虧缺灌溉對河套灌區(qū)向日葵土壤微生物群落結構多樣性的影響

趙莎,李為萍,馮梁,池曌男,張家鵬,吳怡萱,王佳爽

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學水利與土木建筑工程學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

河套灌區(qū)是中國重要的糧油生產(chǎn)基地,近年來灌區(qū)引黃水量減少及不合理的灌溉制度導致農(nóng)業(yè)用水緊張、地下水位上升,土壤鹽漬化加劇[1-2]、土壤微生物菌群結構失衡[3]等問題突出,嚴重破壞了灌區(qū)土壤微環(huán)境.因此大力發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè),保障灌區(qū)農(nóng)田水土環(huán)境和生態(tài)環(huán)境健康是灌區(qū)發(fā)展的首要任務[4-5].土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要且最為活躍的肥力因子之一,是土壤養(yǎng)分轉化和有機物分解過程的重要參與者,可反映土壤的質量和健康狀況[6-7].灌溉作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可人為調控且對土壤環(huán)境影響最為深刻的農(nóng)業(yè)措施之一[8],土壤水分條件的變化會影響土壤微生物活性及生態(tài)系統(tǒng)的功能[9],因此從微生物的角度制定適宜的灌水制度,對于改善土壤生態(tài)環(huán)境具有重要意義.

以往學者們多從節(jié)水控鹽效果、作物生長產(chǎn)量及水分利用效率[10-11]等角度評價節(jié)水灌溉的效果及意義,而將節(jié)水灌溉與土壤微生物相結合,探討虧缺灌溉下作物全生育期土壤微生物群落的動態(tài)變化規(guī)律及影響機理還缺乏系統(tǒng)的研究.目前研究微生物的方法多采用稀釋平板涂布法培養(yǎng)微生物,但這種方法測定的微生物豐度不到總體的10%,而高通量測序具有低成本、高通量、高精確度的優(yōu)點,能夠獲得更為全面的物種結構[12].

為此,文中基于高通量測序技術,分析虧缺灌溉下向日葵土壤微生物群落結構的季節(jié)性變化,探討土壤微生物群落結構及多樣性與理化性質的內(nèi)在聯(lián)系,為河套灌區(qū)發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)、改善土壤微環(huán)境提供理論支撐,從而保護農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)、促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展.

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020年5—9月在位于河套灌區(qū)的巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學研究院的試驗田(107°16′E,38°52′N)進行.試驗區(qū)屬溫帶大陸性季風氣候,年均日照時數(shù)為3 223 h,年均蒸發(fā)量為1 937.9 mm,年均降水量為138.8 mm且多集中在7—8月份,平均無霜期約為130 d.

2020年試驗區(qū)作物生育期內(nèi)(5—9月份)總降雨量為202.4 mm.試驗地0～20 cm土壤質地為粉砂壤土,平均容重為1.55 g/cm3,平均全鹽量為6.58 g/kg,pH為8.5.土壤表層基礎肥力為有機質質量比為10.19 g/kg,水解性氮質量比為53.27 mg/kg,速效磷質量比為10.29 mg/kg,速效鉀質量比為155.2 mg/kg.

1.2 試驗設計

供試作物為食用向日葵(HZ2399).試驗設置3個灌水水平,以當?shù)毓嗨繛閷φ誄K(春灌水240 mm,現(xiàn)蕾期灌水90 mm),設置輕度水分虧缺W1(春灌水量120 mm,現(xiàn)蕾期灌水90 mm)和重度水分虧缺W2(春灌水量120 mm,現(xiàn)蕾期不灌水).各處理施氮量相同,底肥均施用磷酸二胺(含氮量18%),追肥施用尿素(含氮量46%).

2次灌水時間分別為5月10日和7月15日,采用黃河水畦灌,水表控制灌水量.表1為試驗設計表,m為灌水定額、N為灌水次數(shù)、M為灌溉定額、FN為施氮量.

表1 試驗設計表

試驗小區(qū)面積為24 m×6 m,小區(qū)四周布設1 m深塑料薄膜,以防水鹽及養(yǎng)分側滲.試驗采用完全隨機區(qū)組設計,每個處理3次重復,共計9個小區(qū).向日葵播種日期為 5 月 28日,寬窄行種植模式,寬行距1.0 m,窄行距0.4 m,株距0.55 m,種植密度約為25 000株/hm2.向日葵采用人工覆膜點播的方式種植,其他田間管理措施同當?shù)胤N植習慣.

