熱應(yīng)激對雄性哺乳動物生殖機(jī)能影響的研究

肖藝梅,王勝男,許悅雯,何曉琳,尹福泉

(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)學(xué)院,湛江 524088)

炎熱的環(huán)境條件可能會對動物的繁殖力產(chǎn)生不利影響,當(dāng)調(diào)節(jié)體溫的正常生理機(jī)制無法維持動物體溫的相對恒定時,動物就會產(chǎn)生熱應(yīng)激(heat stress,HS)[1]。睪丸作為雄性動物產(chǎn)生精子和分泌雄激素的重要器官,其溫度通常需要保持在低于核心體溫2～7 ℃[2]。絕大多數(shù)哺乳動物的睪丸位于體腔外部以確保正常精子的產(chǎn)生,當(dāng)哺乳動物未能保持睪丸溫度時會損害精子發(fā)生,并且對精子活力、形態(tài)和生育能力產(chǎn)生有害影響,其受影響的嚴(yán)重程度與熱暴露的強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時間有關(guān)[3-4]。本文旨在綜述睪丸的溫度調(diào)節(jié)機(jī)制、HS對睪丸細(xì)胞的影響、HS對精子質(zhì)量的影響,以期為HS對哺乳動物雄性生殖的不利影響研究提供參考。

1 睪丸溫度調(diào)節(jié)機(jī)制

影響睪丸溫度調(diào)節(jié)的主要因素有陰囊結(jié)構(gòu)、肌肉活動以及熱交換機(jī)制。從生理結(jié)構(gòu)上來看,陰囊具有皮膚薄、皮下脂肪少、汗腺密集等特點。這些陰囊結(jié)構(gòu)特性使睪丸可以通過脈動的方式釋放汗液,而汗液的蒸發(fā)可以促進(jìn)睪丸冷卻。在公牛和公羊中,陰囊汗腺受交感腎上腺素能神經(jīng)支配并受腎上腺激素影響[5-6]。此外,當(dāng)動物處于較高溫度時,其陰囊內(nèi)層的內(nèi)膜肌與精索中的提睪肌松弛,使睪丸遠(yuǎn)離核心軀體并通過調(diào)節(jié)陰囊表面積來幫助睪丸降溫[7]。睪丸溫度的熱交換機(jī)制也有利于睪丸溫度的維持,當(dāng)睪丸內(nèi)的靜脈血流經(jīng)陰囊皮膚表層時,會迅速散去熱量,使靜脈血液處于較低溫度,當(dāng)溫度較高的動脈血進(jìn)入睪丸前,會通過精索靜脈叢與低溫的靜脈血進(jìn)行熱量交換,使進(jìn)入睪丸的動脈血降溫,維持睪丸內(nèi)溫度穩(wěn)定[8]。通過這3種睪丸體溫調(diào)節(jié)機(jī)制的協(xié)同作用,共同維持適宜、穩(wěn)定的睪丸溫度,保障雄性動物正常的繁殖機(jī)能。

2 熱應(yīng)激對睪丸細(xì)胞的影響

目前,HS對哺乳動物睪丸細(xì)胞的影響研究大多數(shù)都是基于嚙齒動物實驗?zāi)Ｐ秃筒糠秩祟惒G丸細(xì)胞試驗,HS模型一般可分為兩大類:整體熱暴露(人工氣候試驗室)或睪丸局部熱刺激(主要包含4種方式:手術(shù)誘導(dǎo)隱睪、陰囊絕緣、陰囊短期水浴加熱和睪丸微波輻射)[9]。盡管生殖細(xì)胞比支持細(xì)胞(sertoli cells,SCs)和間質(zhì)細(xì)胞(leydig cell,LCs)對溫度更加敏感,但無論采用何種HS模型,睪丸HS均會對所有類型的睪丸細(xì)胞造成不良影響[4],如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、血睪屏障(blood-testis barrier,BTB)破壞、激素分泌紊亂等。

