CRISPR/Cas9技術(shù)高效制備山羊SOCS2基因編輯胚胎

張晨?jī)€,李隱俠,丁 強(qiáng),劉偉佳,王慧利,何 南,吳家順,曹少先*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,江蘇省畜禽精準(zhǔn)育種工程研 究中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,泰安 271017)

細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2),屬于細(xì)胞因子傳導(dǎo)抑制因子家族成員,是生長(zhǎng)激素的負(fù)調(diào)控因子[1-3]。Metcalf等[4]研究發(fā)現(xiàn),SOCS2基因敲除小鼠6周齡體重顯著增加,Starr等[5]研究表明,SOCS2能通過與GH競(jìng)爭(zhēng)GHR的結(jié)合,負(fù)調(diào)控GH-IGF1通路抑制生長(zhǎng)。山羊SOCS2基因包含3個(gè)外顯子,編碼198個(gè)氨基酸。SOCS2蛋白包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域,中心保守的SH2結(jié)構(gòu)域、C末端SOCS盒和可變的N-端結(jié)構(gòu)域[1]。SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別受體(如GHR)或者配體的磷酸酪氨酸是SOCS2蛋白發(fā)揮功能的關(guān)鍵步驟[6-8],識(shí)別過程中SH2結(jié)構(gòu)域中5個(gè)高度保守的氨基酸殘基(Arg73、Ser75、Ser76、Thr83和Arg96)通過氫鍵形成磷酸酪氨酸結(jié)合口袋,將磷酸化的酪氨酸殘基(如GHR的pY595)鎖定[9];N-端結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)擴(kuò)展的 SH2子結(jié)構(gòu)域 (ESS),連接SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS盒,使SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別和捕獲的底物泛素化[10]。據(jù)報(bào)道,綿羊SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域第96號(hào)精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?p.R96C),使其無法與磷酸酪氨酸結(jié)合導(dǎo)致SOCS2蛋白活性喪失,與野生型相比p.R96C突變綿羊體重增加了18%[11]。

CRISPR/Cas9屬于第3代基因編輯技術(shù),通過gRNA識(shí)別并引導(dǎo)核酸酶Cas9對(duì)靶基因進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)[12],誘導(dǎo)DNA同源重組(HDR)[13-14]或非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)[15],實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因編輯[16]。相較于前兩代基因編輯技術(shù)ZFN、TALENs,CRISPR/Cas9具有編輯效率高、操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)勢(shì),自問世以來,已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病治療和動(dòng)植物育種等領(lǐng)域[17-19]。但CRISPR/Cas9的編輯效率和特異性與sgRNA序列直接相關(guān)[20-21],設(shè)計(jì)篩選特異性好、編輯效率高的sgRNA對(duì)于制備基因編輯動(dòng)物特別是大動(dòng)物至關(guān)重要。

目前關(guān)于山羊SOCS2基因編輯的報(bào)道很少,僅見Zhou等[22]利用堿基編輯器編輯綿羊SOCS2基因p.R96C的報(bào)道,且編輯效率僅25.0%(1/4)。亟需在山羊胚胎水平開展高效精準(zhǔn)sgRNA的設(shè)計(jì)、篩選,為高效制備SOCS2基因敲除山羊,培育快長(zhǎng)型肉用山羊提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

106枚新鮮波雜山羊卵巢采集自江蘇省海安市屠宰場(chǎng),浸泡于37 ℃生理鹽水中,通過保溫瓶帶回實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行卵母細(xì)胞分離和培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit、mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit、MEGAclearTMKit購(gòu)于 Thermo fisher公司;QIAquick Gel Extraction Kit 購(gòu)自Qiagen公司;GenCrispr Cas9 Nuclease 購(gòu)于GenScript公司;pMDTM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA Ligase購(gòu)自 TaKaRa 公司;Discover-sc Single Cell WGA Kit、DNA marker、2×Rapid Taq Master Mix、Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 SOCS2 基因的sgRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

