反芻動(dòng)物瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)研究進(jìn)展

范定坤,張吉賢,付域澤,馬 濤,畢研亮,張乃鋒

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

微生物廣泛存在于動(dòng)物消化道內(nèi),與宿主形成共生關(guān)系,并據(jù)此執(zhí)行基本的生理功能。反芻動(dòng)物瘤胃微生物相較于其他動(dòng)物更為復(fù)雜多樣,具有纖維分解、脂肪降解、植物蛋白水解、微生物蛋白合成等功能[2]。此外,瘤胃菌群產(chǎn)生的代謝物如揮發(fā)性脂肪酸等能夠通過(guò)調(diào)控宿主基因表達(dá)促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育,與宿主生理功能密切相關(guān)[3]。然而到目前為止,瘤胃環(huán)境中不同細(xì)菌占據(jù)的生態(tài)位仍不明確,細(xì)菌多樣性及數(shù)量仍然是基于測(cè)序算法估測(cè)得到的。在現(xiàn)有1 300個(gè)瘤胃基因組的基礎(chǔ)上[4],Stewart等[1]通過(guò)宏基因組測(cè)序增加了4 941個(gè)新的宏基因組數(shù)據(jù),而且仍有未知的微生物存在于反芻動(dòng)物瘤胃中。目前,瘤胃中可培養(yǎng)微生物僅有500余株,不足瘤胃微生物總數(shù)的10%[4],嚴(yán)重阻礙了基于菌株水平對(duì)瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能的研究。培養(yǎng)組學(xué)是一種采用多種培養(yǎng)條件,結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)鑒定菌種的培養(yǎng)方法。高通量、并行化的培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)在瘤胃微生物中的應(yīng)用,為在菌株水平上研究重點(diǎn)菌株功能及其與宿主互作關(guān)系提供了新的視角。本文從瘤胃微生物的組成結(jié)構(gòu)出發(fā),系統(tǒng)闡述了培養(yǎng)組學(xué)在反芻動(dòng)物瘤胃微生物培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀、挑戰(zhàn)及展望,以期為進(jìn)一步探索瘤胃微生物多樣性、補(bǔ)充瘤胃菌株資源提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 反芻動(dòng)物瘤胃微生物的組成與結(jié)構(gòu)

瘤胃微生物是動(dòng)物界迄今為止所描述的最多樣化的消化道生態(tài)系統(tǒng)之一,其中包括1010～1011CFU·g-1的細(xì)菌、108～109CFU·g-1的古菌、105～106個(gè)·g-1的原蟲(chóng)、103～104CFU·g-1的真菌以及未知含量的病毒[1]。在出生后的24 h,反芻幼畜的瘤胃壁開(kāi)始富集需氧菌和兼性厭氧菌群,并占據(jù)主導(dǎo)地位[5]。之后的2周內(nèi),瘤胃細(xì)菌的種類和豐度發(fā)生極大變化,需氧菌和兼性厭氧菌被逐步取代,菌群相對(duì)豐度以擬桿菌門升高和變形菌門降低為主要特征,厚壁菌門內(nèi)部則從鏈球菌屬向普雷沃氏菌屬轉(zhuǎn)變[6-8]。成年反芻動(dòng)物瘤胃菌群的構(gòu)成較為穩(wěn)定,主要包括厚壁菌門、擬桿菌門以及變形菌門,與其幼齡階段的菌群組成有明顯差異[2]。厚壁菌門和擬桿菌門是瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌群,并且在纖維降解中發(fā)揮了重要作用[2]。例如,厚壁菌門的黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)等是重要的纖維素降解菌[9]。除了纖維降解菌,瘤胃微生物優(yōu)勢(shì)菌還包括能夠?qū)⒅参镄缘鞍滓约胺堑鞍椎D(zhuǎn)化為微生物蛋白供宿主利用的蛋白質(zhì)降解菌,如Ruminobacteramylophilus、Eubacteriumrumination、Streptococcusbovins、Bacteroideruminicola等[10]。出自Lactobacillus、Streptococcus、Enterococcus和Pediococcus菌屬的乳酸相關(guān)菌[10],以及通過(guò)氫轉(zhuǎn)移與其他瘤胃微生物合作維持瘤胃pH穩(wěn)定的產(chǎn)甲烷菌[3]等在調(diào)節(jié)宿主消化系統(tǒng)和瘤胃內(nèi)環(huán)境方面起重要作用。某些低豐度菌群在功能上也需要引起重視。纖維桿菌門的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)僅占細(xì)菌多樣性的0.5%,然而在大多數(shù)核心微生物組研究中均有報(bào)道[11-12]。Fibrobactersuccinogenes以纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)生的可溶性糖和琥珀酸鹽能夠促進(jìn)其他微生物組的代謝,因而被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的纖維降解物種[13]。古菌域通常在瘤胃中的占比較小,僅占瘤胃微生物總豐度的1.7%,其中包括Methanosarcina、Methanomicrobium、Methanobrevibacter、Methanobacterium等產(chǎn)甲烷菌[10],但產(chǎn)甲烷菌仍然普遍存在于反芻動(dòng)物瘤胃中,因此屬于反芻動(dòng)物核心菌群的一部分[12]。