2.1 睪丸生殖細(xì)胞

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)雖然會受到HS的影響,但很少引起SSCs凋亡,并能隨著時間推移自動恢復(fù),這也是夏季結(jié)束后公畜精液品質(zhì)能夠恢復(fù)的原因。Wang等[10]對體外培育的小鼠SSCs進(jìn)行HS處理后(43 ℃,45 min)發(fā)現(xiàn),HS改變了SSCs的蛋白折疊、蛋白定位和自我更新,顯著抑制SSCs的增殖但并未引起SSCs的凋亡,并通過JAK-STAT 和PI3K-AKT信號通路參與HS處理后SSCs的S期細(xì)胞周期停滯。此外,HS還可以通過p53、核糖體和碳代謝通路參與SSCs分化抑制過程,導(dǎo)致SSCs分化相關(guān)基因c-kit、stra8、Rec8、Sycp3和Ovol1的表達(dá)下調(diào)[11]。相較于其他類型的生殖細(xì)胞,SSCs對HS的抗性在一定程度上有利于緩解HS對雄性動物生育力的不利影響,但尚不清楚是否還有其他信號通路為SSCs提供了抗HS的能力。

HS后細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平顯著升高,并且睪丸細(xì)胞內(nèi)血紅素氧合酶1 (heme oxygenase 1,HMOX1)和抗氧化酶,即谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase1,GPX1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶α(glutathione S-transferase alpha,GSTA)和超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase 1,SOD1)發(fā)生顯著上調(diào),表明HS可誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12-13]。氧化應(yīng)激是造成睪丸HS損傷的主要原因,對哺乳動物的精子發(fā)生具有非常不利的影響,并最終通過細(xì)胞凋亡或DNA損傷導(dǎo)致雄性動物亞不育或不育[14-15],其中粗線期精母細(xì)胞、圓形精細(xì)胞和附睪精子最易受影響[2,4]。在精子發(fā)生的過程中,生精細(xì)胞由于分裂頻繁和缺乏SOD1,比其他類型的睪丸細(xì)胞更易受到HS損傷[16]。近期的研究發(fā)現(xiàn),HS導(dǎo)致雄性不育的潛在機(jī)制可能是通過特異性鈣通道干擾精子發(fā)生。Abd El-Emam等[17]對大鼠陰囊HS后發(fā)現(xiàn)(43 ℃,30 min,連續(xù)6 d對大鼠陰囊水浴加熱),CatSper-1和CatSper-2的表達(dá)顯著下調(diào)、類固醇生成調(diào)節(jié)因子3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)和促凋亡蛋白BAX(BCL2 associated X protein)的表達(dá)顯著上調(diào),進(jìn)而觸發(fā)生殖細(xì)胞凋亡。但其詳細(xì)的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

2.1.1 氧化應(yīng)激 ROS是具有至少一個不成對電子的氧分子,因此具有高度不穩(wěn)定性,并且對脂質(zhì)、氨基酸和核酸具有極高的活性[18]。HS誘導(dǎo)所產(chǎn)生的過量ROS對生殖細(xì)胞的凋亡和DNA損傷存在重要影響[19]。在HS誘導(dǎo)人類精子損傷模型中,HS所導(dǎo)致的精子質(zhì)量降低與ROS增加和隨后的脂質(zhì)過氧化有關(guān)[20]。而精子脂質(zhì)的過氧化會導(dǎo)致質(zhì)膜完整性喪失、線粒體膜功能障礙、染色質(zhì)降解,以及精子形態(tài)異常,最終影響精液質(zhì)量[21]。此外,一些學(xué)者認(rèn)為:睪丸溫度升高會增加睪丸代謝和維持睪丸有氧代謝所需的氧消耗,而流向睪丸的血液不會隨著睪丸溫度的升高而增加,當(dāng)睪丸血流不足以維持其氧合水平時,睪丸組織出現(xiàn)缺氧進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激,因此睪丸缺氧是HS誘導(dǎo)精子形態(tài)和功能改變的根本原因[22-23]。但是Rizzoto與Kastelic[24]近期研究發(fā)現(xiàn),隨著氧氣濃度的減少,睪丸可以通過增加睪丸血流量和氧氣攝取來維持睪丸組織氧氣的輸送和攝取,阻止了睪丸缺氧和無氧代謝。因此對HS引起的睪丸氧化應(yīng)激提出了新的觀點:睪丸溫度升高伴有睪丸血流量增加,沒有睪丸缺氧跡象。總之,對HS所引起的睪丸氧化應(yīng)激的原因還有待進(jìn)一步研究。