1.3.1 sgRNA引物設(shè)計(jì) 根據(jù)山羊SOCS2基因(XM_018047625)SH2的保守序列,使用在線網(wǎng)站CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)設(shè)計(jì)山羊SOCS2基因的sgRNA靶序列,選擇Lindel評(píng)分[23]高的sgRNA,其長(zhǎng)度為20 bp,PAM(protospacer adjacent motif)序列為-NGG。為方便sgRNA引物與載體連接,在sgRNA正義鏈5′端添加ACCG,反義鏈5′端添加AAAC,見表1。送北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建 使用BsaⅠ核酸內(nèi)切酶將pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin質(zhì)粒線性化后膠回收純化。分別將合成的sgRNA引物用超純水稀釋為100 mol·L-1,每對(duì)各取上下游5 μL混合,98 ℃變性10 min,室溫冷卻,在T4 DNA Ligase作用下與線性化質(zhì)粒16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定。上游引物為pGL3-sg-F:5′-CGATTAGTGAACGGATCTCGACG-3′,下游引物為sgRNA反義鏈,擴(kuò)增體系為2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,菌液1 μL,加去離子水至25 μL;擴(kuò)增程序包括95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,52 ℃退火20 s,72 ℃延伸15 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后選取陽(yáng)性克隆送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 sgRNA與Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄

分別以質(zhì)粒pX330和pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin為模板,PCR擴(kuò)增制備Cas9和sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板,將T7啟動(dòng)子引入擴(kuò)增引物(序列見表1)。使用Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸(Cas9、sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板延伸時(shí)間分別為2.5 min、30 s),共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化作為體外轉(zhuǎn)錄模板。Cas9 mRNA和sgRNA分別使用mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit和MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,MEGAclearTMKit純化,通過Nano drop2000超微分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9 mRNA混合,調(diào)整其終濃度分別至50 ng·μL-1和100 ng·μL-1,置-80 ℃保存。

1.5 sgRNA/Cas9 蛋白體外切割活性測(cè)定

以山羊基因組序列為模板,使用Primer Premier 5在基因編輯靶區(qū)域上、下游500 bp附近設(shè)計(jì)檢測(cè)引物SOCS2-F、SOCS2-R,序列見表2。以山羊全基因組DNA為模板,參照“1.3.2”的方法,對(duì)基因編輯區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物膠回收純化后進(jìn)行體外切割。體系為:Cas9 蛋白5 U,sgRNA 0.2 μg,底物DNA 1 μg,10×Cas9 Buffer 5 μL,補(bǔ)充RNase free ddH2O至50 μL,對(duì)照組未加入sgRNA。37 ℃反應(yīng)3 h后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 卵母細(xì)胞體外成熟

參照Cripso等[24]的方法進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。將收集到的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)置于成熟培養(yǎng)基中,每孔500 μL成熟培養(yǎng)液中放入100個(gè)COCs并覆蓋石蠟油,在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中體外成熟培養(yǎng)24 h。

表1 sgRNA載體構(gòu)建、Cas9和sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板制備引物Table 1 Oligonucleotides for constructing sgRNA vectors and making templates of Cas9 and sgRNA transcription in vitro

1.7 卵母細(xì)胞孤雌激活和顯微注射

參照Ledda等[25]的方法對(duì)MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活,激活后繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h,使用尼康顯微注射系統(tǒng)對(duì)單細(xì)胞孤雌胚胎注射Cas9 mRNA和sgRNA的混合物,對(duì)照組注射無核酸酶的超純水,繼續(xù)培養(yǎng) 7 d。激活后48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率,第7 天收集囊胚。

1.8 基因編輯效率的檢測(cè)

收集單個(gè)囊胚于200 μL離心管中,按照Discover-sc Single Cell WGA Kit說明書進(jìn)行單個(gè)胚胎全基因組DNA擴(kuò)增。以擴(kuò)增好的單個(gè)胚胎全基因組DNA 0.5～1 μL為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定,方法同“1.5”。在基因編輯靶區(qū)域附近出現(xiàn)雙峰的測(cè)序樣本,進(jìn)一步進(jìn)行克隆測(cè)序,每個(gè)樣本隨機(jī)選擇10個(gè)陽(yáng)性菌落,分析編輯形式及效率。