前人采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法分離獲得了部分瘤胃可培養(yǎng)菌株[14],如RuminococcusflavefaciensWQ-1[15]。Hungate1000庫(kù)中保藏有410株瘤胃來(lái)源的微生物,覆蓋了82個(gè)瘤胃菌屬[3]。此外,包括美國(guó)ATCC菌種保藏中心、哥德堡大學(xué)CCUG菌株保藏中心、德國(guó)DSMZ保藏中心、日本JCM菌株保藏中心、比利時(shí)BCCM菌種保藏中心、英國(guó)NCTC菌種保藏中心在內(nèi)的國(guó)際菌種保藏中心共保藏了117種瘤胃微生物純培養(yǎng)物[16]。Liu等[17]通過(guò)原位培養(yǎng)法分離出包括Pseudomonasstutzeri、Proteuspenneri、Klebsiellapneumoniae等在內(nèi)的12種28株尿素分解菌,為進(jìn)一步探索微生物參與瘤胃氮代謝提供有效幫助。de Oliveira等[18]從瘤胃中分離出可產(chǎn)生抗菌肽的鏈球菌,并通過(guò)比較基因組學(xué)表征了它們的抗菌活性以及與瘤胃環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的遺傳特征。盡管如此,瘤胃微生物的分離培養(yǎng)尚處于探索階段,能夠純化培養(yǎng)的菌種占比較小,因此需要借助現(xiàn)代培養(yǎng)組學(xué)等技術(shù)手段加大瘤胃功能菌群分離培養(yǎng)和鑒定的工作力度。

2 培養(yǎng)組學(xué)的技術(shù)發(fā)展概況

培養(yǎng)組學(xué)是利用多種培養(yǎng)條件進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),并通過(guò)MALDI-TOF和16S rRNA鑒定物種的新方法。培養(yǎng)組學(xué)具有并行化、可視化、活菌保藏等優(yōu)勢(shì),同時(shí)也有篩選不確定性高、培養(yǎng)條件復(fù)雜等缺點(diǎn),如圖1所示。作為一種研究復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的全新方法,培養(yǎng)組學(xué)在傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)上開(kāi)創(chuàng)了新的試驗(yàn)方法和研究技術(shù),使其具有高度并行和高通量的特點(diǎn),因而被賦予了“組學(xué)”地位。此前,受限于培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)的滯后,大多數(shù)微生物的分離培養(yǎng)并未成功,人們普遍認(rèn)為超過(guò)80%的未分類的細(xì)菌無(wú)法被分離培養(yǎng),直至Lagier等[19-20]引入培養(yǎng)組學(xué)技術(shù),使得細(xì)菌物種的分離培養(yǎng)和基因組測(cè)序成為可能。Lagier等[21]采用212種不同的培養(yǎng)條件成功從人類腸道獲得1 057種細(xì)菌,包括334種已知但未被分離培養(yǎng)的細(xì)菌和197個(gè)潛在新物種。培養(yǎng)組學(xué)微生物分離和培養(yǎng)的技術(shù)主要采取了以下兩種方式:1)通過(guò)基于液滴的微流體將水相中的游離細(xì)胞分裝在油乳液中;2)在物理微孔或微閥的小型陣列中對(duì)單個(gè)微生物進(jìn)行基于有限空間的分區(qū)。