2.1.2 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡包括外在途徑(死亡受體Fas途徑)和內(nèi)在途徑(線粒體途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑),不同的刺激類型引起的細(xì)胞凋亡途徑不同[25]。腫瘤抑制因子p53作為一種潛在的HS誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡因子,睪丸HS后其活性升高,并且可以激活兩種不同的細(xì)胞凋亡機(jī)制:內(nèi)在分子途徑和外在分子途徑[4,26-28]。以小鼠精母細(xì)胞凋亡為例(圖1),內(nèi)在分子凋亡途徑涉及抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員的激活,包括BAX對HS做出反應(yīng),在細(xì)胞內(nèi)重新定位到近核區(qū)域并在線粒體中積累,而Bcl-2被磷酸化并失去活性。隨后BAX整合到線粒體外膜,引起構(gòu)象變化,并將細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyt-C與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor,Apaf-1)相互作用,形成激活caspase級聯(lián)反應(yīng)的復(fù)合物,觸發(fā)細(xì)胞凋亡。在凋亡外在分子途徑中,HS通過p53將死亡受體Fas與其配體Fas L連接起來,再通過招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域FADD形成復(fù)合物,該復(fù)合物與caspase-8啟動子結(jié)合,觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng),最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡[15,28-31]。此外,HS還可以通過獨(dú)立于p53信號外的其他途徑,直接激活p38-MAPK信號通路來激活精母細(xì)胞凋亡[28]。

圖1 小鼠精母細(xì)胞凋亡途徑[15,28-31]Fig.1 Apoptosis pathway of mouse spermatocytes[15,28-31]

2.1.3 DNA損傷 DNA損傷也是HS誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡的原因之一[32]。有研究發(fā)現(xiàn),對大鼠陰囊HS后(42 ℃,陰囊水浴加熱30 min),粗線期和雙線期的初級精母細(xì)胞在1 h內(nèi)產(chǎn)生了染料嗜色性(伊紅或阿爾新藍(lán)),在2 h內(nèi),酸性磷酸酶和氨基肽酶反應(yīng)發(fā)生變化,出現(xiàn)染色質(zhì)丟失,并且30 h后僅有細(xì)胞質(zhì)殘留。在更嚴(yán)重的HS情況下(43 ℃,陰囊水浴加熱1 h),會導(dǎo)致睪丸中游離酸性磷酸酶和蛋白酶的含量顯著增加[33],加劇生殖細(xì)胞的DNA損傷。此外,在減數(shù)分裂過程中,HS還可引起性染色體的異常分離,導(dǎo)致不成對Y染色體的存在,從而引起精原細(xì)胞凋亡[34]。HS還可以影響子代的性別比例。研究發(fā)現(xiàn),在輕度、頻繁的HS模型條件下(連續(xù)5周,每周1次,39 ℃對小鼠陰囊水浴加熱30 min),攜帶Y染色體的精子數(shù)量顯著增加,導(dǎo)致子代性別比例改變[35]。許多DNA修復(fù)相關(guān)基因,如Ogg1(參與堿基切除修復(fù))、Xpg(參與核苷酸切除修復(fù))、Rad51和Rad54(參與雙鏈斷裂修復(fù)),在HS后受到抑制,最終抑制精母細(xì)胞復(fù)制和減數(shù)分裂,導(dǎo)致生殖損傷[28,36]。

2.2 睪丸體細(xì)胞

SCs和LCs主要功能分別為支持生殖細(xì)胞和產(chǎn)生睪酮(testosterone,T),為生殖細(xì)胞的發(fā)育提供適宜的環(huán)境。因此,它們功能的損傷可能會影響睪丸的生精功能。