1.9 脫靶效應(yīng)預(yù)測(cè)及檢測(cè)

使用Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)在線網(wǎng)站對(duì)兩條sgRNA靶序列進(jìn)行脫靶預(yù)測(cè)。每條sgRNA選擇5個(gè)錯(cuò)配數(shù)最少的潛在脫靶位點(diǎn),設(shè)計(jì)OFF-Target 檢測(cè)引物(見表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序,方法參照“1.3.2”。

2 結(jié) 果

2.1 山羊SOCS2基因sgRNA設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

根據(jù)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果,如圖1所示,選擇SOCS2蛋白83號(hào)和96號(hào)氨基酸編碼密碼子附近的兩條sgRNA,靶序列分別為,SOCS2-sg-83:TCTTAACAGATATTGTTAGT,SOCS2-sg-96:TATTCGATGCGAAGATTAGT。采用菌落PCR鑒定sgRNA表達(dá)載體,如圖2所示,條帶大小符合預(yù)期,Sanger測(cè)序表明插入序列及方向正確,載體構(gòu)建成功。

2.2 Cas9 mRNA和sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄

以pX330質(zhì)粒和構(gòu)建的sgRNA表達(dá)載體為模板,PCR制備Cas9和sgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板,純化后的產(chǎn)物如圖3A、3B所示,條帶單一,大小符合預(yù)期;以此模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物如圖3C、3D所示,Cas9 mRNA和SOCS2-sg-83、SOCS2-sg-96主條帶明顯,片段大小符合預(yù)期,說明體外轉(zhuǎn)錄的mRNA質(zhì)量較高。

2.3 sgRNA/Cas9蛋白體外切割活性檢測(cè)

如圖4A所示,對(duì)編輯區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了條帶單一,片段大小符合預(yù)期的切割底物,以此進(jìn)行切割試驗(yàn),結(jié)果如圖4B所示,SOCS2-sg-83與SOCS2-sg-96兩位點(diǎn)均切割完全,在250 bp和500 bp之間出現(xiàn)兩條帶,SOCS2-sg-96位點(diǎn)兩條帶大小比較接近,與預(yù)期SOCS2-sg-83位點(diǎn)切割后條帶為287 bp和390 bp、SOCS2-sg-96位點(diǎn)切割后條帶為319 bp和358 bp相符,表明兩條sgRNA的體外切割效率高,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 顯微注射胚胎的體外發(fā)育

如表3所示,SOCS2-sg-83、SOCS2-sg-96分別注射胚胎152和140枚,48 h后卵裂率分別為75.7%和78.5%,囊胚率分別為55.7%和61.8%,與對(duì)照組無顯著差異。說明本試驗(yàn)中的sgRNA和Cas9 mRNA未影響孤雌胚胎體外發(fā)育。

表2 基因編輯檢測(cè)引物及潛在脫靶位點(diǎn)引物Table 2 Primers of gene editing detection and potential off-target sites detection

圖1 山羊SOCS2基因sgRNA靶位點(diǎn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the sgRNA target sites in the SOCS2 of goat

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～5、7～11. 陽(yáng)性克隆;6. 陰性克隆 M. DL 2000 DNA marker; 1-5, 7-11. Positive colonies; 6. Negative colony圖2 sgRNA表達(dá)載體PCR鑒定Fig.2 Identification of sgRNA expression vectors by PCR

2.5 CRISPR/Cas9編輯胚胎SOCS2基因效果檢測(cè)

從64個(gè)注射SOCS2-sg-83的囊胚中隨機(jī)選取17個(gè)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和PCR檢測(cè),如圖5A所示,產(chǎn)物大小符合預(yù)期,83-1樣本出現(xiàn)兩條帶,疑似出現(xiàn)大片段缺失。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,其中有16個(gè)樣本在PAM區(qū)附近出現(xiàn)雙峰,如圖6所示,說明在此處發(fā)生了基因編輯,效率為94.1%;從68個(gè)注射SOCS2-sg-96的囊胚中隨機(jī)選取16個(gè)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和PCR檢測(cè),如圖5B所示,產(chǎn)物條帶單一,大小符合預(yù)期,測(cè)序后發(fā)現(xiàn)8個(gè)樣本在PAM區(qū)附近出現(xiàn)雙峰,效率為50.0%,見圖6。同時(shí),Cas9/sgRNA介導(dǎo)的突變發(fā)生在PAM區(qū)附近,符合Cas9切割的預(yù)期,進(jìn)一步證明了該過程的靶向性。