圖1 培養(yǎng)組學(xué)的優(yōu)、缺點(diǎn)Fig.1 The strengths and weaknesses of culturomics

2.1 基于液滴微流體的培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)

基于液滴的微流體依靠的是兩相微通道流體捕捉分散在球形顆粒中的單個(gè)細(xì)胞或分子,這些顆粒由生物相容性油包裹,由于其在高通量、并行化、標(biāo)準(zhǔn)化和動(dòng)態(tài)過(guò)程控制方面的優(yōu)勢(shì),該技術(shù)被視為單細(xì)胞微生物分離培養(yǎng)工作流程的關(guān)鍵組成部分[22]。然而,細(xì)胞的分離過(guò)程符合泊松分布,每個(gè)微液滴包裹的細(xì)胞數(shù)量無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)知,只有部分微液滴僅包含單細(xì)胞,而更多的微液滴是空的或包含兩個(gè)及以上數(shù)量的細(xì)胞[23-24]。目前,提高分離單細(xì)胞的概率通常是通過(guò)樣品的無(wú)限稀釋來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

瘤胃、腸道等厭氧生態(tài)環(huán)境中存活的微生物在利用微流體分離、培養(yǎng)、分析單個(gè)微生物細(xì)胞時(shí)會(huì)面臨額外的挑戰(zhàn),即樣品處理、生長(zhǎng)檢測(cè)和微流控分選需要在無(wú)氧條件下進(jìn)行。由于與流式細(xì)胞儀或分選裝置耦合的微流控管道難以集成到標(biāo)準(zhǔn)厭氧工作站中,目前已開(kāi)發(fā)了一些厭氧條件下微生物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)的替代方法。例如,微流控條紋板(microfluidic streak plate,MSP)將微流控與條紋板技術(shù)相結(jié)合,微流控產(chǎn)生的液滴由均勻的油阻隔開(kāi),并允許手動(dòng)或自動(dòng)將其移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)[25]。MSP在好氧和厭氧條件下均能從食木白蟻腸道微生物組中分離出單細(xì)胞細(xì)菌[26]。最近,MSP單細(xì)胞培養(yǎng)被整合到高通量功能篩選工作流程中,如咪唑啉酮降解細(xì)菌的定向選擇[27]。

MicDrop將厭氧封裝培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)菌微流體液滴與Illumina MiniSeq測(cè)序相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)間接非連續(xù)生長(zhǎng)監(jiān)測(cè),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)厭氧環(huán)境下的微生物培養(yǎng)和鑒定[28]。其原理是將產(chǎn)生的16S rDNA序列變體(sequence variant,SV)在含有相同細(xì)菌分類群的微液滴之間共享,通過(guò)16S rDNA測(cè)序和qPCR數(shù)據(jù)在SV水平擬合生長(zhǎng)曲線,可以在厭氧工作流程之外跟蹤單個(gè)物種的生長(zhǎng)。MicDrop的高通量培養(yǎng)可以進(jìn)行功能性篩選,評(píng)估在選擇性培養(yǎng)條件下厭氧富集的微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力、分類學(xué)特性和微液滴中的單菌豐度。Watterson等[29]開(kāi)發(fā)了一種基于液滴的微流控系統(tǒng),并且集成了顯微檢測(cè),將分離、培養(yǎng)和分選三種基本功能結(jié)合在一起,通過(guò)設(shè)定不同的閾值標(biāo)準(zhǔn),可以將單個(gè)細(xì)菌擴(kuò)繁而成的菌落進(jìn)行選擇性地收集和傳代,從而進(jìn)行分類和功能表征。

