不同方法提取的多傘阿魏揮發(fā)油化學成分及其體外抗胃癌活性比較

盛 萍，王 颯，苗莉娟，姚 藍，2，劉麗萍

(1.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊 830011)

多傘阿魏 Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.是新疆維吾爾族人民常用的重要藥材，為傘形科阿魏屬植物，僅分布于新疆古爾班通古特沙漠南緣地區(qū)的沙丘、沙地和礫石質的蒿屬荒漠中，藥用部位為根和油膠樹脂［1］。其揮發(fā)性成分在臨床上用于治療心腹冷痛、慢性腸胃炎、胃潰瘍、風濕性關節(jié)炎等疾?。?］。目前對多傘阿魏揮發(fā)油化學成分的研究雖有報道［3-5］，但這些報道的揮發(fā)油提取方法多見水蒸氣蒸餾法。目前關于多傘阿魏揮發(fā)油對腫瘤細胞的作用研究鮮有報道，為了探究不同提取方法制備的揮發(fā)油在化學成分和抑制胃癌細胞SGC-7901生長方面的差異，本實驗分別采用水蒸氣蒸餾法、溶劑回流提取法、超聲提取法、微波萃取法、微波-超聲協助萃取法、滲漉提取法和超臨界CO2萃取法7種方法對多傘阿魏根揮發(fā)性成分進行提取，并對其化學成分及抑制胃癌細胞SGC-7901活性進行了比較，分析其具有抑制胃癌細胞活性的主要化學成分，旨在為今后繼續(xù)深入開展這一傳統(tǒng)維吾爾藥材多傘阿魏的研究和開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 氣相-質譜聯用儀Perkin—Elemer Autosystem XL—Turbemass(PE-5MS毛細管柱:60 m×0.25 mm×0.25μm);AL204型稱量天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);DRT-SX智能恒溫電熱套;SFE121—50—01型超臨界CO2萃取裝置(南通華興石油儀器有限公司);KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);WBFY—205型微波儀(鞏義市予華儀器有限公司);CW—200型超聲微波協同萃取儀(上海新拓微波溶樣測試技術有限公司);酶聯免疫檢測儀Model 680，B io—RAD。

多傘阿魏根樣品于2011年5月采自新疆沙灣縣，經鑒定為傘形科植物多傘阿魏Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.的干燥根。所有試驗樣品陰干，粉碎過10目篩，密封備用。人胃癌細胞株SGC-7901(武漢博士德生物技術有限公司);胰蛋白酶(Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);氟尿嘧啶5-FU(上海浩然生物技術有限公司);乙醚、無水硫酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純。

1.2 多傘阿魏揮發(fā)油的制備

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取法［6］取多傘阿魏根樣品50 g，按《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法項下甲法進行，讀取刻度，收集多傘阿魏揮發(fā)油，加無水硫酸鈉適量脫水，儲存于冰箱備用。

1.2.2 溶劑回流提取法 取多傘阿魏根樣品50 g于圓底燒瓶中，加入150 mL乙醚，40℃水浴回流1 h，用40 mL乙醚洗滌殘渣，收集濾液，減壓回收溶劑，無水硫酸鈉干燥，得黃褐色半固體物質，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.2.3 超聲提取法 取多傘阿魏根樣品50 g于錐形瓶中，加入150 mL乙醚超聲(超聲頻率為400 kHz，功率為180 W)30 min，用40 mL乙醚洗滌殘渣，收集濾液，減壓回收溶劑，無水硫酸鈉干燥，得黃褐色半固體物質，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.2.4 微波萃取法 取多傘阿魏根樣品50 g于特制微波器皿中，加入150 mL乙醚，微波萃取200 s，用40 mL乙醚洗滌殘渣，收集濾液，減壓回收溶劑，無水硫酸鈉干燥，得黃褐色半固體物質，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.2.5 超聲協助萃取法 取多傘阿魏根樣品50 g于特制器皿中，加入150 mL乙醚，微波萃取200 s，用40 mL乙醚洗滌殘渣，收集濾液，減壓回收溶劑，無水硫酸鈉干燥，得黃褐色半固體物質，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.2.6 滲漉提取法 取多傘阿魏根樣品50 g于滲漉器中，加適量的50%乙醇浸泡48 h后，再加乙醇至滲漉液無色。將滲漉液分別用20 mL乙醚萃取3次，合并萃取液，減壓回收溶劑，得黃褐色半固體物質，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.2.7 超臨界CO2流體萃取(SFE-CO2) 取多傘阿魏根樣品50 g用超臨界流體CO2動態(tài)萃取2 h。設定萃取釜的溫度為40℃、萃取壓力16 MPa，分離釜Ⅰ的溫度40℃、壓力10 MPa，分離釜Ⅱ的溫度45℃、壓力5.4 MPa，CO2流量65 L/h，連續(xù)萃取2 h，得黃褐色濃稠物，24 h稱定質量后，儲存于冰箱中備用。