A. Cas9體外轉(zhuǎn)錄模板制備:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);B. sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板制備:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);C. Cas9 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);D. sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) A. Production transcription template of Cas9 in vitro: M. DL5000 DNA marker; B. Production transcription template of sgRNA in vitro: M. DL2000 DNA marker; C. Transcription of Cas9 mRNA in vitro: M. DL5000 DNA marker; D. Transcription of sgRNA in vitro: M. DL2000 DNA marker圖3 Cas9和sgRNA體外轉(zhuǎn)錄Fig.3 Cas9 and sgRNA in vitro transcription

A. 切割底物PCR擴(kuò)增;B. sgRNA/Cas9 體外切割活性測(cè)定:M. DL2000 DNA Marker;1. SOCS2-sg-83+Cas9;2. SOCS2-sg-96+Cas9;3. 對(duì)照組 A. Cleavage substrate PCR amplification; B. sgRNA/Cas9 cleavage activity detection in vitro: M. DL2000 DNA marker; 1. SOCS2-sg-83+Cas9;2. SOCS2-sg-96+Cas9;3. Control group圖4 sgRNA/Cas9體外切割活性的檢測(cè)Fig.4 Detection of sgRNA/Cas9 cleavage activity in vitro

表3 顯微注射的山羊孤雌胚胎發(fā)育情況Table 3 Development rate of goat parthenogenetic embryos after microinjection

A. SOCS2-sg-83編輯囊胚PCR鑒定;B. SOCS2-sg-96編輯囊胚PCR鑒定 A. PCR identification of SOCS2-sg-83 edited blastocyst; B. PCR identification of SOCS2-sg-96 edited blastocyst圖5 囊胚中CRISPR/Cas9編輯SOCS2基因效果的PCR檢測(cè)Fig.5 PCR detection of the effect of CRISPR/Cas9 editing SOCS2 gene in blastocysts

A. 對(duì)照組SOCS2-sg-83靶位點(diǎn)附近峰圖;B. 編輯組SOCS2-sg-83靶位點(diǎn)附近峰圖;C. 對(duì)照組SOCS2-sg-96靶位點(diǎn)附近峰圖;D. 編輯組SOCS2-sg-96靶位點(diǎn)附近峰圖 A. Sequencing peak near SOCS2-sg-83 target site in the control group; B. Sequencing peak near SOCS2-sg-83 target site in the edited group; C. Sequencing peak near SOCS2-sg-96 target site in the control group; D. Sequencing peak near SOCS2-sg-96 target site in the edited group圖6 囊胚中CRISPR/Cas9 編輯SOCS2基因效率的測(cè)序鑒定Fig.6 Sequencing identification of CRISPR/Cas9-edited SOCS2 gene efficiency in blastocysts

為了進(jìn)一步研究CRISPR/Cas9在胚胎中的編輯形式,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,結(jié)果顯示(表4),在SOCS2-sg-83編輯的160個(gè)克隆中152個(gè)出現(xiàn)插入、缺失或替換,概率為95.0%,最多的突變類型為插入一個(gè)T(概率為33.8%);移碼突變(3N+1、3N+2)概率為81.3%(130/160)。此外,Indels為3N的克隆中有12個(gè)缺失83號(hào)氨基酸密碼子,可能破壞SH2結(jié)構(gòu)域;有兩個(gè)插入了30個(gè)核苷酸,并引入了終止密碼子(TAA);另一個(gè)插入了36個(gè)核苷酸,也引入終止密碼子(TGA),將在翻譯過程中提前終止。因此,共有90.6%的克隆可能實(shí)現(xiàn)對(duì)SOCS2基因功能的敲除。SOCS2-sg-96編輯的80個(gè)克隆中70個(gè)出現(xiàn)插入、缺失或替換,概率為87.5%,最多的突變類型為缺失4 bp,概率為36.3%(29/80),移碼突變的概率為75.0%(60/80)。另外,在9個(gè)Indels為3N的克隆中,4個(gè)缺失第96號(hào)氨基酸密碼子。共計(jì)80.0%(64/80)的Indels可能實(shí)現(xiàn)對(duì)SOCS2基因功能的敲除(表5)。