1.3 測定指標及方法

在向日葵苗期(播種后30 d)、現(xiàn)蕾期灌水1周后(播種后50 d)、開花期(播種后70 d)及成熟期(播種后105 d),采用五點取樣法對0～20 cm深度土壤進行取樣,每個小區(qū)重復3次.同小區(qū)樣品混合均勻分為2份,一份裝入無菌自封袋并置于-80 ℃下保存用于微生物測定,另一份土樣室內(nèi)自然風干,研磨后過2 mm篩,用于測定土壤理化性質.

土壤質量含水率采用烘干法測定;采用電導率儀(DDS-307A,上海雷磁)和pH 計(梅特勒-托利多儀器,上海)測定土水質量比為1∶5的土壤浸提液的電導率(EC)及酸堿度(pH);土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮質量比采用 2 mol/L的KCl溶液浸提土樣后(土∶溶液=1∶5),采用紫外分光光度計進行測定;土壤溫度采用智能多點土壤溫濕度記錄儀(YM-01)進行定位監(jiān)測,傳感器埋設在20 cm土層深度處,每日0:00—24:00每間隔1 h采集一次溫度,將24個土壤溫度數(shù)據(jù)的平均值作為有效土壤日平均溫度.

從采集的土樣中稱取0.4 g鮮土樣,使用DNA抽提試劑盒 (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)對土壤總DNA進行提取,用NanoDrop2000紫外分光光度計測定DNA純度和濃度.使用引物序列338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 擴增細菌16S rRNA基因,使用引物序列 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS1基因.PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,用Axygen凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,使用QuantiFluor對回收產(chǎn)物進行定量,每個樣品按照比例1∶1等量混合用于后續(xù)上機測序,土壤微生物的測定委托上海派森諾生物科技有限公司完成.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 26.0進行方差分析和差異顯著性檢驗,Orgin 2021繪圖,Mothur軟件計算Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù),R4.1.0軟件的ggplot2,dplyr和ggcor等包進行Pearson相關性分析及冗余分析(RDA).

2 試驗結果與分析

2.1 虧缺灌溉對土壤理化性質的影響

不同處理向日葵各生育期土壤理化性質如表2所示,SOM為質量含水率、EC為電導率、pH為酸堿度、Temp為溫度,τm為質量比.與CK相比,處理W1和W2各生育期土壤質量含水率分別平均降低了1.09%和2.55%,土壤pH值分別平均降低了0.13和0.16,土壤溫度分別平均提高了1.44和1.78 ℃,EC分別平均提高了0.75,2.11 mS/cm;W1各生育期土壤硝態(tài)氮質量比平均提高了14.2%.與W2相比,處理W1和CK顯著提高了從苗期到開花期土壤的銨態(tài)氮質量比,顯著降低了各生育期土壤EC(P<0.05).

表2 不同處理向日葵生育期土壤理化指標

隨著向日葵生育期的推進,各處理pH 不斷升高,溫度、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮質量比呈先升高后降低的趨勢.處理W1與CK的質量含水率在現(xiàn)蕾期升高后不斷降低,土壤EC在現(xiàn)蕾期降低后不斷升高.

2.2 虧缺灌溉對土壤微生物多樣性的影響

虧缺灌溉下向日葵各生育期土壤微生物的α多樣性如圖1所示.ASV數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)等各項指標分別表示微生物的物種數(shù)量、群落豐富度及多樣性.就細菌而言,苗期W1,W2與CK相比,Chao1指數(shù)顯著增加了8.1%和6.2%.現(xiàn)蕾期W1與CK相比,ASV數(shù)量和Chao1指數(shù)分別增加了12.8%(P<0.05)和4.1%.開花期W1與CK相比,ASV數(shù)量顯著增加了18.8%.成熟期W1與CK和W2相比,ASV數(shù)量顯著增加了14.3%和21.6%(P<0.05).向日葵全生育期W1處理的Shannon 指數(shù)最高,但各處理間差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05).

注:ns表示P>0.05不顯著,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P< 0.001

就真菌而言,在向日葵的各生育階段,W1與CK和W2相比,ASV數(shù)量顯著增加了21.7%～82.1%和13.8%～28.9%,Shannon指數(shù)顯著增加了44.8%～121.2%和23.4%～107.2%(P<0.05),Chao1指數(shù)增加了21.9%～92.8%和4.8%～29.9%.W2的細菌多樣性低于CK,但其真菌多樣性高于CK,這表明真菌較細菌對于水分虧缺的耐受性更強.隨著向日葵生育期的推進,微生物的多樣性及豐富度整體上呈先升高后降低的趨勢,現(xiàn)蕾期或開花期時達到峰值.

