廣東規(guī)?；u場(chǎng)死雞胚中雞毒支原體的分離鑒定、致病性及藥物敏感性

陳玥彤,劉曉涵,王芷洋,趙宇馨,周鐵忠,胡增金,朱 悅,王少輝, 田明星,丁思羽,祁晶晶*,于圣青*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,錦州 121000; 3.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,濰坊 261000;4.揚(yáng)州優(yōu)佳創(chuàng)生物科技有限公司,揚(yáng)州 225261)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)又稱為雞敗血支原體、雞霉形體,是雞慢性呼吸道疾病(chronic respiratory diseases,CRD)的主要病原[1]。受感染的雞會(huì)出現(xiàn)流涕、呼吸啰音、叫聲嘶啞、食減神郁、縮頸垂翅等,病程一般持續(xù)時(shí)間為1～2月,若無并發(fā)癥其死亡率在10%左右。若與其它病原體混合感染,死亡率可迅速上升至60%[2]。MG主要有水平和垂直兩種傳播方式,感染該病原將會(huì)影響雞群增重、生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)蛋率,并且一般很難根治[3]。Osman等[4]對(duì)埃及雞群的MG進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)MG在雞群的感染率達(dá)到33.3%。Roussan等[5]對(duì)約旦雞場(chǎng)進(jìn)行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)MG的陽性率達(dá)到了6.6%,且MG和禽流感病毒的混合感染雞場(chǎng)比例達(dá)到了5.7%。在我國(guó),程倩倩[6]對(duì)太原、忻州兩市的15個(gè)蛋雞場(chǎng)的1 325份雞血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn),結(jié)果顯示這些雞場(chǎng)MG抗體的陽性率平均為36.3%。姜蘭蘭等[7]對(duì)北京市127個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)MG抗體陽性率達(dá) 80.6%。林琳[8]對(duì)閩北地區(qū)不同免疫背景及不同用途的90個(gè)白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)采集1 800份喉氣管拭子樣品進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè),MG陽性場(chǎng)率為33.33%。由此可見,國(guó)內(nèi)外MG感染情況十分嚴(yán)重。郭楊麗等[9]和魏津等[10]從MG感染的氣囊病料中分離出MG;隋兆峰等[11]從病雞肺、氣囊中分離出MG;牛家強(qiáng)等[12]從疑似慢性呼吸道病感染的雞氣管中分離出MG;吳春琳等[13]從感染的雞喉拭子中分離出MG。目前較少見從雞胚中分離MG的報(bào)道。國(guó)內(nèi)外對(duì)于MG 的研究已開展百余年,但至今對(duì)支原體病的控制,尤其對(duì)MG感染的防控仍是現(xiàn)代集約化養(yǎng)禽業(yè)的重點(diǎn)。目前藥物控制、疫苗免疫和加強(qiáng)管理是控制該病的主要措施。國(guó)內(nèi)外禽支原體病治療和預(yù)防過程中使用較為廣泛的藥物是大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類等抗菌藥,但不同地區(qū)分離的菌株對(duì)抗生素的敏感性有差異,且耐藥性問題也較為嚴(yán)重,由此造成MG感染防治困難,病情反復(fù),威脅公共衛(wèi)生安全。本研究對(duì)廣東某禽業(yè)未出殼死胚進(jìn)行分離培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)、16S rRNA支原體通用引物序列鑒定及基于該基因序列的遺傳進(jìn)化分析、動(dòng)物致病性及藥物敏感性試驗(yàn),為今后的雞毒支原體診斷、治療及疫苗研制提供了基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 病料、菌株、試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病料來源于廣東某禽業(yè)未出殼死胚;MG Rlow菌株、MG標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清、MS標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清、SPF雞陰性血清均購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)購自青島海博生物技術(shù)有限公司;馬血清購自美國(guó)Gibco公司;瓊脂購自英國(guó)Oxoid公司;膠回收試劑盒購自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;2×Taq Master Mix、DM2000 DNA Marker、青霉素和氯化鈉購自上海生工生物工程有限股份公司;綠如藍(lán)核酸染料購自澤葉生物有限公司;SPF雞胚和3周齡SPF雞均購自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司。