2.2.1 支持細(xì)胞 SCs是高度特化的高柱狀細(xì)胞,是生精上皮的主要支持細(xì)胞,為生精細(xì)胞的發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和支持。SCs也是BTB的重要組成部分,當(dāng)相鄰的支持細(xì)胞相互接觸時,通過各種細(xì)胞連接,如緊密連接、基底質(zhì)外膜特化、橋粒和間隙連接形成BTB[2,28]。研究發(fā)現(xiàn),對大鼠陰囊進(jìn)行急性HS后(43 ℃,陰囊水浴加熱16 min),第1周時SCs核體積減少,第2周時SCs特異性基因Inha和Cld11以及主要由SCs表達(dá)的其他BTB基因Gja1、Tjp1和Cldn3的表達(dá)下調(diào)[37],表明BTB受到了HS的干擾。BTB對精子發(fā)生非常重要,睪丸HS不僅破壞SCs的功能和形態(tài)[38],還能引起可逆的SCs去分化和BTB超微結(jié)構(gòu)損傷,最終影響雄性生殖細(xì)胞的產(chǎn)生[27,39]。此外,HS還可以通過影響SCs的分泌功能與吞噬功能進(jìn)而影響睪丸的精子發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),睪丸HS后,SCs可通過旁分泌Fas誘導(dǎo)多余和受損的生殖細(xì)胞凋亡[40],進(jìn)而利用吞噬功能清除凋亡的生精細(xì)胞,確保睪丸生精微環(huán)境的穩(wěn)定[41]。Jin等[41]研究發(fā)現(xiàn),受到凋亡生殖細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α調(diào)節(jié)的LMCD1(LIM and cysteine rich domains 1)啟動子可通過NFAT1-Txina(nuclear factor of activated T cells 1/Txina)信號通路調(diào)控SCs的吞噬功能,并以STAT3蛋白依賴的方式被氧化應(yīng)激所抑制。睪丸HS后產(chǎn)生的高水平ROS通過誘導(dǎo)SCs中的STAT3蛋白酪氨酸磷酸化,抑制LMCD1的表達(dá),最終抑制SCs吞噬作用,破壞睪丸微環(huán)境內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),使睪丸生精功能受阻[41]。

2.2.2 間質(zhì)細(xì)胞 LCs位于生精小管的睪丸間質(zhì)部分,其主要功能為分泌T,受到下丘腦、垂體及其自身調(diào)節(jié)(圖2)[42-46]。研究發(fā)現(xiàn),HS后(43 ℃,陰囊水浴加熱30 min),小鼠睪丸LCs中合成雄激素原料的脂質(zhì)沉積顯著增加,LCs出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)不清,數(shù)量減少,巨噬細(xì)胞浸潤周圍區(qū)域的現(xiàn)象,其中睪酮陽性細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少[47]。表明HS對LCs的數(shù)目、形態(tài)、功能、T分泌等均產(chǎn)生了不利影響,HS可能通過破壞LCs最終導(dǎo)致雄性不育。此外,HS還顯著降低了類固醇合成酶和3β-HSD的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn),對大鼠陰囊熱處理(43 ℃,陰囊水浴加熱15 min)后,幾種關(guān)鍵的LCs特異性類固醇生成酶的基因表達(dá)下降(Cyp1la1、Hsd3b1和Hsd17b3),但大鼠血清和睪丸內(nèi)的T水平卻并未發(fā)生顯著變化[37],這可能與類固醇生成的其他代償性機(jī)制有關(guān)。而其他研究報告中HS引起血清T水平變化[47-48],可能與HS后LCs合成活性降低[47],以及類固醇生成蛋白StAR和P450c17的表達(dá)下降有關(guān)[49],致使類固醇生成受到抑制?？傊?HS可導(dǎo)致LCs發(fā)生顯著的功能變化以及類固醇生成基因表達(dá)減少,而類固醇生成的其他代償性機(jī)制可以在一定程度上維持機(jī)體內(nèi)T的正常水平,但還需要進(jìn)一步的研究。