1.3 揮發(fā)油成分分析條件 將7種方法提取的揮發(fā)油均用以下條件進行GC-MS-計算機聯用分析。

1.3.1 GC條件 毛細管PE-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25μm)，載氣為高純度氦氣(體積分數為99.999%)。色譜柱初始溫度60℃，保持5 min，然后以2℃/min程序升溫至180℃，再以4℃/min程序升溫至260℃，保持20 min。進樣口溫度為280℃，分流比為50∶1，氦氣流量為15 psi(1 psi=6.895 kPa);載氣為高純度氦氣(體積分數為99.999%)。

1.3.2 MS條件 離子源200℃;傳輸線200℃;掃描范圍35～550 amμ;功率70 ev;EI電離方式;270 V光電倍增;進樣量0.8μL。

1.4 細胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細胞常規(guī)培養(yǎng)于含1‰青霉素、20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2孵箱內貼壁生長，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.5 MTT法檢測多傘阿魏揮發(fā)油對SGC-7901細胞增殖的抑制作用［7-10］用0.25%胰蛋白酶消化SGC-7901細胞，用完全培養(yǎng)基配單細胞懸液，以每孔0.4×104個接種于96孔板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁并進入對數生長期后饑餓細胞4 h，進行干預。分3組:陰性對照組(100μL RPMI 1640+0.1%DMSO);陽性對照組(5-FU終質量濃度分別為1、10、100、1000μg/mL);供試樣品處理組(供試樣品終質量濃度分別為1、10、100、1000μg/mL)。其中，每組設5個復孔，于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后中止實驗，取出96孔板，每孔加入10μL MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清，每孔加入100μL Formanzan，置搖床上低速振蕩10～30 min，使結晶充分溶解。以上試驗重復3次。在酶聯免疫檢測儀570 nm處測定吸光度(A)值，按下式求出生長抑制率(IR)，并求出半數抑制濃度(IC50)。

細胞生長抑制率%(IR)=(1-用藥組平均A值/陰性對照組平均A值)×l00%。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取揮發(fā)油外觀性質比較 由表1可知，水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油為無色或淡黃色清亮透明液體，香味濃郁，其他6種方法提取的揮發(fā)油多為黃褐色稠膏狀物，香味不是很明顯，故在外觀性狀上水蒸氣蒸餾提取法優(yōu)于其他6種提取方法。但水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油的收率為1.60%。遠低于其他6種方法提取的揮發(fā)油的收率。

表1 不同提取方法多傘阿魏萃取物的性質Tab.1 Characters of volatile oils extracted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

2.2 不同方法提取揮發(fā)油化學成分分析 將7種方法制備的揮發(fā)油進行GC-MS分析，通過檢索N IST98質譜圖庫并結合質譜裂解規(guī)律進行解析。將總離子流色譜圖中的峰面積進行歸一化處理，求得各化學成分的相對質量分數。揮發(fā)油的化學成分及其相對質量分數見表2，總離子流圖見圖1。

從表2可知，從7種不同方法制備的多傘阿魏揮發(fā)油中分別鑒定出 41、30、28、30、36、31、31個化合物，共鑒定了74個化合物，占揮發(fā)油總量的 100%、98.48%、98.24%、100%、100%、98.35%、98.77%;其中均以小分子單萜烯類化合物、倍半萜烯類化合物及其含氧衍生物及脂肪族、芳香族、酯、醇類化合物組成。另外水蒸氣蒸餾法和微波萃取提取的多傘阿魏揮發(fā)油樣品還含有少量苯類化合物。7種提取方法均檢出含有量較高的愈創(chuàng)木醇成分。水蒸氣蒸餾法提取的成分不同于其他6種方法的化合物有30個，但含有量較大的主要有:δ-3-蒈烯、α-異松油烯、3，3-三甲基-雙環(huán)［2.2.1］庚-2醇乙酸酯等成分。微波萃取的成分不同于其他6種方法的化合物有4個。除水蒸氣蒸餾法外，其他6種方法提取的共有成分有11個，含有量較大的主要有:1，1-二甲基-2，4-二(1-丙烯基)環(huán)己烷、乙酸小茴香酯等化合物。

2.3 不同方法提取揮發(fā)油抑制胃癌細胞SGC-7901活性比較 不同方法提取的揮發(fā)油在不同質量濃度下對胃癌細胞SGC-7901的抑制率見表3。

從表3可知，7種提取方法中，只有水蒸氣蒸餾法和微波萃取法制備的多傘阿魏揮發(fā)油在1～1000μg/mL的質量濃度范圍內，對胃癌細胞SGC-7901細胞的生長具有明顯的抑制作用，與對照組比較差異顯著，且隨著藥物質量濃度增加，細胞抑制率越高，呈現顯著的濃度依賴性。水蒸氣蒸餾法和微波萃取法制備的多傘阿魏揮發(fā)油作用24 h的IC50分別是 23.18、16.48μg/mL。其余溶劑提取法、超聲波提取法、微波－超聲協同萃取法和滲漉提取法制備的多傘阿魏提取物在100～1000μg/mL的質量濃度范圍內，對胃癌細胞SGC-7901細胞的生長也具有明顯的抑制作用，但隨著藥物質量濃度增加，并不呈現顯著的濃度依賴性。超臨界二氧化碳萃取物對胃癌細胞SGC-7901細胞的生長沒有抑制效果。