雞毒支原體液體培養(yǎng)基[14]:支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基26.4 g溶解于800 mL ddH2O中,高壓滅菌15 min,冷卻至室溫,無菌加入10%馬血清;LB液體培養(yǎng)基:Tryptone 8 g、Yeast extract 4 g、NaCl 8 g溶解于800 mL ddH2O中高壓滅菌后備用。LB固體培養(yǎng)基:在上述液體LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入12 g瓊脂高壓滅菌后制成平板放入4 ℃冰箱備用。

1.2 抗菌藥物信息

替米考星(含量90%,批號(hào)909G201),購自北京索萊寶科技有限公司;泰樂菌素(批號(hào)FS1622261),購自天津阿爾塔科技有限公司;泰萬菌素(800 U·mg-1)、紅霉素(920 U·mg-1,批號(hào)Y18F8C29407)、吉他霉素(含量>1 400 U·mg-1,批號(hào)L09J9K65033)、泰妙菌素(含量98%,批號(hào)X10S6H3193)、氟苯尼考(含量98%,批號(hào)S19A8Y34179)、多西環(huán)素(含量98%,批號(hào)Y30A8C42634)及恩諾沙星(規(guī)格98%,批號(hào)H20A9Z68212)均購自上海源葉生物科技有限公司;鹽酸沃尼妙林(含量98.8%,批號(hào)100603),購自湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司;林可霉素(批號(hào)C14549481)、土霉素(批號(hào)C14849549)購自麥克林試劑;大觀霉素(批號(hào)WD0317B4014J)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 病原的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

取死胚卵黃液、卵黃組織、肺和肝于4 mL含100 μg·mL-1濃度青霉素的支原體液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱放置5 h后,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液1 mL,接種至新的支原體液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d,觀察培養(yǎng)基顏色變化。待培養(yǎng)基顏色由紅變橘黃時(shí),將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),4～5 d后于顯微鏡下觀察菌落形態(tài),并挑取單菌落,轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌L型鑒定

將分離株用不含青霉素的培養(yǎng)基連續(xù)傳代9次,再將其接種于固體支原體培養(yǎng)基上,3～5 d涂片、染色鏡檢,觀察其是否恢復(fù)成細(xì)菌形態(tài)。

1.5 平板凝集試驗(yàn)

于50 mL培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)分離菌株,10 000 r·min-1離心15 min,500 μL PBS緩沖液重懸菌體沉淀,取1片干凈載玻片,從左邊至右分別滴加10 μL MG標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清、 MS標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清、SPF雞陰性血清,再分別向血清中滴加10 μL重懸菌液,用槍頭將其混勻,1 min觀察結(jié)果。

1.6 分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 分離菌株基因組粗提 取分離株菌液2 mL,12 000 r·min-1離心15 min,用移液槍吸掉上清部分,用200 μL PBS重懸沉淀,夾上防爆夾,放在浮漂上,水溫100 ℃煮10 min,冰上放置5 min,5 000 r·min-1離心5～10 min,吸取上清部分即為菌株的粗提基因組。

1.6.2 支原體16 S rRNA通用引物PCR擴(kuò)增 根據(jù) GenBank 中MG Rlow株16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物,由生工生物工程(上海)有限公司合成,上下游引物序列分別為5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′和5′-ATTACCGCGGCTGGCAG-3′。對(duì)分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增的預(yù)期產(chǎn)物大小為500～600 bp。PCR 擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃最后延伸10 min;共30個(gè)循環(huán)。

1.6.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序 取10 μL上述PCR產(chǎn)物,在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,電壓100 V,電泳30 min,對(duì)產(chǎn)物條帶進(jìn)行膠回收:具體操作參考Thermo Fisher Scientific膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。測(cè)定濃度后,送上海擎科生物公司進(jìn)行序列測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用BLASTp檢索non-redundant protein sequences (nr)數(shù)據(jù)庫,并用MEGA 5.0軟件與其它支原體16S rRNA進(jìn)行序列比對(duì)。