相較于厭氧培養(yǎng),有氧的工作條件可以實(shí)現(xiàn)空間要求更高的復(fù)雜微流控設(shè)置,以進(jìn)行深入的功能篩選。在這方面的創(chuàng)新型進(jìn)展之一是將生物相容性雙水包油乳化液滴微流控技術(shù)(microfluidic double water-in-oil-in-water emulsion droplet technology,MDE)和熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)相結(jié)合,以研究熒光標(biāo)記的目標(biāo)菌株和潛在功能菌株之間單細(xì)胞水平的微生物相互作用[30]。Terekhov等[31]通過(guò)MDE-FACS將綠色熒光蛋白標(biāo)記的金黃色葡萄球菌與微生物菌群混懸液共包封,鑒定了具有潛在抗金黃色葡萄球菌生物活性的代謝物。

2.2 基于分區(qū)的微列陣培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)

基于分區(qū)的培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)是能夠提供更大的微生物培養(yǎng)空間,可以將單細(xì)胞擴(kuò)展到更大體積的高密度微菌落。與微流控相比,從離散的微室中分離選定的微菌落通常更直接。而原位培養(yǎng)概念的引入使得基于分區(qū)的微生物培養(yǎng)得以進(jìn)一步發(fā)展。原位培養(yǎng)是通過(guò)模擬自然環(huán)境,提供微生物生存的化學(xué)成分的微生物培養(yǎng)方法。該方法可以最大限度的還原微生物原位生態(tài)環(huán)境,簡(jiǎn)化人工微生物培養(yǎng)條件的探索。原位培養(yǎng)法使用了選擇通過(guò)性膜以允許微生物與其原棲息環(huán)境進(jìn)行有限的接觸,納入其必需生長(zhǎng)因子的同時(shí)實(shí)現(xiàn)微生物之間的隔絕,最終富集形成理想的純化菌落。此外,目標(biāo)微生物產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制代謝物可以經(jīng)選擇性通過(guò)屏障結(jié)構(gòu)進(jìn)行自由擴(kuò)散,避免了局部聚集導(dǎo)致的培養(yǎng)環(huán)境惡化[32]。Liu等[17]使用透析袋作為選擇通過(guò)性膜將細(xì)菌進(jìn)行瘤胃液包埋實(shí)現(xiàn)原位培養(yǎng),成功分離出28株含有脲酶基因的細(xì)菌?；谠慌囵B(yǎng)法的原理,Kaeberlein等[33]將擴(kuò)散室培養(yǎng)引入微生物研究用于培養(yǎng)“不可培養(yǎng)”的微生物,并成功獲得2株菌株。然而,擴(kuò)散室培養(yǎng)仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的高通量微生物培養(yǎng),極大限制了其適用性。Nichols等[34]研究并設(shè)計(jì)了由數(shù)百個(gè)微室構(gòu)成的隔離芯片(iChip),可將單個(gè)微生物細(xì)胞裝入微室實(shí)現(xiàn)高通量的特異性富集培養(yǎng)。滑移芯片(slipchip)是兩塊由單細(xì)胞微室和流體導(dǎo)管組成的微流控芯片嵌合而成的,可用于消化道厭氧菌的培養(yǎng)[35]?；菩酒梢晕锢砬懈钗⑸锶郝?一部分用于16S rRNA測(cè)序,另一部分用于目標(biāo)微生物的保存和擴(kuò)繁[35]。