表2 不同方法提取多傘阿魏揮發(fā)油化學成分及其相對質量分數Tab.2 Chemical components and its relative mass fraction of volatile oils exacted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

續(xù)表2

3 討論

3.1 中藥揮發(fā)油的化學成分一般隨產地、采收季節(jié)、品種、加工方法的不同相差較大［11-15］，即使在相同實驗條件下提取不同的多傘阿魏樣品，所得揮發(fā)油樣品的量和理化性質也相差較大。故本實驗曾對升溫程序進行了篩選，對GC-MS分析色譜條件的精密度、穩(wěn)定性、重復性進行了方法學考察，同時選樣時嚴格固定樣品的產地、采收季節(jié)和加工方法，最終確定目前建立的方法是穩(wěn)定、良好的。

圖1 不同方法提取多傘阿魏揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 TIC of the volatile oil extracted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

表3 7種方法提取的揮發(fā)油不同質量濃度時對胃癌細胞SGC-7901的抑制率(100%)(n=5)Tab.3 Inhibition rates of volatile oils at different mass concentrations to the SGC-7901 stomach cancer cells(n=5)

3.2 目前國內有關多傘阿魏揮發(fā)油成分的報道有文獻 ［3-5］，在文獻 ［3］中分離了40個化合物，鑒定了17個化合物，主要由單萜、倍半萜組成。與本實驗相似的是愈創(chuàng)木醇成分含有量最高，但化合物α-麝子油烯、β-麝子油烯及α-麝子油烯乙酸酯在本實驗中未檢測到;在文獻 ［4］中作者分別從超臨界二氧化碳萃取法、二氯甲烷溶劑提取法、水蒸氣蒸餾提取法分離了29、10、21個化合物，鑒定了18、8、17個化合物，3種方法均檢測到愈創(chuàng)木醇和橙花叔醇成分;在文獻 ［5］中共分出了62個峰，鑒定了34個化合物，其中，愈創(chuàng)木醇量依然很高。揮發(fā)油成分主要由單萜、倍半萜、聚硫烷類、其他類組成。比較上述3篇文獻，本次實驗從7種不同方法制備的多傘阿魏揮發(fā)油中共鑒定了74個化合物，7種提取方法均檢出含有量較高的愈創(chuàng)木醇成分。本次實驗中許多單萜類化合物，如月桂烯、香檜烯、水芹烯、異松油烯等均為首次分離鑒定，金合歡醇、姜黃烯、石竹烯、蛇床戲、香檸檬烯、喇叭烯、古蕓烯等許多倍半萜烯類化合物也是首次分離鑒定。

3.3 比較7種不同制備方法所得揮發(fā)油的化學成分，水蒸氣蒸餾法提取的多傘阿魏揮發(fā)油中化學成分的結構類型最為豐富，不同于其他6種方法檢測到的化合物有30個，并且以小分子單萜類化合物為主，同時含有少量苯類化合物。雖然得率較低，但是所得揮發(fā)油多為無色或淡黃色透明狀液體，比較純凈，香氣濃郁，分離提取也比較方便。其他6種方法中提取的多傘阿魏揮發(fā)油組分，以長鏈脂肪族類化合物為主，均包括單萜烯類化合物、倍半萜烯類化合物及其含氧衍生物和其他類化合物(包括脂肪族、醇、酯類化合物)，微波提取法中尚含有少量苯類化合物。同時回收率均較高，為黃褐色稠膏狀物，香味不是很明顯，故在外觀性狀上水蒸氣蒸餾提取法優(yōu)于其他6種提取方法。因此，如果想盡可能多的得到某個藥材成分的信息量，應該盡可能多的采取較多不同的提取方法。

3.4 本實驗結果表明，水蒸氣蒸餾法和微波萃取法制備的多傘阿魏揮發(fā)油對胃癌細胞SGC-7901的生長有很強的抑制作用，且隨著藥物質量濃度上升，細胞抑制率越高，呈現顯著的濃度依賴性，兩種制備方法均具有小分子單萜類化合物和部分苯類化合物可能是多傘阿魏揮發(fā)油抑制胃癌細胞SGC-7901的主要原因。多傘阿魏在新疆地區(qū)的資源豐富、民間應用廣泛。本研究的結果為進一步開拓多傘阿魏臨床應用范圍，開發(fā)這一傳統(tǒng)維吾爾藥材提供了重要理論基礎和實驗依據，增強了我們進一步研究其抗胃癌細胞活性的信心。目前，對多傘阿魏提取物抗胃癌細胞有效成分和作用機制的研究工作正在進行中。

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