1.7 支原體分離菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定試驗(yàn)

將純化后的分離株轉(zhuǎn)接到支原體液體培養(yǎng)基中,待培養(yǎng)基顏色剛剛變黃,按5%轉(zhuǎn)接比例轉(zhuǎn)接到新的支原體液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)(0、12、15、18、21、24、28、32、36、48和60 h)的菌液,分別測(cè)定其顏色改變單位(color change units, CCUs)和菌落形成單位(colony forming units, CFUs)。

1.8 血凝試驗(yàn)

在支原體液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)MGRlow和待鑒定的分離菌株,至液體變?yōu)殚冱S色,8 000 r·min-1離心后PBS洗滌2次,最后用PBS重懸并調(diào)整菌液濃度,使其OD600 nm值為1.0。取1塊細(xì)胞凝集板,每孔加入25 μL PBS,取調(diào)整好濃度的待測(cè)菌液25 μL加入第1孔,吹打均勻后換槍頭吸取25 μL至第2孔,重復(fù)該操作至第11孔,吸取25 μL棄掉,最后1孔為血細(xì)胞對(duì)照組。每孔再加入25 μL PBS和25 μL 1%雞紅細(xì)胞,震蕩混勻,室溫40 min觀察結(jié)果。

1.9 致病性試驗(yàn)

1.9.1 SPF雞胚攻毒試驗(yàn) 將分離株以及MG Rlow分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,8 000 r·min-1離心10 min,PBS洗滌2次后用PBS重懸即為待攻毒菌液。將SPF雞胚在溫度38 ℃、濕度60%的孵化箱中進(jìn)行孵化至7日齡,取35只成功孵化的雞胚,分為7組,每組5只,分別接種新鮮處理的5株分離株、MG Rlow攻毒菌液(2×105CCU·只-1),以及PBS (200 μL·只-1),接種方式為卵黃囊接種。接種后繼續(xù)孵化雞胚,直至出殼,每天照蛋一次,記錄雞胚死亡情況。

1.9.2 SPF雞攻毒試驗(yàn) 準(zhǔn)備新鮮的分離株和MG Rlow株攻毒菌液,方法同“1.9.1”,取3周齡SPF雞35只,采取氣管灌注方式進(jìn)行攻毒,每個(gè)分離株和MG Rlow各攻毒5只,攻毒劑量為5×107CCU·只-1,剩余5只按同樣方式灌注500 μL PBS作為陰性對(duì)照,觀察雞的臨床癥狀,3周后解剖雞,并拍照記錄病理變化。

1.10 最小抑菌濃度 (MIC)測(cè)定

將分離株以及MG Rlow分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以MG菌株編號(hào)標(biāo)記96孔板各行。每行第1孔加入用培養(yǎng)基配制好的兩倍最高測(cè)試濃度的抗生素200 μL,其后2～12孔則均加入100 μL支原體液體培養(yǎng)基。吸取第1孔100 μL至第2孔,依次稀釋直至第10孔吹打混勻后吸棄100 μL。用支原體培養(yǎng)基將原培養(yǎng)液稀釋至105CCU·mL-1。第12孔以及第10～第1孔,由低稀釋度到高稀釋度依次加入100 μL菌液。其中倒數(shù)第二孔為陰性對(duì)照,倒數(shù)第一孔為陽性對(duì)照。置于培養(yǎng)箱,37 ℃溫箱孵育4～7 d,每日觀察,直至陽性對(duì)照孔顏色變黃且陰性對(duì)照孔顏色未變,抑制菌株生長(zhǎng)不發(fā)生顏色變化的最高稀釋度即為測(cè)試藥物的最小抑菌濃度(MIC)。每種藥物設(shè)3個(gè)平行。每種藥物的MIC重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié) 果

