枯草芽孢桿菌細(xì)菌素的分離、表達(dá)及穩(wěn)定性分析

于秀菊,張敏愛,胡燕姣,朱芷葳,王海東,楊麗華,范闊海

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,太谷 030801;2.太原海關(guān)技術(shù)中心,太原 030000; 3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801;4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,太谷 030801)

近年來,因抗生素殘留問題導(dǎo)致耐藥菌在衛(wèi)生、食品、養(yǎng)殖等領(lǐng)域不斷出現(xiàn)[1],開發(fā)新型抗生素具有重要的實(shí)際意義。細(xì)菌素是由某些細(xì)菌核糖體合成的一類肽[2],乳酸鏈球菌素(Nisin)是目前研究最深入的細(xì)菌素,其在酸性環(huán)境下有很強(qiáng)的活性,但在中性和堿性環(huán)境時(shí),活性喪失,這個(gè)特征限制了其應(yīng)用[3]。芽孢桿菌細(xì)菌素是繼乳酸菌細(xì)菌素之后的又一大類細(xì)菌素[4],至今被發(fā)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌細(xì)菌素已有幾十種[5],芽孢桿菌細(xì)菌素不僅具有無毒無害、高效抑菌、不易殘留、不易產(chǎn)生耐藥性[6]等特點(diǎn),且與乳酸菌細(xì)菌素相比,其抗菌譜較廣,且具有耐高溫、耐酸堿特性[7-9]。加之不同細(xì)菌素的氨基酸組成、空間構(gòu)象、等電點(diǎn)、疏水親水性存在很大的差異,細(xì)菌素多樣性特征為其在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供了豐富的選擇材料[10]。因此,細(xì)菌素成為最有可能替代抗生素的物質(zhì)之一。

細(xì)菌素是細(xì)菌的天然產(chǎn)物,往往與多種物質(zhì)混合存在,成分復(fù)雜,存在功效不明確、機(jī)制不清楚等問題,從而限制了其應(yīng)用。目前,研究者主要通過鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、吸附法等從培養(yǎng)上清中提取細(xì)菌素粗品,隨后利用層析柱去除粗品中的雜質(zhì),用于SDS-PAGE分析純度,質(zhì)譜分析獲得細(xì)菌素樣品中的全部或部分氨基酸殘基,結(jié)合數(shù)據(jù)庫和分析工具確定生物合成細(xì)菌素的基因簇[11-13]。研究表明,細(xì)菌素的分子量雖小,但其合成需要一簇基因的共同表達(dá)才可完成,還受生長條件等多種因素的影響[14-16]。因此,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)細(xì)菌素是一條高效、低成本的途徑。

羊駝原產(chǎn)于安第斯高原地區(qū)的惡劣環(huán)境下,具有抗寒抗旱、抗病力強(qiáng)且可產(chǎn)生天然單域抗體等優(yōu)良特性[17],這些優(yōu)良特性可能與其腸道特定菌群有關(guān)。面對(duì)當(dāng)前我國全面禁止飼料中添加抗生素的形勢,充分發(fā)揮畜禽種質(zhì)資源優(yōu)勢,積極篩選高產(chǎn)細(xì)菌素的益生菌及其所產(chǎn)細(xì)菌素具有重要的意義。本研究采用牛津杯擴(kuò)散法對(duì)羊駝糞便中的產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌進(jìn)行分離和篩選,通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定,并通過蛋白分離純化和質(zhì)譜分析獲得分離菌株所產(chǎn)細(xì)菌素的氨基酸序列,利用大腸桿菌表達(dá)、KTATMpure純化和活性鑒定獲得具有良好抑菌活性和穩(wěn)定性的重組類細(xì)菌素,以期為細(xì)菌素產(chǎn)品的開發(fā)及其在畜牧養(yǎng)殖、藥物治療等方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 指示菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC(B) 26069、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)CMCC(B) 28001,單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19111,大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、沙門菌(SalmonellaparatyphiA)CMCC(B) 50001保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的篩選和鑒定