除了需要分離培養(yǎng)微生物之外,人們逐漸開(kāi)始對(duì)捕捉單個(gè)微生物在傳代過(guò)程中的進(jìn)化產(chǎn)生興趣。單細(xì)胞分離延時(shí)成像技術(shù)(single-cell isolation following timelapse imaging,SIFT)通過(guò)多代延時(shí)顯微鏡追蹤空間受限活細(xì)胞,該技術(shù)能夠揭示目標(biāo)微生物的生理狀況和其對(duì)非生物刺激反饋的基本信息[36]。在兩層SIFT微流控芯片中,第一個(gè)流動(dòng)層用于細(xì)胞分離,而第二層集成了一系列微流控閥門、流動(dòng)通道和用于收集芯片外單細(xì)胞的光鑷[36]。目前,SIFT僅應(yīng)用于單個(gè)細(xì)菌的無(wú)損多代成像和追蹤以及分離和擴(kuò)繁培養(yǎng),但該技術(shù)也可用于高通量分離和篩選動(dòng)物微生物[36]。

3 培養(yǎng)組學(xué)在瘤胃微生物培養(yǎng)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

當(dāng)前培養(yǎng)組學(xué)在瘤胃微生物的研究中應(yīng)用較少,但已有的研究已經(jīng)在一定程度上揭示了其在縮小瘤胃菌群物種未知范圍、探知瘤胃微生物功能等方面的巨大潛力。瘤胃微生物基因組學(xué)網(wǎng)絡(luò)(Rumen Microbial Genomics Network)在全球研究聯(lián)盟家畜研究小組(Livestock Research Group of the Global Research Alliance)的支持下成立,并將生成瘤胃微生物基因組目錄Hungate1000作為主要目標(biāo)以期推動(dòng)反芻動(dòng)物的高效生產(chǎn)并減少溫室氣體排放[4]。Hungate1000目錄中的微生物覆蓋9門48科82屬,Seshadri等[4]選擇410株可培養(yǎng)的瘤胃微生物進(jìn)行基因組測(cè)序,并與91株公開(kāi)的可培養(yǎng)菌株的基因組聯(lián)合分析,構(gòu)建了Hungate1000瘤胃微生物基因組目錄(包括480株細(xì)菌和21株古菌)。在瘤胃中占據(jù)主導(dǎo)地位的瘤胃厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)貢獻(xiàn)了Hungate1000基因組目錄的大部分,其中Lachnospiraceae家族是最大的單一類群(32.3%);可培養(yǎng)的古菌主要來(lái)自Methanobrevibacter屬和Methanomassiliicoccales目[4]。Hungate1000中大多數(shù)可培養(yǎng)的微生物來(lái)自于牛(70.9%)或羊(17.6%),其余可培養(yǎng)微生物則來(lái)自于包括駱駝在內(nèi)的其他反芻動(dòng)物。de Oliveira等[18]從牛瘤胃中分離到463株細(xì)菌,其中5株細(xì)菌含有高度保守的生物合成基因簇,與瘤胃鏈球菌中抗菌肽的產(chǎn)生有關(guān)。Liu等[17]通過(guò)原位培養(yǎng)法模擬瘤胃環(huán)境,從瘤胃微生物菌群中分離出404株細(xì)菌,測(cè)序后發(fā)現(xiàn)28株具有脲酶基因的新物種在能量代謝與氮代謝方面發(fā)揮重要作用。然而,仍有已被基因組測(cè)序探知的瘤胃微生物尚未被分離培養(yǎng)[4]。Zehavi等[16]研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基類型、樣品稀釋度、系統(tǒng)發(fā)育等多種因素能夠影響瘤胃微生物的可培養(yǎng)性,其中樣品稀釋能夠顯著降低瘤胃微生物可培養(yǎng)性對(duì)相對(duì)豐度的依賴。另外,微生物的豐度和系統(tǒng)發(fā)育是決定瘤胃微生物可培養(yǎng)性的主要因素[16]。瘤胃微生物與多糖降解、蛋白質(zhì)的水解與合成、纖維素的降解、瘤胃解毒等功能密切相關(guān),因此基于培養(yǎng)組學(xué)的瘤胃微生物純化培養(yǎng)能夠分離某些關(guān)鍵功能的標(biāo)志性菌株,為深入了解瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)提供新視角[1]。

4 培養(yǎng)組學(xué)在瘤胃微生物培養(yǎng)中的挑戰(zhàn)