2.1 病原的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

取死胚的卵黃液、卵黃膜、肺和肝的浸泡液,在支原體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d,可見顏色由紅變?yōu)殚冱S,將變黃菌液10倍稀釋涂于支原體固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)5～7 d可見小水珠樣菌落,低倍鏡下可見其菌落形態(tài)為中央凸起的“油煎蛋狀”(圖1),符合支原體的形態(tài)特征。

2.2 細(xì)菌L型鑒定

將各分離株用支原體培養(yǎng)基連續(xù)傳代8～10代,接種于支原體固體培養(yǎng)基上,其菌體依然能通過0.45 μm濾器,并保持其原來菌落形態(tài)。說明分離株不是細(xì)菌或病毒。

2.3 平板凝集鑒定

各分離株能與MG標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清反應(yīng),與MS標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清、SPF雞血清不發(fā)生凝集反應(yīng),見圖2。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 支原體16S rRNA通用引物PCR擴(kuò)增 將分離株粗提基因組DNA用作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在550 bp左右可見條帶,如圖3。

A. 分離株在支原體液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后培養(yǎng)基顏色變化;B. 分離株在40倍物鏡下菌落形態(tài);C. 分離株在 100倍物鏡下菌落形態(tài) A. The color of the culture medium changes after the isolated strain grows in the liquid medium of Mycoplasma; B. Colony morphology of isolated strains under a 40× objective lens; C. Colony morphology of isolated strains under a 100× objective lens圖1 分離株在支原體液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 The growth of new isolates on liquid medium and solid medium of mycoplasma

A～E. 各分離株與血清的反應(yīng);F. MG Rlow與血清的反應(yīng);1. MG標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清;2. MS標(biāo)準(zhǔn)陽性雞血清;3. SPF雞血清 A-E. The isolates react with sera; F. MG Rlow reacts with sera; 1. MG standard positive chicken sera; 2. MS standard positive chicken sera; 3. SPF chicken sera圖2 分離菌株平板凝集試驗(yàn)Fig.2 Plate agglutination test of isolated strains

M. DM 2000 marker;a～e. 各分離株基因組DNA;f. MG Rlow基因組DNA;g. ddH2O M. DM 2000 marker; a-e. Genomic DNAs of each isolate; f. Genomic DNAs of MG Rlow; g. ddH2O圖3 分離株用支原體16S rRNA 通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The PCR amplification results of different isolates using universal primers for 16S rRNA

2.4.2 測(cè)序與分析 將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海擎科生物公司進(jìn)行序列測(cè)定,用DNA Strar比對(duì)分離株和MG 16S rRNA序列,結(jié)果顯示,分離株的16S rRNA與MG相似性達(dá)99.9%,表明這5株分離株均為雞毒支原體,分別命名為MG 18-31、MG 18-32、MG 18-3、MG 8-13、MG 8-15。

2.5 分離株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

各分離株在支原體液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～60 h的生長(zhǎng)情況大致相同,以其中一株MG 18-31為例,可見該菌株在0～32 h均處于滴度上升期,32 h達(dá)峰值,此時(shí)滴度為109CCU·mL-1,32 h后滴度開始下降,60 h分離株死亡,分離株CFU計(jì)數(shù)法生長(zhǎng)曲線與CCU計(jì)數(shù)法生長(zhǎng)曲線結(jié)果完全一致,如圖4。

A. 分離株CCU計(jì)數(shù)法生長(zhǎng)曲線;B. 分離株CFU計(jì)數(shù)法生長(zhǎng)曲線 A. Growth curve based on CCU counting method; B. Growth curve based on CFU counting method圖4 分離株MG 18-31生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of MG 18-31 strain

A～E. 各分離株與紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng);F. MG Rlow與紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng);1～11.血清稀釋度分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048;12.陰性對(duì)照 A-E. Agglutination reaction of each isolate with red blood cells; F. Agglutination reaction of Rlow with red blood cells; 1-11. Sera were diluted at 1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256, 1∶512, 1∶1 024, 1∶2 048, respectively; 12. Negative control圖5 分離菌株血凝試驗(yàn)Fig.5 Hemagglutination test of the different isolates

