表達出結(jié)構(gòu)正確、大小一致的可溶性雙鏈C因子。

SDS-PAGE分析重組表達的rfc上清原液,如圖4-a所示,條帶用Image J軟件進行灰度值分析,原液純度約為48%。將離心后的上清溶液利用鎳柱親和層析法純化rfc,SDS-PAGE分析純化后的蛋白。結(jié)果顯示如圖4-b,得到1 mL純度大于98%的rfc,純化得率約為56%。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒法測得蛋白質(zhì)量濃度為959 μg/mL,即在每L Expi293F細胞培養(yǎng)液中可得到重組蛋白rfc 19.18 mg。

a-細胞培養(yǎng)上清液的Western Blot檢測(Flag標簽); b-細胞培養(yǎng)上清液的Western Blot檢測(His標簽)圖3 Expi293F細胞中rfc的Western Blot檢測Fig.3 Western Blot detection of rfc expression in Expi293F cells注:M-蛋白標準分子質(zhì)量Marker;1-非還原性loading buffer處理的 細胞培養(yǎng)上清液;2-還原性loading buffer處理的細胞培養(yǎng)上清液; 3-非還原性loading buffer處理的細胞培養(yǎng)上清液; 4-還原性loading buffer處理的細胞培養(yǎng)上清液。

2.3 rfc結(jié)合內(nèi)毒素及切割熒光底物活性

用表達純化后的rfc替代重組熒光檢測內(nèi)毒素試劑盒中的C因子,在外加0.5 EU/mL內(nèi)毒素以及熒光底物后,37 ℃孵育1 h,激發(fā)360 nm,發(fā)射460 nm檢測初始熒光與結(jié)束熒光值,計算相對熒光差值。結(jié)果如圖5所示,Expi293F重組表達的rfc被內(nèi)毒素激活,與熒光底物反應(yīng),1 h后的相對熒光差值比Lonza試劑盒中的rfc高了4倍以上。

但與不同濃度內(nèi)毒素(0.25、0.5、1、2、4、10 EU/mL)反應(yīng)時,結(jié)果卻顯示熒光差值不與內(nèi)毒素濃度成線性關(guān)系(圖6),在不外加內(nèi)毒素的情況下,仍與熒光底物反應(yīng),推測是表達過程和純化過程引入的內(nèi)毒素使得rfc全部被提前激活,而不存在酶原形式的rfc。將純化后的rfc經(jīng)過內(nèi)毒素去除柱后,蛋白經(jīng)檢測全部掛在柱子上,流穿液中無rfc蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。因內(nèi)毒素去除柱的原理是利用介質(zhì)多聚賴氨酸吸附內(nèi)毒素,而不直接吸附蛋白,但rfc被吸附在去除柱上則證明內(nèi)毒素與rfc以特異性親和力連接著,一旦結(jié)合,后期極難分開,故后續(xù)需在GMP條件或者GLP下進行rfc的表達與純化制備。

a-細胞培養(yǎng)上清液的SDS-PAGE檢測;b-純化后的SDS-PAGE檢測圖4 rfc的表達與純化Fig.4 Expression and purification of rfc注:M-蛋白標準分子質(zhì)量Marker;1-非還原性loading buffer處理的 細胞培養(yǎng)上清液;2-非還原性loading buffer處理純化后的rfc。

圖5 rfc結(jié)合內(nèi)毒素切割熒光底物Fig.5 rfc combined with endotoxin to cut fluorescent substrate注:*代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

圖6 rfc外加不同濃度內(nèi)毒素的熒光反應(yīng)Fig.6 Fluorescence reaction of rfc with different concentrations of endotoxin注:ns代表差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