3 熱應(yīng)激對精子質(zhì)量的影響

3.1 對精子的影響

研究發(fā)現(xiàn),在不同環(huán)境條件下飼養(yǎng)的任何品種的公牛都可能發(fā)生HS,季節(jié)的變化會對公牛的精子質(zhì)量產(chǎn)生影響。在輕度自然HS到中度自然HS情況下,精子DNA和精漿中的抗氧化劑會受到損傷,而重度自然HS則會導(dǎo)致精子的形態(tài)受到影響[1]。HS導(dǎo)致的精子受損,主要表現(xiàn)為質(zhì)膜受損與受精能力下降、DNA缺陷與畸形精子增加、線粒體受損與精子活力下降、精子凋亡與精子數(shù)量下降[12]以及對精子質(zhì)量的持續(xù)性影響。

3.1.1 質(zhì)膜受損與受精能力下降 精子質(zhì)膜在精子獲能、頂體反應(yīng),以及與卵細(xì)胞表面結(jié)合中起著不可或缺的作用。精子獲能是一種生理氧化應(yīng)激狀態(tài),是精子成熟受精的前提,涉及質(zhì)膜膽固醇的氧化排出、細(xì)胞內(nèi)cAMP和Ca2+濃度增加以及酪氨酸磷酸化[50]。正常情況下,精子產(chǎn)生的大量ROS,是精子通過酪氨酸磷酸化的氧化還原作用與cAMP/PKA的肌動蛋白聚合來獲能的主要途徑[51]。由于精子質(zhì)膜富含多不飽和脂酸,特別是二十二碳六烯酸和花生四烯酸,使其極易受到ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致精子DNA片段化,出現(xiàn)細(xì)胞核空泡化以及精子形態(tài)異常的現(xiàn)象[52-53]。而HS誘導(dǎo)的精子線粒體ROS釋放增加,會促使精子過度氧化應(yīng)激進(jìn)入“超獲能”狀態(tài),并增加獲能和頂體反應(yīng)精子的比例[54],過早獲能狀態(tài)會縮短精子壽命,降低卵子受精率和胚胎發(fā)育率。

圖2 下丘腦-垂體-睪丸軸控制人類睪丸功能[2, 42-46]Fig.2 The hypothalamic-pituitary-testicular axis controls human testicular function[2, 42-46]

3.1.2 DNA缺陷與畸形精子增加 施力光等[55]研究發(fā)現(xiàn),在海南夏季持續(xù)性的自然HS條件下,會顯著降低海南黑山羊種公羊精子密度,極顯著地降低精子活力,極顯著地增加精子的畸形率?；尉右蚱渫ǔ０橛芯覦NA缺陷,是導(dǎo)致雄性不育的主要原因之一。HS后許多DNA修復(fù)的相關(guān)基因會受到抑制,并且精子在形成過程中丟失了大量與DNA修復(fù)相關(guān)的酶[56]。盡管附睪中的精子在HS時含有的是正確裝配的DNA,但其DNA的完整性仍然受到了損害[32],致使HS引起的DNA損傷難以恢復(fù)。睪丸網(wǎng)和輸精管中的精子選擇性重吸收機(jī)制,可防止或減少受損精子在射精中出現(xiàn)的數(shù)量,但受損的DNA最終仍然會導(dǎo)致精液中畸形精子數(shù)量的增加[57]。