在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝繁育基地,隨機(jī)采取10頭羊駝的糞便,按參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行菌的分離,取0.2 g·頭-1用100 mL PBS將其制成懸液,37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后,10倍梯度稀釋,取100 μL懸液涂布于LB平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜,根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色等特征,結(jié)合革蘭染色,挑選菌落并進(jìn)行編號(hào)。劃線進(jìn)化純化,牛津杯擴(kuò)散法測定挑選菌株上清液的抑菌活性。

通過抑菌活性的比較,得到抑菌活性最佳的1株菌,將其送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA 菌種鑒定。運(yùn)用NCBI的BLAST進(jìn)行核苷酸序列的比對(duì),使用Cluster Omega 在線分析軟件,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析目標(biāo)菌株的同源性和菌種歸屬。

1.3 細(xì)菌素的分離純化和質(zhì)譜分析

按照前期研究的方法[18],對(duì)B.subtilisSXAU18的無細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化,獲得細(xì)菌素溶液。步驟如下:1)室溫下,用飽和度為30%～70%的硫酸銨對(duì)上清液進(jìn)行鹽析后,10 000×g、4℃離心20 min,PBS重懸蛋白沉淀;2)將蛋白重懸液與氯仿按照1∶1體積比進(jìn)行混合,震蕩15 min,靜止15 min,4 500×g、4℃離心10 min,收集中間相,真空濃縮儀干燥,PBS重懸氯仿抽提物;3)將抽提后的重懸液通過10 ku和3 ku超濾離心管進(jìn)行分子截留,獲得>10 ku以上、3～10 ku和<3 ku的蛋白液。以金黃色葡萄球菌為指示菌,檢測分離純化過程細(xì)菌素的抑菌活性。蛋白液通過4%～20% SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析,一個(gè)泳道進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,另4個(gè)泳道用0.1% Tween 80清洗3次,30 min·次-1,MilliQ水清洗30 min除去SDS,兩個(gè)泳道的整膠和兩個(gè)泳道的條帶膠放置到LB固體平板上,分別在上層傾倒含有107CFU·mL-1金黃色葡萄球菌或單增李斯特菌的0.75%TSA軟固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜,測定其抑菌活性。

將具有抑菌活性的SDS電泳條帶送至華大基因進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過UltiMate3000 (Dionex)和Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, Millipore, Massachusetts, USA) LC-MS/MS 質(zhì)譜儀系統(tǒng)進(jìn)行蛋白序列分析。獲得序列運(yùn)用Mascot軟件(Matrix Science)進(jìn)行UniProt分析。通過NCBI、APD數(shù)據(jù)庫和ExPASy-ProtParam tool對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析,預(yù)測細(xì)菌素的氨基酸序列。

1.4 重組蛋白的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒的構(gòu)建:根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性,將獲得的細(xì)菌素氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化合成,并設(shè)計(jì)構(gòu)建原核表達(dá)載體的特異性引物,上游和下游引物分別引入HamH I和SalI酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。BLIS SXAU181引物序列為:F:5′-TAACGGGATCCCCGGTGGATAATACCGCCGT-3′,R:5′- TTGATGTCGACTGCCTGCGGATGAATCATAT-3′;BLIS SXAU182引物序列為:F:5′-TAACGGGATCCGTTGATCCGTATATGTTCGC-3′,R:5′-TTGATGTCGACGAAGCTGCAGCTCACCACAT-3′。以優(yōu)化序列質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行膠回收,用HamH I和SalI分別對(duì)膠回收產(chǎn)物和pCold-I表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接反應(yīng),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中,通過含Amp的LB平板培養(yǎng)獲得陽性單克隆,隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行基因測序,將鑒定為陽性的單克隆接種于含有Amp的LB中,培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。

蛋白表達(dá):將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,并通過菌液PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性菌按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接至含Amp的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,同時(shí)設(shè)定對(duì)照組,15 ℃,150 r·min-1,誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集菌體,用PBS重懸菌體,吹打均勻,超聲破碎,離心收集超聲后的上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE分析。