細菌內(nèi)毒素能引起人體許多疾病,甚至死亡。開發(fā)靈敏度高、特異性強的內(nèi)毒素檢測試劑盒對制藥行業(yè)至關(guān)重要。傳統(tǒng)鱟試劑法依賴鱟血淋巴細胞,而因為環(huán)境的惡化以及人類的肆意捕食,導(dǎo)致鱟的數(shù)量急劇下降[12]。2021年2月5日,中國鱟及圓尾鱟正式被列為國家二級保護動物,所以鱟試劑來源將會受到極大限制。其次鱟試劑法中的G因子會受到(1-3)β-D-葡聚糖激活從而干擾原級聯(lián)反應(yīng)[13],導(dǎo)致假陽性的可能。于是人們開發(fā)出重組熒光法,利用分子生物學(xué)工具克隆出了C因子,重組表達的rfc以高親和力結(jié)合內(nèi)毒素,激活后的rfc特異性切割熒光底物,根據(jù)標準曲線計算內(nèi)毒素濃度,該方法具有更少的假陽性、靈敏度更高、檢測范圍更廣等特點[14]。但重組C因子法的應(yīng)用卻進展緩慢,2020年重組 C因子法才被載入歐洲藥典、日本藥典、美國藥典及中國藥典,研究人員自1995年以來,已嘗試在哺乳動物細胞[15]、酵母[16]、昆蟲[17-18]等多種表達系統(tǒng)中表達,一直未獲得具有高表達量和完整功能的rfc。目前只有瑞士制藥公司Lonza以及國內(nèi)蘇州瑞安公司開發(fā)出重組表達rfc體系,但其價格昂貴,因為鱟C因子對痕量內(nèi)毒素非常敏感,所以在表達過程以及純化過程中內(nèi)毒素的控制至關(guān)重要,此外鱟C因子結(jié)合內(nèi)毒素后自剪切機制尚不清楚[19-20],這也是后續(xù)研究需要注意的地方。在此之前本團隊也曾在大腸桿菌BL21(DE3)、畢赤酵母GS115、谷氨酸棒桿菌BZH001中重組表達東方鱟來源的C因子,但遺憾的是,鱟C因子未在大腸桿菌、畢赤酵母、谷氨酸棒桿菌中進行表達,猜測是由于鱟C因子是具有雙鏈結(jié)構(gòu)[21]、多個糖基化位點的大分子蛋白,所以在原核生物以及低等真核生物中無法表達。

本研究首次在人胚胎腎臟細胞Expi293F中成功重組表達rfc,結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)模型一致,具有與內(nèi)毒素結(jié)合并切割熒光底物的生物學(xué)活性,比Lonza試劑盒中的rfc具有更高的切割熒光底物的能力。且相比于DING在昆蟲細胞SF9中的表達量(9 mg/L)[16],此表達體系的蛋白表達量(19.81 mg/L)提高了113%。本研究所用細胞為Expi293F,相比于未改造馴化的HEK293來說,表現(xiàn)出更快速的細胞生長、更高的培養(yǎng)存活率以及較高的蛋白表達水平。本研究中的表達純化體系在實驗室階段的成本粗略計算約平均每個檢測成本為6.25元(主要為合成培養(yǎng)基價格非常昂貴,工業(yè)規(guī)模成本則會更低),遠低于Lonza試劑盒(單個檢測成本41.6元)以及瑞安試劑盒(單個檢測成本10.4元)的成本。由于其本底內(nèi)毒素含量過高,導(dǎo)致大部分rfc提前激活,而表現(xiàn)為相對熒光差值與外加內(nèi)毒素含量不成線性關(guān)系,在蛋白經(jīng)過內(nèi)毒素去除柱后,內(nèi)毒素與吸附柱上的多黏菌素B結(jié)合,而又因為絕大部分的rfc與內(nèi)毒素緊緊結(jié)合,導(dǎo)致大部分蛋白也結(jié)合在吸附柱上。所以rfc與LPS結(jié)合是不可逆的,一旦結(jié)合,后期無法去除,因此在生產(chǎn)的過程中需要完全避開內(nèi)毒素。此方法對于后續(xù)開發(fā)低成本rfc重組表達體系以及內(nèi)毒素檢測試劑盒具有重要指導(dǎo)意義。