3.1.3 線粒體受損與精子活力下降 線粒體作為維持精子活力的關(guān)鍵細(xì)胞器,對精子超激活運(yùn)動、獲能、頂體反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡及受精等多種生理過程起到重要的調(diào)節(jié)作用。精子線粒體在呼吸作用的過程中形成的高線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)與適當(dāng)水平的ROS,對精子活力和受精率至關(guān)重要。Zhu等[58]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)精子在低水平葡萄糖培養(yǎng)基中孵育時,線粒體氧化磷酸化的效率增加,生成足夠的ATP,同時ROS水平顯著升高,導(dǎo)致精子前進(jìn)運(yùn)動性和直線運(yùn)動速度顯著降低,并且精子線粒體的基因表達(dá)系統(tǒng)mt-DNA、TFAM與POLRMT遭到破壞,ETC蛋白MT-ND1和MT-ND6損傷增加。此外,使用線粒體靶向抗氧化劑吡咯并喹啉醌二鈉鹽(pyrroloquinoline quinone disodium salt,PQQ)和輔酶Q10(Coenzyme Q10,CoQ10),可以顯著增加精子線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,降低精子線粒體ROS水平,減輕線粒體蛋白氧化應(yīng)激所造成的損傷,提高M(jìn)MP和ATP水平以及精子線性運(yùn)動能力[58]?？傊?HS誘導(dǎo)的過量ROS水平增加了精子線粒體蛋白損傷,影響ATP的產(chǎn)生,導(dǎo)致精子活力下降。

3.1.4 精子凋亡與精子數(shù)量下降 精子凋亡會引起精子數(shù)量下降,導(dǎo)致精液質(zhì)量變差[59-60],又因其具有較少的細(xì)胞質(zhì)體積,所以精子凋亡主要是通過線粒體途徑誘導(dǎo)而不是細(xì)胞質(zhì)途徑[60]。如圖1所示,通過Bcl-2蛋白家族或caspase 2可激活不可逆的精子凋亡過程,而Bcl-2可以通過抑制BAX在線粒體中積累,協(xié)同調(diào)控細(xì)胞凋亡。此外,抑制caspase 2可以阻斷MAPK14的表達(dá)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的合成,保護(hù)細(xì)胞免受HS或激素的影響[25]。

3.1.5 對精子質(zhì)量的持續(xù)性影響 哺乳動物的精子發(fā)生按節(jié)律進(jìn)行,各級生精細(xì)胞在曲細(xì)精管內(nèi)的排布具有顯著的時空特異性,根據(jù)不同類型生殖細(xì)胞的排布,這種時間和空間特異性分別稱為生精上皮周期和生精上皮波[61]。不同發(fā)育階段的睪丸生殖細(xì)胞對HS的敏感性不同,在睪丸HS后、生精上皮徹底恢復(fù)前均會對所采集的精液質(zhì)量產(chǎn)生不利影響,以及表現(xiàn)出對不同恢復(fù)階段的精子形態(tài)、功能損傷的影響不同。研究發(fā)現(xiàn),Angus公牛精子在HS終止后長達(dá)8周內(nèi)都不能恢復(fù)正常(試驗組公牛連續(xù)8 h整體熱暴露于(35±1)℃,然后連續(xù)16 h暴露于(31±1)℃;對照組整體熱暴露于(23±1)℃,HS處理后試驗組與對照組連續(xù)8周均整體熱暴露于(23±1)℃的溫度控制室中),表現(xiàn)出HS對精子質(zhì)量的持續(xù)性影響[62]。Garcia-Oliveros等[63]對Nellore公牛睪丸HS后發(fā)現(xiàn)(陰囊絕緣96 h):HS后0～7 d,精子主要表現(xiàn)為分離性頭部缺陷和MMP降低;HS后14～42 d,主要表現(xiàn)為異常精子增加,精子活力、質(zhì)膜完整性和MMP降低,出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化和DNA片段化的現(xiàn)象;HS后49～63 d,精子則主要表現(xiàn)為異常精子增加和MMP降低;直到HS后70～77 d,試驗組與對照組之間的精子特征恢復(fù)相似,生精上皮恢復(fù)。

3.2 對精漿蛋白的影響

精漿(seminal plasma,SP)作為精液的液體部分,主要由副性腺的分泌物和來自睪丸與附睪的少量液體組成,具有促進(jìn)精子成熟、為精子的代謝及運(yùn)動提供營養(yǎng)和保護(hù)性環(huán)境、調(diào)節(jié)和控制精子獲能狀態(tài)等作用[64-65]。雄性動物生育力的差異,可能是由于SP的組分發(fā)生變化及其對精子和受精雌性造成的影響不同。精漿蛋白(seminal plasma protein,SPP)作為SP中比重最大的物質(zhì),因其存在某些具有物種間特異性的特殊蛋白質(zhì),可以作為體外評估家養(yǎng)哺乳動物生育力的潛在標(biāo)記物[66]。這些特殊的蛋白標(biāo)記不僅可以在使用前就甄選出高生育力的公畜,還能作為添加劑減少精子體外低溫凍存所造成的損傷、提高人工授精后精子在雌性生殖道中的存活率[66-67]。