蛋白純化:Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱用Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡后,將超聲上清液進(jìn)行上樣,首先,用平衡緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,20 mmol·L-1咪唑,0.15 mol·L-1NaCl,pH=8.0)洗脫雜蛋白,之后,用洗脫緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,250 mmol·L-1咪唑,0.15 mol·L-1NaCl,pH=8.0)洗脫目的蛋白。收集洗脫峰的蛋白溶液加入透析袋后,PBS透析過夜。純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。

1.5 重組細(xì)菌素的活性鑒定

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為指示菌,采用牛津杯擴(kuò)散法對(duì)重組細(xì)菌素的活性進(jìn)行鑒定。同時(shí)設(shè)定氨芐青霉素為陽性對(duì)照,PBS為陰性對(duì)照。分別在孔中加入180 μL的待測樣品,將平板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,觀察并分析抑菌效果。

1.6 重組BLIS SXAU182對(duì)溫度、pH、人工胃液和人工腸液的耐受性測定

將重組BLIS SXAU182(recombinant-BLIS SXAU182,r-BLIS SXAU182)溶液,分別在70、80、90、100 ℃和121 ℃高壓處理30 min,4 ℃條件下放置6 個(gè)月。通過牛津杯擴(kuò)散法測定冷卻后的各處理組溶液的抑菌活性,并以未經(jīng)處理的r-BLIS SXAU182溶液作為對(duì)照。

將r-BLIS SXAU182溶液pH分別調(diào)至2.0～12.0,37 ℃處理6 h后,將其pH調(diào)至7.0,通過牛津杯擴(kuò)散法檢測其處理后溶液的抑菌活性,以pH=7.0的r-BLIS SXAU182溶液作為對(duì)照。

參考中華人民共和國獸藥典的方法[19],配置人工胃液(simulated gastric fluid, SGF)和人工腸液(simulated intestinal fluid, SIG)[20]。取10 mL的r-BLIS SXAU182溶液分別與90 mL的不同pH的人工胃液或不同濃度膽鹽的人工腸液混合,37 ℃條件下處理6 h,通過牛津杯擴(kuò)散法測定其處理后溶液的抑菌活性,r-BLIS SXAU182溶液與PBS按照體積比1∶9混合作為對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的篩選和鑒定

通過菌落形態(tài)特征和革蘭染色初篩到20株疑似芽孢桿菌菌株(編號(hào)為F1～20),其無細(xì)胞上清液的抑菌活性顯示:F15對(duì)大腸桿菌具有抑制作用,但作用不顯著;F2、F3、F8、F18和F20對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌均具有不同程度的抑制活性。F18與F20的抑菌圈直徑均大于15 mm,且F18的抑菌效果優(yōu)于F20(表1)。因此,將F18作為分離細(xì)菌素的目標(biāo)菌株進(jìn)行研究。

表1 分離菌的抑菌活性測定Table 1 Quantification of the antibacterial activity of isolated strains

經(jīng)劃線培養(yǎng)獲得的F18的單克隆菌落呈乳白色,菌落邊緣較整齊、扁平、菌落表面光滑不透明,干燥、中等大小,形成“皺醭”,且在液體培養(yǎng)時(shí)也會(huì)有皺醭形成,為需氧菌(圖1A)。革蘭染色菌體呈紫色的短桿狀,單個(gè)或成對(duì)排列(圖1B)。經(jīng)16S rRNA通用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為1 446 bp(圖1C),與預(yù)期的大小一致;F18在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上與枯草芽孢桿菌為同一簇(圖1D),且相似度高達(dá)99.57%。因此,將其命名為枯草芽孢桿菌SXAU18(B.subtilisSXAU18)。

A. 菌落形態(tài);B. 革蘭染色;C. 16S rRNA 擴(kuò)增電泳圖;D. 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 A. Growth morphology; B. Gram staining morphology; C. 16S rRNA amplification electrophoresis; D. Evolutionary tree圖1 分離株的鑒定結(jié)果Fig.1 The identification of the isolate strain