2.6 脫靶效應(yīng)分析

根據(jù)Cas-OFFinder在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)SOCS2-sg-83、SOCS2-sg-96的脫靶位點(diǎn),結(jié)果顯示,SOCS2-sg-83的預(yù)測(cè)位點(diǎn)中,錯(cuò)配數(shù)為2的有1個(gè),錯(cuò)配數(shù)為3的有15個(gè),錯(cuò)配數(shù)為4的有143個(gè);SOCS2-sg-96的預(yù)測(cè)位點(diǎn)中,錯(cuò)配數(shù)為3的有2個(gè);錯(cuò)配數(shù)為4的有25個(gè)。每個(gè)sgRNA選擇5個(gè)錯(cuò)配數(shù)最少的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序,靶序列如表6所示,其中小寫字母表示錯(cuò)配堿基。測(cè)序結(jié)果顯示在選取的目標(biāo)脫靶位點(diǎn)上未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象,如圖7、圖8所示。

3 討 論

SOCS2是細(xì)胞因子傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)家族成員,通過其SH2結(jié)構(gòu)域與GHR的磷酸化酪氨酸結(jié)合,阻斷GH與GHR的結(jié)合,發(fā)揮抑制生長(zhǎng)的作用[26]。組成SH2磷酸酪氨酸結(jié)合口袋的5個(gè)氨基酸殘基(Arg73、Ser75、Ser76、Thr83和Arg96)在不同物種間高度保守,發(fā)生突變將影響其結(jié)合能力[9-10]。研究表明,SOCS2的p.R96C突變導(dǎo)致SH2與磷酸酪氨酸無法結(jié)合,SOCS2功能喪失[11]。本試驗(yàn)選擇山羊SOCS2基因序列保守的83和96號(hào)氨基酸附近設(shè)計(jì)sgRNA,試圖在基因編輯造成移碼突變的同時(shí)也能通過破壞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?qū)е禄虻墓δ苄郧贸?提高基因敲除的效率,為高效制備SOCS2基因敲除山羊提供技術(shù)支撐。

表4 SOCS2-sg-83不同編輯形式Table 4 Sequence varieties edited by SOCS2-sg-83

表5 SOCS2-sg-96不同編輯形式Table 5 Sequence varieties edited by SOCS2-sg-96

表6 sgRNA潛在脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 6 Potential off-target site prediction of sgRNA

A.對(duì)照組;B.編輯組 A. Control group; B. Edited group圖7 SOCS2-sg-83脫靶序列測(cè)序分析Fig.7 The off-target analysis of SOCS2-sg-83 by sequencing

A. 對(duì)照組;B. 編輯組 A. Control group; B. Edited group圖8 SOCS2-sg-96 脫靶序列測(cè)序分析Fig.8 The off-target analysis of SOCS2-sg-96 by sequencing