以公牛為例,許多研究已經(jīng)證實,公牛SP中與生育力有關(guān)的SPP標(biāo)記主要為BSPs蛋白家族(binder of sperm proteins,包括PDC-109、A3、BSP-30 ku,也分別稱為BSP1、BSP3和BSP 5[68])。作為公牛精子獲能的關(guān)鍵因素,BSPs蛋白家族由精囊分泌,約占牛SPP 50%～60%[69],可與精子質(zhì)膜的膽堿磷脂結(jié)合,其作用具有兩面性:一方面可以保護(hù)精子,避免質(zhì)膜的游離磷脂運(yùn)動,使精子成功運(yùn)輸至輸卵管;另一方面可以刺激精子質(zhì)膜的膽固醇和磷脂排出,并且能與獲能因子高密度脂蛋白(high-density lipoproteins,HDL)和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)結(jié)合,促進(jìn)獲能因子誘導(dǎo)精子獲能[70-71]。一般情況下,SP中低至中等水平的BSPs含量與精子生育力呈正相關(guān),而高水平的BSPs則導(dǎo)致負(fù)相關(guān)。公牛精子與其SPP成分都容易受到陰囊絕緣的影響,并且可以檢測到睪丸HS的SPP標(biāo)記[72]。睪丸HS后,SP中BSPs的異常增加[69],可能會促使精子進(jìn)入過早獲能的狀態(tài),縮短精子的壽命,導(dǎo)致精子質(zhì)量變差。對公羊陰囊絕緣8 d也觀察到了類似的精囊蛋白(BSPs蛋白類似物,包括BSP1、BSP 5)在HS后增加的現(xiàn)象,并且其在SP中的表達(dá)變化與精液參數(shù)的變化一致[73]。由于HS直接作用于陰囊而不直接影響精囊,HS可能是通過影響LCs的T合成,進(jìn)而影響副性腺的功能,導(dǎo)致BSPs分泌改變,最終影響精液參數(shù),但還需要進(jìn)一步的研究驗證。

由于家畜SPP種類繁多、功能復(fù)雜且存在種間特異性,例如豬SPP中的PSP-1和PSP-2可介導(dǎo)子宮內(nèi)免疫反應(yīng),并與豬精子的功能和生育力呈正相關(guān),而AQN-3和SPMI則與精子生育力呈負(fù)相關(guān)[74-75]、公牛SPP中的SPADH1(spermadhesin-1,精子黏附素-1,也被稱為酸性精液蛋白aSFP)和SPADH2(精子黏附素-Z13)與牛精子抗冷凍能力和冷凍精液生育力呈正相關(guān)[76]、公羊SPP中的ZAG含量與羊精子活力呈正相關(guān),可作為羊精子保存效果鑒別的陰性標(biāo)記[77]。目前對家畜SPP標(biāo)記與精子功能之間的聯(lián)系研究難點在于:如何對不同類型精液的SPP進(jìn)行有效的分離、純化、鑒別,并證實其對精子儲存、精子生育力等的影響。如果能提取出有利于精子冷凍儲存和生育力的SPP成分,或利用重組蛋白技術(shù)使其量產(chǎn),那么可將其作為一種天然的精液稀釋添加劑,用于補(bǔ)充夏季高溫時節(jié)精液品質(zhì)下降所導(dǎo)致的精液使用缺口,減少夏季高溫對畜牧業(yè)生產(chǎn)的不利影響。總之對于如何將SPP規(guī)?；a(chǎn)與應(yīng)用,還需要未來進(jìn)一步的研究解決。