2.2 B. subtilis SXAU18細(xì)菌素的分離純化和氨基酸序列預(yù)測

B.subtilisSXAU18無細(xì)胞上清液用飽和30%～70%硫酸銨進(jìn)行鹽析后,30%、30%～50%、50%～70%分段蛋白粗提液均具有抑菌活性(圖2A、2B);蛋白粗提液通過氯仿抽提和分子截留,分子量>10 ku的蛋白液產(chǎn)生明顯的抑菌圈(圖2C);將>10 ku的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示,在15 ku左右產(chǎn)生明顯的抑菌區(qū)域(圖2D)。具有抑菌活性的SDS膠通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析得到2 447個(gè)肽,通過Mascot軟件(Matrix Science)對(duì)獲得的序列進(jìn)行UniProt分析獲得71種蛋白質(zhì),結(jié)合SDS-PAGE電泳和膠條的抑菌活性鑒定對(duì)應(yīng)的蛋白分子量(10～20 ku),進(jìn)一步篩選出3種與其分子量大小相符的蛋白質(zhì)。

將預(yù)測的3種蛋白序列在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(the Antimicrobial Peptide Database, APD)進(jìn)行比對(duì),其中兩種蛋白沒有與其匹配的序列,為未知蛋白,一種蛋白與DarA蛋白(c-di-AMP receptor A)序列一致,DarA蛋白晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析,該蛋白會(huì)形成同源三聚體,從而結(jié)合三個(gè)環(huán)二腺嘌呤核苷酸(PDB: 4RLE)[21]。前期研究證明,DarA蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等革蘭陽性菌的活性[18]。根據(jù)細(xì)菌素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),芽孢桿菌細(xì)菌素可分為3類[4]:I類為修飾后細(xì)菌素,又稱羊毛硫細(xì)菌素,為小分子多肽(<5 ku);II類為無修飾細(xì)菌素,為線性小分子多肽(0.77～10 ku);III類為蛋白質(zhì)樣細(xì)菌素(>10 ku),為高分子質(zhì)量的無修飾蛋白質(zhì),其中包括由于遺傳、分子或氨基酸結(jié)構(gòu)等方面數(shù)據(jù)不全,無法進(jìn)行分類的抗菌蛋白(即類細(xì)菌素)。按照芽孢桿菌細(xì)菌素的分類方法,這兩種未知抑菌蛋白屬于芽孢桿菌III類細(xì)菌素中類細(xì)菌素的范疇,因此將它們命名為類細(xì)菌素SXAU181(BLIS SXAU181)和類細(xì)菌素SXAU182(BLIS SXAU182)。運(yùn)用ExPASy-ProtPara工具對(duì)這兩種未知蛋白進(jìn)行預(yù)測分析,結(jié)果顯示:BLIS SXAU181有203個(gè)的氨基酸殘基,預(yù)測分子量為22.414 ku,等電點(diǎn)為4.33,分子式為C1 009H1 559N243O321S7,該蛋白較穩(wěn)定,氨基酸序列為:MKKTFVKKAMLTTAAMTSAALLTFGPDAASAKTPVDNTAVQLQHQAS-TNEDLNTFIDILNQCIYEQDGVYYFDSEKAVE-LGMTKEEAQVIATLWESTSEFFSIVSQCVYLE-DGNYKFDTEKAVELGFTEKEALALEQFFSAV-SLKIHILQAAIVLQDDVYSYDKDAALQAGAT-PLQADVYEKLFSALSQEQLAAIYDMIHPQA;BLIS SXAU182有196個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測分子量為20.059 ku,等電點(diǎn)為8.95,分子式為C932H1335N241O251S4,該蛋白較穩(wěn)定。氨基酸序列為:MYYVDPYMFAGHFYEPWPAFEYEYRYPWPGIGSGAVPGSGGGSGPGIGGGAVPGFGGG-SGPGIGGGAVPGFGGGSGPGIGGGAVPGFGG-SSGPGIGSGASPGFGGAPQGPPPSQIPAKPPKP-QGSQGAVLLVEPITIRPCLFRFTYVWLTNGR-SFWFYPIILGRRSVGGFYWDSSRRRWVYFAL-DTNHIDVVSCSF。