4.1 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和生長(zhǎng)條件的鑒定

反芻動(dòng)物瘤胃中的古菌和部分細(xì)菌難以分離培養(yǎng)的事實(shí)早已形成共識(shí)。在純化培養(yǎng)瘤胃微生物時(shí),所需的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)可用于分離或富集特定菌株。然而,部分瘤胃微生物的培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)因子(維生素、氨基酸、腐殖酸、無(wú)機(jī)元素等)要求極為嚴(yán)苛,因此在實(shí)驗(yàn)室中探索菌株生長(zhǎng)條件具有一定挑戰(zhàn)性。對(duì)于難以適應(yīng)富營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的瘤胃微生物,可使用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)[32]。此外,一些無(wú)機(jī)物如金屬化合物、含硫化合物、含氮化合物參與了微生物生理代謝的微生態(tài)循環(huán),但由于其濃度低于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)極限,也成為了瘤胃微生物培養(yǎng)的重要阻礙。對(duì)于部分微生物而言,它們所需的寬泛的底物類別可從基因組序列中推斷出來(lái),但仍然無(wú)法精準(zhǔn)確定每個(gè)底物類別中的所需物質(zhì)。這種可變性在一定程度上反映了基于底物基質(zhì)和生長(zhǎng)條件分離培養(yǎng)微生物的痛點(diǎn)和難點(diǎn)。

4.2 休眠期微生物的復(fù)蘇

瘤胃微生物種群在受到環(huán)境脅迫時(shí),部分成員能夠以存活為目的通過(guò)表型變異進(jìn)入休眠[37-38]。雖然目前有大量關(guān)于微生物休眠的文獻(xiàn)報(bào)道,但人們對(duì)其休眠與復(fù)蘇的過(guò)渡機(jī)制仍知之甚少[37]。有研究表明,微生物休眠期的結(jié)束可能受到某些信號(hào)分子的影響,過(guò)程具有隨機(jī)性[38]。此外,微生物可能已經(jīng)進(jìn)化出不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的休眠與復(fù)蘇,這也使得瘤胃微生物分離培養(yǎng)變得更加復(fù)雜[39]。

4.3 菌群的共生關(guān)系

部分微生物群落成員之間通過(guò)直接或間接交換必要的生物分子形成種間依賴的共生關(guān)系。然而,人工分離培養(yǎng)微生物時(shí)往往會(huì)忽視這種共生的微生態(tài)關(guān)系,導(dǎo)致分離培養(yǎng)的目標(biāo)單菌無(wú)法正常生長(zhǎng)和存活。產(chǎn)氫細(xì)菌(H2-producing bacteria)和氫利用產(chǎn)甲烷菌(H2-consuming methanogens)是典型的共生微生物,Guzman等[40]使用電生物化學(xué)系統(tǒng)模擬產(chǎn)甲烷菌在共生培養(yǎng)中的氫氣消耗,成功富集Syntrophomonaszehnderi,但仍不能使其從產(chǎn)甲烷菌中完全分離出來(lái)進(jìn)行單菌純化培養(yǎng)。此外,Diapherotrites、Parvarchaeota、Aenigmarchaeota、Nanohaloarchaeota、Nanoarchaeota(DPANN)古菌和Candidate phyla radiation(CPR)細(xì)菌的基因組較小,通常以未分離的小細(xì)胞共生體的形式被檢測(cè)到,它們主要以共生形式或寄生形式依賴于其他宿主微生物存活[39]。因此,以組合的方式進(jìn)行微生物分選,可能是突破微生物分離培養(yǎng)瓶頸的契機(jī)。

4.4 菌群的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系

在瘤胃復(fù)雜的微生物群落中,高豐度微生物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的廣泛適應(yīng)性提高了其分離及純化培養(yǎng)的成功率[41]。菌群的競(jìng)爭(zhēng)性抑制使分離低豐度瘤胃微生物的過(guò)程更加復(fù)雜。目前常用的分離培養(yǎng)低豐度微生物的方法是利用基因組測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)的最佳環(huán)境,然后對(duì)其進(jìn)行純化培養(yǎng)。然而,即使低豐度微生物被成功分離,在隨后的富集試驗(yàn)中,它們?nèi)杂锌赡鼙簧L(zhǎng)速率更快的其他微生物競(jìng)爭(zhēng)性地取代,導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。近年來(lái),從樣本中分離單個(gè)微生物并接種到培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)已成為分離培養(yǎng)低豐度微生物的有效方法[41-43]。