4 熱應(yīng)激對精子的受精能力和支持胚胎發(fā)育的能力的影響

HS對雄性動物生育力的最直接影響體現(xiàn)在精子的受精能力和支持胚胎發(fā)育能力。前面已經(jīng)提到,HS會造成精子DNA損傷,而DNA損傷會進(jìn)一步抑制蛋白質(zhì)的合成并損害染色質(zhì),這兩者都與受精和胚胎發(fā)育不良有關(guān)[78]。由于常規(guī)精子質(zhì)量檢查不容易發(fā)現(xiàn)精子DNA損傷,即使精子表面正常,HS也會導(dǎo)致雄性動物的低生育力表現(xiàn)。Yaeram等[79]通過體外受精試驗發(fā)現(xiàn),HS后(小鼠整體熱暴露,36 ℃,24 h),精子穿透透明帶的速率和卵子受精率都發(fā)生了顯著降低,并且受精后出現(xiàn)胚胎發(fā)育遲緩以及胚胎死亡率增加的現(xiàn)象。盡管卵母細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制可以修復(fù)部分精子受損DNA片段,但是在大范圍的精子DNA損傷的情況下,這種修復(fù)能力的作用可能會弱化,最終導(dǎo)致胚胎死亡[80]。Pea等[81-82]研究發(fā)現(xiàn),引起母豬夏季季節(jié)性不孕現(xiàn)象及其所導(dǎo)致的相關(guān)生育力和胚胎存活率低的問題,可能與HS所誘導(dǎo)的公豬精子DNA損傷有關(guān)。公豬精子DNA損傷會引起對早期細(xì)胞譜系(如滋養(yǎng)外胚層)分化至關(guān)重要的關(guān)鍵發(fā)育基因的表達(dá)中斷,致使卵裂率降低和胚泡形成減少,延遲胚胎發(fā)育或出現(xiàn)早期胚胎死亡現(xiàn)象,導(dǎo)致胚胎著床失敗并最終流產(chǎn)[81-82]。綿羊的繁殖受到相對溫和的HS水平(≥32 ℃)的影響,短期和長期整體暴露于熱環(huán)境不僅會顯著損害母羊的生育能力和繁殖力,還降低了公羊的精液產(chǎn)量和質(zhì)量。在HS后的14～50 d進(jìn)行交配,公羊的生育能力(以受精率和胚胎存活率衡量)出現(xiàn)降低,并且母羊與HS公羊交配,母羊的生育力也會受到影響[83]。這些缺陷反映HS可能是通過損傷精子DNA的完整性,進(jìn)而影響雄性動物的生育能力。

5 結(jié)語與展望

作為雄性動物產(chǎn)生精子和分泌雄激素的重要器官,睪丸的溫度調(diào)節(jié)對其正常生育能力的維持至關(guān)重要。HS誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、精子DNA損傷等一系列不良反應(yīng),抑制了精子發(fā)生并對LCs和SCs產(chǎn)生不利影響,進(jìn)而影響精子質(zhì)量以及精子的受精能力和支持胚胎發(fā)育的能力,最終導(dǎo)致雄性動物生育力下降。

因此在實際生產(chǎn)中,除了可以通過環(huán)境控制預(yù)防公畜HS外,還可根據(jù)睪丸HS的分子機(jī)制,針對性地制定有助于治療雄性不育或亞不育的方法,降低HS對公畜生育力的不利影響。對于已經(jīng)遭受熱損傷的公畜,可根據(jù)HS后精子的恢復(fù)周期調(diào)整生產(chǎn)安排,或通過相應(yīng)的藥物干預(yù),使公畜在夏季也能保持較好的生產(chǎn)力。SPP作為體外評估家畜生育力的潛在標(biāo)記物,不僅可以在用前甄選高生育力公畜,還具有開發(fā)為精液稀釋添加劑的潛能,但由于家畜SPP種類、功能繁多且存在種間特異性,目前還難以對其進(jìn)行有效的開發(fā)和利用,因此家畜SPP的相關(guān)研究具有廣闊的科研前景。