A～B. 硫酸銨鹽析后的抑菌活性;C. 氯仿抽提和超濾后各個(gè)組分的抑菌活性;D. >10 ku蛋白液的SDS電泳和抑菌活性分析:a.SDS條帶對(duì)金黃色葡萄球菌(1)和單增李斯特菌(2)具有明顯的抑菌活性;b. SDS-PAGE:3. 低分子蛋白marker (40～1.7 ku);4. >10 ku蛋白樣品。c. 10～15 ku大小的條帶對(duì)金黃色葡萄球菌(5)和單增李斯特菌(6)具有明顯的抑菌活性 A-B. Antibacterial activity of ammonium sulfate precipitation; C. Antibacterial activity of Chloroform extraction and ultrafiltration collection; D. SDS-PAGE analysis of purified >10 ku protein solution and detection of antibacterial activity on gel: a. Gel overlaid with S. aureus (1) or L. monocytogenes (2) showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over>10 ku band. b. SDS-PAGE: 3. Low-range protein ladder (40-1.7 ku); 4. >10 ku protein sample. c. SDS Gel overlaid with S. aureus (5) or L. monocytogenes(6) showing a clearing inhibitory zone indicating antibacterial activity associated with over 10-15 ku band圖2 枯草芽孢桿菌SXAU18所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在分離純化過程中的抑菌活性檢測Fig.2 Antibacterial activity assay of purification process of bacterocin-like substance produced by B. subtilis SXAU18

2.3 類細(xì)菌素SXAU181和182的原核表達(dá)和純化

密碼子優(yōu)化合成的基因序列經(jīng)擴(kuò)增、酶切、連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序檢測目的基因成功連接至pCold-I載體。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3),低溫條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析得出:BLIS SXAU181和182均可通過原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)重組表達(dá),裂解后獲得的上清和沉淀物中均含有目的蛋白,且產(chǎn)物大部分以可溶性蛋白的形式存在,少量形成包涵體(圖3A和圖4A)。r-BLIS SXAU181和182大小分別約為25和19 ku;利用鎳柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,純化后的r-BLIS SXAU181和182經(jīng)SDS-PAGA檢測無雜帶,均為單一條帶,具有較高的濃度和純度(圖3B和圖4B)。Western blot分析表明,r-BLIS SXAU181和r-BLIS SXAU182可與鼠抗His單克隆抗體特異性結(jié)合,其蛋白大小均與預(yù)計(jì)大小大致相符(圖3C和圖4C)。

A. 重組BLIS SXAU181蛋白原核表達(dá)SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 未誘導(dǎo)組;2. 誘導(dǎo)組;3. 誘導(dǎo)組超聲波破碎后上清;4.誘導(dǎo)組超聲波破碎后沉淀。B. 重組BLIS SXAU181純化的SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 超聲波破碎后的樣品;2. 流出;3. 洗脫。C. 純化后r-BLIS SXAU 181的Western blot結(jié)果:M. 蛋白marker;1. 純化樣品 A. SDS-PAGE of r-BLIS SXAU 181 expression: M. Protein marker; 1. Non-induced group; 2. Induced group; 3. Supernatant after induction of fragmentation; 4. Precipitation after induction of fragmentation. B. SDS-PAGE analysis of r-BLIS SXAU181 purification: M. Protein Marker; 1. Samples after Ultrasonic breaking; 2. Flow-through; 3. Elution. C. Western blot analysis of r-BLIS SXAU181 purification: M. Protein Marker; 1. Purified sample圖3 r-BLIS SXAU181表達(dá)純化的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of r-BLIS SXAU181 protein expression and purification