5 培養(yǎng)組學(xué)在瘤胃微生物培養(yǎng)中的展望

培養(yǎng)組學(xué)能夠增加已知微生物的種類和數(shù)量,填補(bǔ)微生物學(xué)未知領(lǐng)域的空白。Zehavi等[16]通過(guò)研究培養(yǎng)基類型、樣品稀釋度、系統(tǒng)發(fā)育等因素與培養(yǎng)瘤胃微生物之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)約23%瘤胃微生物是潛在可培養(yǎng)的且主要來(lái)源于低豐度微生物種群。迄今為止,反芻動(dòng)物瘤胃微生物的多樣性研究尚不充分,培養(yǎng)組學(xué)的出現(xiàn)可為未知瘤胃微生物的分離鑒定提供新方法。

培養(yǎng)組學(xué)不僅能夠拓展微生物種質(zhì)資源,而且可以校正特定環(huán)境下微生物群的組成結(jié)構(gòu)及菌群豐度。宿主生理健康及疾病與消化道菌群組成的變化密切相關(guān),可通過(guò)移植培養(yǎng)組學(xué)分離的菌株來(lái)調(diào)控宿主菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而發(fā)揮重塑菌群穩(wěn)態(tài)的重要作用,以期維護(hù)腸道屏障,改善腸道健康。鑒于微生物培養(yǎng)組學(xué)在恢復(fù)菌群平衡和校正微生物組成的潛在作用,分離培養(yǎng)與疾病相關(guān)的關(guān)鍵微生物可能會(huì)對(duì)特定環(huán)境下的微生物對(duì)話機(jī)制提供見(jiàn)解。

抗生素可以廣泛用于由致病菌感染引起的疾病治療,其主要來(lái)源是細(xì)菌,因此利用培養(yǎng)組學(xué)深入挖掘細(xì)菌基因庫(kù)與參考菌株庫(kù)對(duì)新型抗生素的發(fā)現(xiàn)具有重要作用[44]。研究表明,反芻動(dòng)物瘤胃中存在部分能夠分泌抗菌肽的功能性菌株,如StreptococcilutetiensisUFV09,StreptococcilutetiensisUFV11,StreptococcilutetiensisUFV58等,分離培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌可能是開(kāi)發(fā)新型抗菌肽的有效途徑[18]。因此,培養(yǎng)組學(xué)提供的廣泛的未知微生物類群和每個(gè)物種的多個(gè)菌株,可以作為新型抗生素的潛在來(lái)源為治療細(xì)菌感染性疾病開(kāi)拓新思路。

6 小 結(jié)

培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)在瘤胃微生物分離培養(yǎng)中的應(yīng)用為擴(kuò)充瘤胃菌群數(shù)據(jù)庫(kù)、探索瘤胃微生物的組成和功能,以及后續(xù)通過(guò)調(diào)節(jié)瘤胃微生物來(lái)改善瘤胃健康帶來(lái)了新機(jī)遇。然而,瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)尚處于起步階段,仍面臨諸多挑戰(zhàn),包括培養(yǎng)條件嚴(yán)苛、生存/競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系復(fù)雜、休眠復(fù)蘇機(jī)理不清等,需要進(jìn)一步研究以突破相關(guān)技術(shù)瓶頸。未來(lái)建議靈活運(yùn)用并持續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)方案,注重多組學(xué)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,豐富瘤胃微生物圖譜、篩選標(biāo)志菌株及產(chǎn)物,并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用。隨著瘤胃微生物與宿主互作研究成為熱點(diǎn),瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)具有廣闊的應(yīng)用前景。