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率相較ZFN、TALENs等技術(shù)大幅提高,但許多研究中基因編輯效率仍在50.0%以下。如尹智等[27]對(duì)豬孤雌囊胚α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)基因的編輯效率為28.1%;尉翔棟等[28]編輯牛胚胎的肌肉生長(zhǎng)抑素(MSTN)基因,編輯效率為15.4%;Zhang等[29]對(duì)綿羊孤雌胚胎的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ⅠB(BMPR-ⅠB)基因進(jìn)行編輯,效率為37.5%;目前,對(duì)SOCS2基因編輯的研究較少,僅見Zhou等[22]利用堿基編輯器對(duì)綿羊SOCS2的p.R96C位點(diǎn)進(jìn)行編輯,效率為25.0%。這對(duì)于制備基因編輯動(dòng)物是不利的,尤其是大型家畜的成本很高,有必要進(jìn)一步提高編輯效率。研究表明,使用相同的基因編輯工具時(shí),基因編輯的效率由sgRNA決定[30-32]。本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)、篩選獲得的SOCS2-sg-83編輯胚胎的效率達(dá)到94.1%,可實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎的高效編輯。除了sgRNA的設(shè)計(jì)外,高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄的sgRNA和Cas9 mRNA也是本試驗(yàn)高編輯效率的重要保障。

基因編輯主要通過移碼突變實(shí)現(xiàn)基因功能敲除[33-35],因?yàn)橐拼a突變會(huì)破壞蛋白質(zhì)的編碼[36]。Zhang等[29]編輯綿羊胚胎BMPR-ⅠB基因,T-A克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)47.9%(78/163)的克隆存在移碼突變。Hu等[37]對(duì)綿羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF5)基因進(jìn)行編輯,造成缺失5 bp的移碼突變,概率為66.7%(2/3),移碼突變破壞了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)并提前引入終止密碼子,基因編輯羊的羊毛長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型(P<0.05)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)sgRNA時(shí),選擇了網(wǎng)站移碼突變預(yù)測(cè)結(jié)果Lindel評(píng)分均為82的SOCS2-sg-83、SOCS2-sg-96,T-A克隆檢測(cè)結(jié)果顯示二者均可使SOCS2基因高效產(chǎn)生移碼突變,其中SOCS2-sg-83引發(fā)移碼突變的概率是81.3%,SOCS2-sg-96則為75.0%,高于66.7%的理論平均值。此外,在非移碼突變的情況下,破壞關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的核心氨基酸將導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能失活,從而實(shí)現(xiàn)基因功能敲除。如綿羊SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域第96號(hào)氨基酸由精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?p.R96C)可導(dǎo)致SOCS2功能失活,本試驗(yàn)中,SOCS2-sg-83引發(fā)的Indels為3 N的克隆中有7.5%(12/160)缺失83號(hào)氨基酸密碼子,可能破壞SH2結(jié)構(gòu)域;另外,有1.3%(2/160)插入了30個(gè)核苷酸,并引入了終止密碼子(TAA),也可實(shí)現(xiàn)SOCS2基因功能性敲除?？傊甋OCS2-sg-83引發(fā)的突變中有90.6%可望實(shí)現(xiàn)SOCS2基因功能性敲除。此外,山羊SOCS2-sg-83在綿羊SOCS2基因SH2結(jié)構(gòu)域中有完全匹配的靶序列,因此也可應(yīng)用于綿羊SOCS2的基因編輯。

基因編輯中,sgRNA可能引導(dǎo)Cas9結(jié)合到與靶DNA相似的序列,產(chǎn)生非特異性編輯導(dǎo)致脫靶[38-40]。為此,本試驗(yàn)對(duì)每條sgRNA選擇5個(gè)錯(cuò)配數(shù)最少的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象,說明SOCS2-sg-83、SOCS2-sg-96特異性較好,與郭日紅[41]、趙為民等[42]的研究結(jié)果類似。此外,本試驗(yàn)中的sgRNA未影響孤雌胚胎發(fā)育,也從側(cè)面印證了sgRNA的特異性。

4 結(jié) 論

本研究利用CRIPSR/Cas9 系統(tǒng)在胚胎水平獲得了高效敲除山羊SOCS2基因的sg-SOCS2-sg-83,編輯效率高達(dá)94.1%,其中90.6%編輯可望造成SOCS2基因功能失活,且未發(fā)現(xiàn)脫靶,表明SOCS2-sg-83可實(shí)現(xiàn)山羊胚胎SOCS2基因的高效、精準(zhǔn)編輯和敲除,為高效制備SOCS2基因敲除山羊,培育快長(zhǎng)型肉用山羊奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。