A. 重組BLIS SXAU 182蛋白原核表達(dá)SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 未誘導(dǎo)組;2. 誘導(dǎo)組;3.誘導(dǎo)組超聲波破碎后上清;4. 誘導(dǎo)組超聲波破碎后沉淀。B. 重組BLIS SXAU 182純化的SDS電泳圖:M. 蛋白marker;1. 超聲波破碎后的樣品;2. 流出;3. 洗脫;C. 純化后r-BLIS SXAU 182的Western blot結(jié)果:M. 蛋白marker;1. 純化樣品 A. SDS-PAGE of r-BLIS SXAU 182 expression: M. Protein marker; 1. Non-induced group; 2. Induced group; 3. Supernatant after induction of fragmentation; 4. Precipitation after induction of fragmentation. B. SDS-PAGE analysis of r-BLIS SXAU182 purification: M. Protein Marker; 1. Samples after Ultrasonic breaking; 2. Flow-through; 3. Elution. C. Western blot analysis of r-BLIS SXAU182 purification: M. Protein Marker; 1. Purified sample圖4 r-BLIS SXAU182表達(dá)純化的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of r-BLIS SXAU182 protein expression and purification

2.4 重組類細(xì)菌素的活性鑒定

r-BLIS SXAU181沒有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌生長的活性(圖5A和5E);r-BLIS SXAU182具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌生長的活性(圖5B和5F),r-BLIS SXAU182對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌圈直徑分別為21.95±0.32和16.30±0.51(表2)。同時(shí),Amp陽性對(duì)照孔周圍的細(xì)菌生長受到了明顯的抑制(圖5C和5G),Amp對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為28.05±0.14和24.71±0.39(表2);PBS陰性對(duì)照孔周圍的細(xì)菌生長未受抑制(圖5D和5H),結(jié)果表明,通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的r-BLIS SXAU181無抑菌活性,r-BLISSXAU182具有良好的抑菌活性。

圖5 重組BLIS SXAU182蛋白的抑菌活性分析Fig.5 Antibacterial activity of r-BLIS SXAU182

表2 重組BLIS SXAU182的抑菌活性測定Table 2 Determination of the antibacterial activity of r-BLIS SXAU182

2.5 r-BLIS SXAU182對(duì)高溫、pH、人工胃液和腸液的穩(wěn)定性

r-BLIS SXAU182具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性(表3)。該細(xì)菌素在100 ℃條件下處理30 min后抑菌活性為75%以上,121 ℃處理30 min后抑菌活性仍達(dá)60%左右,4 ℃放置6個(gè)月對(duì)其抑菌活性基本沒有影響;該細(xì)菌素在pH=2.0～12.0條件下,抑制活性保持在60%以上,最適pH是8.0。該細(xì)菌素具有較強(qiáng)的耐膽堿和耐胃蛋白酶能力,在pH=2.0條件下胃蛋白酶作用6 h后抑菌活性保持45%以上,抑菌活性隨著pH的上升而增加。在0.9%膽鹽濃度條件下作用6 h后抑菌活性仍維持在30%以上,抑菌活性隨著膽鹽濃度的下降而增加。

3 討 論

芽孢桿菌屬是革蘭陽性菌中一個(gè)十分多樣的菌屬,有200多個(gè)亞種[22]。芽孢桿菌屬產(chǎn)生的細(xì)菌素具有不同的分子大小、序列、結(jié)構(gòu)和抗菌活性。芽孢桿菌細(xì)菌素是繼乳酸菌細(xì)菌素后的又一大類細(xì)菌素,由于其具有抗菌譜廣、無毒無害、耐受性強(qiáng)、不易引起病原菌耐藥等特征,因此,近年來芽孢桿菌細(xì)菌素的篩選和應(yīng)用更加備受研究者的關(guān)注[5]。隨著蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的快速發(fā)展,越來越多的枯草芽孢桿菌的活性物質(zhì)被認(rèn)知和應(yīng)用。例如:Wei等[23]從B.subtilisJS-4中分離到可抑制李斯特菌生長的枯草桿菌素JS-4;Pinontoan等[24]從納豆中分離到具有纖溶活性的B.subtilisG8;Watanakij等[25]從發(fā)酵的谷物中分離到具有降解黃曲霉毒素活性的B.subtilisBCC 42005。本研究從羊駝糞便中分離到20株芽孢桿菌,其中16株菌對(duì)指示菌具有不同的抑菌活性。通過對(duì)抑菌活性的分析比較,篩選抗菌譜較廣、抑菌活性較高的枯草芽孢桿菌SXAU18進(jìn)行細(xì)菌素的分離純化,質(zhì)譜分析說明B.subtilisSXAU18產(chǎn)生多種的抑菌蛋白,與研究報(bào)道的“絕大多數(shù)細(xì)菌可產(chǎn)生至少一種細(xì)菌素”[26]論述一致。目前已報(bào)道的枯草芽孢桿菌細(xì)菌素有subtilin、sublancin、subtilosin A、TasA等,但仍有許多抑菌蛋白由于缺少DNA和蛋白的序列信息還沒有被分類。本研究分析預(yù)測的3種抑菌,其中一種蛋白為DarA蛋白,為已知蛋白,另外兩種為未知的蛋白。根據(jù)這兩種未知蛋白的分子量大小和氨基酸序列特點(diǎn),并結(jié)合芽孢桿菌細(xì)菌素分類方法,屬于芽孢桿菌III類細(xì)菌素中的類細(xì)菌素的范疇,從而命名為細(xì)菌素SXAU181和182。