2.6 血凝試驗(yàn)

各分離株(MG18-31、MG 18-32、MG18-3、MG 8-13、MG 8-15)及MG Rlow分別與1%雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng),凝集效價(jià)為1∶16、1∶4、1∶4、1∶4、1∶4和1∶8,見圖5。

2.7 SPF雞胚致病性試驗(yàn)

分離株和MG Rlow菌液(106CCU·mL-1,200 μL·只-1)和PBS(200μL·只-1)各接種5枚6～8日齡SPF雞胚卵黃囊,結(jié)果顯示感染雞胚大多于17～21 d死亡,其中MG Rlow、MG 18-31、MG 18-3攻毒雞胚全部死亡,MG 18-32、MG 8-13出殼一枚,MG 8-15出殼兩枚,MG Rlow、MG 18-31、MG 18-3死亡率均為100%,MG 18-32和MG 8-13死亡率為80%,MG 8-15死亡率為60%。死亡胚體表現(xiàn)為胚體發(fā)育遲緩、蜷縮,剖檢可見雞氣囊有干酪物,出殼感染雞表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩,精神不振,對(duì)照組均正常出殼,見圖6。

2.8 SPF雞攻毒試驗(yàn)

分離株和MG Rlow各攻毒5只三周齡SPF雞,每只雞攻毒500 μL,攻毒劑量為108CCU·mL-1,結(jié)果顯示雞在攻毒后10 d左右出現(xiàn)啰音,叫聲嘶啞。3周后剖檢主要病變?yōu)殡u氣囊增厚,有干酪樣物附著于表面,PBS組氣囊未見病變,見圖7。

2.9 MIC測(cè)定

MG分離株對(duì)13種抗生素藥物的MIC測(cè)定結(jié)果見表1。5株MG分離株對(duì)鹽酸沃尼妙林(<0.062 5 μg·mL-1)、多西環(huán)素(0.062 5 μg·mL-1)、泰妙菌素(0.062 5～0.125 μg·mL-1)及泰萬菌素(0.062 5～0.25 μg·mL-1)均表現(xiàn)出較高的敏感性;其次是土霉素(0.125～2 μg·mL-1)、氟苯尼考(0.5～4 μg·mL-1)、大觀霉素(1～16 μg·mL-1)及恩諾沙星(2～8 μg·mL-1);對(duì)泰樂菌素(4～16 μg·mL-1)、替米考星(8～64 μg·mL-1)、吉他霉素(>32 μg·mL-1)、紅霉素(>32 μg·mL-1),特別是對(duì)林可霉素(8～128 μg·mL-1)的敏感性較低。

A～F. MG 18-31、MG 18-32、MG 18-3、MG 8-13、MG 8-15、MG Rlow感染雞胚死胚剖檢氣囊病變;G. PBS對(duì)照剖檢氣囊;H～M. MG 18-31、MG 18-32、MG 18-3、MG 8-13、MG 8-15、MG Rlow感染雞胚蜷縮狀死胚;N. 感染雞胚與PBS對(duì)照組出殼后雞狀態(tài)對(duì)比 A-F. MG 18-31, MG 18-32, MG 18-3, MG 8-13, MG 8-15, MG Rlow infected chicken embryos with dead embryo dissection for balloon lesions; G. PBS control dissection of airbags; H-M Infected chicken embryos with MG 18-31, MG 18-32, MG 18-3, MG 8-13, MG 8-15, and MG Rlow resulted in curled up dead embryos; N. Comparison of chickens hatching from infected chicken embryos and PBS control chicken embryos圖6 雞胚致病性試驗(yàn)Fig.6 Chicken embryos infection test