2.3 虧缺灌溉對土壤微生物群落結構的影響

虧缺灌溉下向日葵各生育期門水平土壤微生物群落組成及相對豐度RA如圖2所示.微生物統(tǒng)計分析時,將平均相對豐度大于5%的菌門視為優(yōu)勢菌門.

圖2 各處理不同生育期細菌、真菌門水平物種組成

細菌門水平的優(yōu)勢菌門包括變形菌門(26.36%～35.54%)、放線菌門(20.27%～30.98%)、綠彎菌門(11.28%～16.42%)、酸桿菌門(5.78%～12.18%).向日葵各生育期中,W1與CK和W2相比,變形菌門分別提高了1.68%～2.72%和3.05%～7.06%,綠彎菌門分別提高了1.88%～4.68%和2.28%～3.65%,酸桿菌門分別提高了1.47%～6.40%和0.51%～2.85%.W2放線菌門的相對豐度與CK和W1相比,分別提高了0.04%～7.56%和5.63%～10.62%.

真菌門水平的優(yōu)勢菌門為子囊菌門(64.17%～98.62%)、被孢霉門(0.26%～9.78%).在向日葵各生育期中,處理CK中子囊菌門的相對豐度較處理W1提高了1.45%～25.39%,較W2提高了2.57%～22.34%,這表明水分虧缺會抑制子囊菌門的生長.其中被孢霉門是W1獨有的優(yōu)勢菌門,在現(xiàn)蕾期和成熟期相對豐度最高,全生育期內(nèi)平均相對豐度較CK和W2提高了4.30%和3.59%.

綜上,輕度水分虧缺提高了土壤細菌中變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門以及真菌中被孢霉門等優(yōu)勢菌群的相對豐度.

2.4 虧缺灌溉下土壤理化性質對微生物的影響

2.4.1 土壤理化性質與微生物多樣性的相關性分析

為揭示影響土壤微生物多樣性的主要因素,將微生物的α多樣性指數(shù)與土壤理化因子進行Pearson相關性分析,如圖3所示.

注:A:細菌Chao1指數(shù);B:細菌Shannon指數(shù);C:細菌ASV數(shù)量;D:真菌Chao1指數(shù);E:真菌Shannon指數(shù);F:真菌ASV數(shù)量;硝態(tài)氮質量比;銨態(tài)氮質量比

就細菌而言,Chao1豐富度與質量含水率、溫度、硝態(tài)氮質量比極顯著相關(P<0.01),Shannon多樣性與pH極顯著相關(P<0.01),ASV數(shù)量與質量含水率、溫度、硝態(tài)氮質量比極顯著相關(P<0.01)、與EC顯著相關(P<0.05).

就真菌而言,Chao1豐富度與溫度和硝態(tài)氮質量比極顯著相關(P<0.01),Shannon多樣性與溫度、硝態(tài)氮質量比顯著相關(P<0.05)、與銨態(tài)氮質量比極顯著相關(P<0.01),ASV數(shù)量與溫度顯著相關(P<0.05).

綜上,含水率、溫度、pH,EC、硝態(tài)氮質量比是影響細菌群落多樣性的關鍵環(huán)境因子,溫度、銨態(tài)氮質量比和硝態(tài)氮質量比是影響真菌群落多樣性的關鍵環(huán)境因子.

2.4.2 土壤理化性質對微生物群落結構的影響

為探究土壤理化性質與微生物群落結構的相關性,將門水平微生物菌群的相對豐度與土壤理化因子進行冗余分析(RDA),結果如圖4所示.冗余分析解釋了細菌和真菌群落47.54%和53.22%的總方差.圖4a表明質量含水率、EC、銨態(tài)氮質量比是影響細菌群落結構分布最主要的理化因子.細菌優(yōu)勢菌門與土壤理化性質的相關性表明:變形菌門與EC和pH呈負相關, 與其他4項因子呈正相關;放線菌門與EC,pH和溫度呈正相關,與含水率、硝態(tài)氮質量比、銨態(tài)氮質量比呈負相關;綠彎菌門與硝態(tài)氮質量比、銨態(tài)氮質量比呈正相關,與其他4項因子呈負相關;酸桿菌門與EC和pH呈正相關關系,與其他4項因子呈負相關.