表3 溫度和pH對(duì)B. Subtilis SXAU18所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌活性的影響Table 3 Effects of heat, pH on the antimicrobial activity of bactericin from B. Subtilis SXAU18

細(xì)菌素雖小,但由一簇基因編碼[14-16],且與眾多物質(zhì)混合,提取困難、操作繁瑣、產(chǎn)量低。通過蛋白分離和質(zhì)譜分獲得B.subtilisSXAU18所產(chǎn)細(xì)菌素的氨基酸序列,分子量大小為10～20 ku,為通過基因工程技術(shù)獲得重組細(xì)菌素提供了基因序列。加之,B.subtilisSXAU18的抗菌譜顯示,所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特桿菌等革蘭陽性菌具有抑制其生長的活性,但對(duì)于大腸桿菌沒有抑制活性。根據(jù)這些特點(diǎn),本研究選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為類細(xì)菌素的體外表達(dá)系統(tǒng)[27]。大量研究證明,根據(jù)表達(dá)體系的特性進(jìn)行密碼子的優(yōu)化可以提高重組蛋白的表達(dá)量[28],低溫誘導(dǎo)可改變折疊動(dòng)力學(xué),降低中間折疊體的產(chǎn)生,從而增加可溶性蛋白的表達(dá)比例[29]。因此,本研究按照大腸桿菌的密碼子偏好性對(duì)BLIS SXAU181和182的基因序列進(jìn)行優(yōu)化,并選擇pCold-I作為表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行低溫誘導(dǎo),實(shí)現(xiàn)了BLIS SXAU181和182的可溶性表達(dá)。最終獲得了抑菌活性良好的r-BLIS SXAU182。為BLIS SXAU182功能解析及其應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

細(xì)菌素的穩(wěn)定性極大限制了其應(yīng)用。乳酸鏈球菌素(Nisin)在酸性環(huán)境下有很強(qiáng)的活性,但在中性和堿性環(huán)境下,活性喪失[3]。Lee等[30]從貝氏芽孢桿菌BS2分離到的細(xì)菌素Bacbs2,在pH=4～9條件下完全穩(wěn)定,在pH=1～3時(shí)活性減半;在80 ℃處理15 min保持完全活性,但90℃處理15 min或100℃處理10 min活性減半。r-BLIS SXAU182具有較高的穩(wěn)定性,在暴露121℃高溫30 min后保持45%的抑菌活性,pH=2.0～12.0條件下,仍保持60%以上的活性,且具耐膽堿的生物特性。這些優(yōu)良特性使得BLIS SXAU182在飼料加工、藥物治療等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

從羊駝糞便中篩選到產(chǎn)細(xì)菌素的枯草芽孢桿菌SXAU18,從其培養(yǎng)液中分離純化細(xì)菌素,預(yù)測獲得兩種類細(xì)菌素的氨基酸序列,并通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得具有抑制金黃色葡萄球菌和單增李斯特桿菌生長且穩(wěn)定性良好的r-BLIS SXAU182。