A～G. MG 18-31、MG 18-32、MG 18-3、MG 8-13、MG 8-15、MG Rlow攻毒SPF雞氣囊;G. PBS對(duì)照SPF雞氣囊 A-G. Air bags from MG 18-31, MG 18-32, MG 18-3, MG 8-13, MG 8-15, or MG Rlow challenged SPF chicken; G. Air bags from PBS inoculated SPF chicken圖7 SPF雞攻毒試驗(yàn)Fig.7 SPF chickens infection test

表1 MG分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株MG Rlow對(duì)13種藥物的MIC測(cè)定結(jié)果Table 1 The minimum inhibitory concentrations of 13 drugs for 5 MG isolates and standard strain MG Rlow μg·mL-1

3 討 論

1905年英國(guó)科學(xué)家Dodd首次發(fā)現(xiàn)了MG感染火雞的病例,當(dāng)時(shí)將此病稱為“流行性肺腸炎”[15]。1933年Nelson[16]首次從感染雞群中分離到MG,之后便在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播。Marouf等[17]在進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查的332個(gè)樣本中,發(fā)現(xiàn)206個(gè)樣本呈MG陽性,陽性率為62%。雖然MG感染率很高,但是若無并發(fā)癥其死亡率并不高,在10%左右。若與其它病原體[如新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)等]混感,死亡率可迅速上升至60%[18]。MG因其獨(dú)特的感染表現(xiàn),早期的診斷和預(yù)防顯得尤為重要。目前,MG鑒別診斷方法包括分離鑒定、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)等。支原體的分離極其困難,成功率不高,盡管這樣,分離鑒定依然是診斷支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。臨床上常用血清學(xué)診斷主要包括血清平板凝集(SPA)、血凝抑制(HI)和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA試驗(yàn))[19]三種試驗(yàn)方法。血清學(xué)診斷的優(yōu)點(diǎn)在于可檢測(cè)大量樣本、操作簡(jiǎn)單、快捷、方便,因此臨床上對(duì)該方法應(yīng)用較普遍;但其缺點(diǎn)是存在非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng),易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。分子學(xué)檢測(cè)主要以PCR為主,該方法照比血清學(xué)方法更加特異、高效,是目前應(yīng)用最為廣泛的一種檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)對(duì)廣東某規(guī)?；u場(chǎng)死雞胚進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定,結(jié)果從中成功分離到5株MG,且其均為卵黃液中分離,可見從雞胚的卵黃液中分離MG的成功率較高。將這些分離株接到固體培養(yǎng)基上,5 d左右看到和支原體形態(tài)相似的菌落。在無青霉素的液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳9代,未見菌落形態(tài)發(fā)生變化,確定分離株不是細(xì)菌或病毒。將分離株菌懸液與MG標(biāo)準(zhǔn)陽性血清混合,可見出現(xiàn)明顯凝集顆粒,與MS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和SPF雞陰性血清混合則未見凝集,初步推測(cè)分離株為雞毒支原體。

致病性與非致病性禽源支原體主要區(qū)別在于致病性禽源支原體可吸附雞、火雞等的紅細(xì)胞,產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集反應(yīng)[20]。血凝試驗(yàn)證實(shí),所分離的5株MG均能產(chǎn)生明顯的血凝反應(yīng),其血凝效價(jià)不完全相同,其中MG18-31株和參考株MG Rlow株的血凝效價(jià)較高,分別為1∶16及1∶8,其余4株MG菌血凝效價(jià)均為1∶4。雞胚感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,MG Rlow、MG 18-31、MG 18-3攻毒雞胚死亡率100%,MG 18-32、MG 8-13攻毒雞胚死亡率80%,MG 8-15攻毒死亡率為60%。其中血凝效價(jià)較高的MG18-31株和參考株MGRlow株攻毒后的雞胚均顯示100%死亡,提示血凝效價(jià)高的MG菌株其致病性也可能較強(qiáng),但血凝效價(jià)高低是否與菌株毒力相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