注:A,B,C,D分別表示苗期、現(xiàn)蕾期、開花期、成熟期;① 變形菌門 ② 放線菌門 ③ 綠彎菌門 ④ 酸桿菌門 ⑤ 芽單胞菌門 ⑥ 厚壁菌門 ⑦ 擬桿菌門 ⑧ 己科河菌門 ⑨ 浮霉菌門 ⑩ 硝化螺旋菌門 壺菌門 子囊菌門 擔子菌門 球囊菌門 被孢霉門

圖4b表明質量含水率、溫度、EC是影響真菌群落結構分布最主要的理化因子,真菌優(yōu)勢菌門土壤理化性質的相關性表明:子囊菌門與EC呈負相關,與其他5項因子呈正相關;被孢霉門與pH和EC呈正相關,與其他4項因子呈負相關.

3 討 論

灌溉是影響農(nóng)田土壤水分狀況的重要因素.水分狀況的改變,一方面會對微生物細胞的滲透性產(chǎn)生直接影響,另一方面會通過改善土壤理化性質而間接對微生物產(chǎn)生影響[13].大量研究表明土壤微生物多樣性與土壤含水率[14]、pH[15]、鹽分[7]、溫度[16]及養(yǎng)分[13]密切相關.文中研究中的Pearson 相關性分析也證實了以上結論,含水率、溫度、pH,EC、硝態(tài)氮是影響細菌群落多樣性的關鍵環(huán)境因子,溫度、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是影響真菌群落多樣性的關鍵環(huán)境因子.文中研究可知輕度水分虧缺提高了土壤微生物多樣性,這是因為適宜的灌水量不僅為微生物的生命活動提供必需的水分,還有效改善了土壤通氣狀況[17],有利于微生物的生長繁殖;重度水分虧缺較正常灌水提高了真菌α多樣性,降低了細菌α多樣性,這表明細菌群落結構對水分的響應較真菌更為敏感,這是由于土壤細菌運動和吸收土壤中營養(yǎng)物質的過程都需要以水分為介質[18].

文中研究中的輕度水分虧缺處理提高了土壤細菌中變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門,真菌中被孢霉門的相對豐度.變形菌門是富營養(yǎng)型厭氧菌,具有固氮作用,環(huán)境適應及抗病能力強[19];綠彎菌門是自養(yǎng)型有益厭氧細菌[20];酸桿菌門適宜生活在酸性環(huán)境中,可以降解植物殘體[7];被孢霉門能夠促進養(yǎng)分轉化循環(huán),保持土壤肥力[21].上述優(yōu)勢菌門的高豐度表明輕度水分虧缺優(yōu)化了土壤菌群結構,有利于土壤中有益菌群的生長.冗余分析表明含水率、EC、銨態(tài)氮是影響細菌群落結構的主要因素,含水率、溫度、EC是影響真菌群落結構的主要因素,大量研究成果也表明土壤優(yōu)勢類群相對豐度會隨溫度[16]、水分[14]和鹽分[7]發(fā)生顯著變化.文中研究中的EC與放線菌門呈正相關關系,表明土壤中鹽分升高會促進放線菌門的生長,究其原因可能是放線菌門具有較強的耐鹽堿性[22],因此在鹽分最高的重度水分虧缺處理中豐度最高.此外,同一處理不同生育期微生物群落結構也存在差異,分析原因可能是隨著生育期的推進,土壤鹽堿度升高,土壤中可被微生物利用的水分及養(yǎng)分不斷減少,導致厭氧型及富營養(yǎng)型微生物不斷減少,耐鹽堿微生物豐度上升,因此土壤微生物的群落結構及豐度也相應發(fā)生變化.

4 結 論

1) 與當?shù)毓嗨?春灌水240 mm,現(xiàn)蕾期灌水90 mm)相比,輕度水分虧缺W1(春灌水120 mm,現(xiàn)蕾期灌水90 mm)各生育期土壤pH值平均降低了0.13,土壤溫度和硝態(tài)氮質量比分別平均提高了1.44 ℃和14.2%,同時提高了土壤微生物多樣性及土壤細菌中變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、真菌中被孢霉門等優(yōu)勢菌門的相對豐度.向日葵生育期內(nèi)各處理土壤微生物多樣性均表現(xiàn)為先上升后降低的趨勢,峰值出現(xiàn)在現(xiàn)蕾期或開花期.

2) 含水率、溫度、pH,EC和硝態(tài)氮質量比是影響細菌多樣性的關鍵環(huán)境因子,溫度、銨態(tài)氮質量比和硝態(tài)氮質量比是影響真菌多樣性的關鍵環(huán)境因子.含水率、EC和銨態(tài)氮質量比是影響細菌群落結構的主要因子,含水率、溫度和EC是影響真菌群落結構的主要因子.

3) 綜合分析,輕度水分虧缺W1改善了土壤理化因子,優(yōu)化了微生物群落結構,提高了微生物多樣性,是適宜微生物生長的水分條件.