MG菌對(duì)雞胚攻毒的癥狀比SPF雞攻毒癥狀更為明顯。死亡胚體表現(xiàn)為胚體發(fā)育遲緩、蜷縮,剖檢可見雞氣囊有干酪物,將黃色干酪物進(jìn)行分菌鑒定,均分離到支原體。盡管有小雞順利出殼,但其生長(zhǎng)緩慢,精神沉郁,極少飲水進(jìn)食,站立困難,一周以內(nèi)死亡,說明所分離MG菌株可使雞胚致弱甚至致死。而SPF雞攻毒后主要引起雞聲音沙啞、食欲減退、眼眶輕微紅腫等表征,剖檢后能看到明顯的氣囊病變,但肝、脾、肺等臟器未見明顯病變,僅有個(gè)別雞只有脾腫大現(xiàn)象。結(jié)合攻毒試驗(yàn)結(jié)果,建議對(duì)MG菌株毒力評(píng)估采用雞胚攻毒和SPF雞攻毒兩種評(píng)價(jià)方式共同進(jìn)行。

由于沒有細(xì)胞壁,支原體不受許多抗生素的影響,如β-內(nèi)酰胺類、糖肽類和針對(duì)細(xì)胞壁合成的磷霉素。在動(dòng)物中,針對(duì)支原體感染的最有效和最廣泛使用的抗菌劑是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和截短側(cè)耳素類抗生素。對(duì)5株MG臨床分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,其與標(biāo)準(zhǔn)株MG Rlow的MIC值相比,對(duì)于泰萬菌素(大環(huán)內(nèi)酯類)、多西環(huán)素(半合成四環(huán)素類)、鹽酸沃尼妙林及泰妙菌素(截短側(cè)耳素類)均具有較高敏感性,與標(biāo)準(zhǔn)株MG Rlow的MIC值無顯著性差異;對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯類的替米考星、泰樂菌素、紅霉素、吉他霉素,以及氟喹諾酮類的恩諾沙星而言,則表現(xiàn)出不同程度的耐藥趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)外有幾項(xiàng)研究報(bào)道了MG的體外藥敏水平[21-24]。MG對(duì)泰妙菌素的MIC值始終低于體外測(cè)試的其他抗菌劑的MIC值;大多數(shù)MG也對(duì)四環(huán)素類抗生素敏感,對(duì)土霉素和多西環(huán)素的MIC值較低;MG對(duì)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物沒有內(nèi)在的耐藥性,大多數(shù)菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感。然而本研究發(fā)現(xiàn)MG分離株對(duì)多種大環(huán)內(nèi)酯類藥物,如替米考星、泰樂菌素、紅霉素、吉他霉素等存在顯著的耐藥性,對(duì)恩諾沙星也存在一定程度的耐藥趨勢(shì)。由于在國(guó)內(nèi)外都常常使用以恩諾沙星、替米考星、泰樂菌素等來治療MG感染,所以國(guó)內(nèi)外都出現(xiàn)了不同程度的耐藥性,MG耐藥性的逐漸攀升增加了臨床的治療壓力和成本,因此需要對(duì)常用抗生素的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究以幫助臨床解決耐藥壓力問題,并對(duì)臨床用藥起到指導(dǎo)作用。

4 結(jié) 論

盡管目前雞毒支原體分離鑒定的案例較多,從死雞胚中分離培養(yǎng)MG的報(bào)道較少見,本研究從廣東省某規(guī)模化雞場(chǎng)的死雞胚卵黃液中成功分離到5株MG,雞胚和SPF雞攻毒試驗(yàn)均證實(shí)分離株能致死雞胚,引起雞氣囊炎。藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這5株MG均對(duì)泰萬菌素、多西環(huán)素、鹽酸沃尼妙林及泰妙菌素有較高敏感性,對(duì)替米考星、泰樂菌素、恩諾沙星、紅霉素、吉他霉素、林可霉素呈現(xiàn)出不同程度耐藥性。該研究為MG的分離鑒定提供可參考的技術(shù)方法,為MG攻毒模型建立提供研究基礎(chǔ),為MG感染治療的用藥選擇提供參考依據(jù)。